（贵阳市护理职业学院 贵州 贵阳 550081）
【摘要】 目的：研究与分析胰腺癌Syk基因启动子区?5’CpG岛甲基化改变的临床特点，并探讨其与临床特征间关系。方法：选取64例癌旁正常胰腺组织与64例胰腺癌组织进行研究，并采用甲基化特异性PCR(MSP)法对Syk基因启动子甲基化情况进行检测。结果：经检测后，64例癌旁正常胰腺组织中未检测到Syk基因启动子甲基化；而胰腺癌组织中，Syk基因启动子甲基化率为43.75%(28/64)；2者比较(P<0.05)。淋巴结转移胰腺癌组织Syk基因启动子甲基化率为66.67%(20/30)明显高于未产生淋巴结转移者23.53%(8/34)，2者比较(P<0.05)。然Syk基因启动子甲基化与患者肿瘤大小和组织分化程度及肿瘤位置无关(P>0.05)。结论：Syk基因失活的原因为Syk基因启动子甲基化，同时Syk基因启动子甲基化可能会导致胰腺癌发生及发展。因此，临床可通过检测Syk基因启动子甲基化来判断患者病情和预后，为临床诊断及预防及治疗提供重要参考价值。
【关键词】Syk基因；甲基化；胰腺癌
【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）08-0093-03
临床上，胰腺癌发展是一个复杂且多阶段的过程，其中包括癌基因激活与抑癌基因变异及缺失等。目前研究胰腺癌时，基因变异则对肿瘤生成及转移较为关注。酪氨酸激酶在胰腺癌信号传导途径中起着十分关键性的作用。经相关研究表明[1]，胰腺癌抑癌基因酪氨酸激酶Syk的表达缺失与胰腺癌转移存在十分紧密联系。但对于其发生缺失的原因尚未清楚。抑癌基因表达缺失发生的主要原因为抑癌基因启动区CpG岛甲基化。本次研究为研究与分析胰腺癌Syk基因启动子区?5’CpG岛甲基化改变的临床特点，并探讨其与临床特征间关系。特选取癌旁正常胰腺组织与胰腺癌组织进行研究，并采用甲基化特异性PCR法检测胰腺癌组织中Syk启动子甲基化情况，并进行比较与分析，报道如下。
1.资料与方法
1.1 一般资料
选取本院2012年7月～2014年10月期间经手术切除的64例癌旁正常胰腺组织与64例胰腺癌组织进行研究。正常胰腺标本取自瘤体及距离瘤体5.0cm外。本次研究标本均为手术切除或门诊活检所得新鲜标本。且所有组织均经病理学检查证实，研究方案经医院伦理委员会批准，患者自愿参与研究且签署知情同意书。术前未采用任何方式对患者进行治疗，患者术后资料完整，精神正常，可配合进行研究。胰腺癌组织中，分化程度：低分化38例、高分化26例；淋巴结转移者为30例、无淋巴结转移者为34例；肿瘤部位：胰头48例、胰体尾16例；年龄27～68岁，平均为(46.5±1.0)岁。正常胰腺组织：年龄25～65岁，平均为(44.0±1.0)岁
1.2 方法
本次研究的新鲜组织在离体后立即放入液氮速冻，并转入到-70℃冰箱中保存备用。试剂：DNA纯化试剂盒(Promega公司)、氢酯和亚硫酸氢钠均购自SIGMA公司。DNA提取：选取新鲜组织100mg于液氮中碾碎，并采用蛋白酶K消化和苯酚-氯仿法进行抽取，同时采用乙醇沉淀法提取组织中DNA，最后采用TE缓冲液进行稀释、溶解，再采用紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，并放置于-20℃冰箱中保存以备用[2]。DNA的亚硫酸氢盐修饰：取2ugDNA放置于EP管中，然后加入双蒸水进行稀释到50ul，并加入5.5ul新鲜配制的3.0mmol/L氢氧化钠溶液，并摇匀，放置于37℃水浴中恒温12min，再加入10mmol/L对苯二酚30ul、3.6mol/L亚硫酸钠520ul，避光并混匀，待混匀后通过纯化柱[3]。使用W izard DNA纯化回收系统提纯DNA，加5.5ul新鲜配制的3mmol/L氢氧化钠溶液，于37℃水浴中恒温12min，再加入5mmol/L醋酸铵41ul，再使用无水乙醇沉淀DNA，并加入20ul双蒸水进行溶解，并放置于-20℃冰箱中保存以备用[4]。甲基化特异性引物包含9个CpG岛，上游引物为5’-CGATTTCGCGGGTTTCGTTC-3’，下游引物为5’-AAAACGAACGCAACGCGAAAC-3’，扩增片段为243bp。非甲基化特异性引物包含8个CpG岛，上游引特为5’-ATTTTGTGGGTTTTGTTTGGTG-3’，下游引物为5’-ACTTCCTTAACACACCCAAAC-3’，扩增片段为140bp[5]。MSP反应：PCR反应体系(25ul)：10×PCR buffer 25.0ul 2.5mmol/LdNTP混合物4.0ulMgCL2、4.0ulTaq酶0.2ul。引物分别为1ul，模板DNA2ul；去离子水补齐到25ul。反应条件：95℃环境下预变性9min，95℃变性30s，退火[APC(M)：55℃、APC(U)：62℃]1min，72℃延伸30s，循环37次。72℃延伸5min，产物4℃保存。取10ul PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并采用凝胶成像分析仪来采集图像。
1.3 结果判断
甲基化引物扩增出现条带，则判定为甲基化阳性；非甲基化引物扩增出现条带，而甲基化未扩增出条带，则判定为甲基化阴性。甲基化与非甲基化引物均扩增出现条带，则判定为部分甲基化。
1.4 统计学方法
数据采用SPSS20.0软件统计与分析，计数资料采用(例,%)表示，采用卡方检验。结果以P<0.05表示具有统计学意义。
2.结果
经检测后，64例癌旁正常胰腺组织中未检测到Syk基因启动子甲基化；而胰腺癌组织中，Syk基因启动子甲基化率为43.75%(28/64)；2者比较(X2=6.74，P<0.05)，见图1。淋巴结转移胰腺癌组织Syk基因启动子甲基化率为66.67%(20/30)明显高于未产生淋巴结转移者23.53%(8/34)，2者比较(P<0.05)。然Syk基因启动子甲基化与患者肿瘤大小和组织分化程度及肿瘤位置无关(P>0.05)。见表1。
Syk广泛于造血细胞上表达，且常被用于信号传导过程中影响因子。在前后串排及多个自体磷酸化部位含有两个Src同源序列SH2。而Syk可通过SH2区域与依赖酪氨酸的免疫受体活化基序结全而活化，并且其在淋巴细胞发展及免疫细胞活化过程中起着十分关键性的作用。但免疫细胞失活则会使得机体失去对变异细胞的监测功能及杀灭作用，进而会导致肿瘤发生，所以Syk可能与肿瘤发生发展有一定关系。经相关研究发现，Syk在人体乳房上皮细胞上有表达，然其在浸润性乳癌中无表达；因此而说明Syk缺失可能与乳腺癌发生有关，同时还可能与浸润及转移存在一定联系；此外，转染Syk的细胞可降低肿瘤发生率，因此而说明Syk具有抑制癌细胞发生及转移的效果。目前，大多学者认为甲基化是肿瘤抑制基因失活的主要因素。据研究发现，大约有50%人类基因在5’端启动子调节序列中存在CpG核酸(CpG岛)，且大多数基因CpG岛无甲基化，然在肿瘤发生及发展过程中则可观察到这些部位存在甲基化，这可能是异常甲基化使得基因表达发生异常调节，最终导致癌症发生。DNA甲基化是最早所发现的基因转录前调控途径之一。然在真核生物基因组中，大约有80%CpG位点被甲基化，且这些甲基化主要发生于基因启动子区域的CpG岛。经相关研究表明，DNA甲基化可导致染色质结构和DNA构象及DNA稳定性、DNA与蛋白质相互作用方式发生变化，自身或结合甲基结合蛋白后，其将阻遏转录因子与启动子的结合，最终可有效调控基因表达，同时其也是表观遗传学修饰最重要的基因转录前调控方式。抑癌基因的启动子甲基化与某些肿瘤的临床分期与病理类型存在紧密联系，同时其也成为肿瘤分子诊断及预后判断的重要生物标志物。基因启动子甲基化作为基因水平的标志物，其具有极高特异性和灵敏度。近年来，随着临床医学的不断深入研究，逐渐认识到DNA甲基化异常对基因调控及表型传递起到十分重要的作用。
在人体胰腺中，甲基化异常情况已被观察到，主要包括完全甲基化和DNA甲基化转移酶活性增强及CpG岛局部DNA甲基化。在肿瘤组织中，其肿瘤抑制基因和不匹配修复基因及其它如雌激素受体等都被CpG岛甲基化阻遏。因此，在肿瘤生成过程中，抑制这些基因转录水平可为克隆选择提供肿瘤发生机制。本次研究发现，经检测后，64例癌旁正常胰腺组织中未检测到Syk基因启动子甲基化；而胰腺癌组织中，Syk基因启动子甲基化率为43.75%(28/64)；2者比较(P<0.05)。淋巴结转移胰腺癌组织Syk基因启动子甲基化率为66.67%(20/30)明显高于未产生淋巴结转移者23.53%(8/34)，2者比较(P<0.05)。然Syk基因启动子甲基化与患者肿瘤大小和组织分化程度及肿瘤位置无关(P>0.05)。说明Syk基因启动子区?5’CpG岛甲基化可能参与了胰腺癌的发生，同时其可能与胰腺癌恶性进展存在紧密联系。其通过增强胰腺癌细胞侵袭力，进而增加患者胰腺癌转移率，为临床检测胰腺癌淋巴转移的重要生物学指标，但其是否可有效预示较差的临床预后，还需进一步研究与观察。虽多种基因DNA甲基化与肿瘤发生存在较为紧密联系，但肿瘤发生是一种多因素和多阶段的复杂过程，DNA甲基化与其他致癌因素协同促进肿瘤的发生尚不清楚，DNA 异常甲基化在肿瘤发生中涉及的多种蛋白因子如何相互作用及具体机理，尚待进一步研究。
综上所述，Syk基因启动子区?5’CpG岛甲基化是肿瘤发生过程中早期事件，因此临床筛查Syk基因启动子区?5’CpG岛甲基化状态对胰腺癌早期诊断具有重要意义，进而可有效判断患者预后，提高患者生存质量。
【参考文献】
[1]程蕾,凌志强,毛伟敏.食管癌组织APC基因启动子区5-′CpG岛甲基化模型的研究[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(3):200-204.
[2]范琳峰,雷长江,刘忠考,等.胰腺癌细胞株Runx3基因启动子区CpG岛甲基化的检测[J].广东医学院学报,2011,29(3):248-250.
[3]宋君君,李颖,杨泽松,等.慢性粒细胞白血病骨髓细胞的SFRP2基因启动子高甲基化[J].第三军医大学学报,2011,33(24):2583-2586.
[4]吴开福,徐培坤,朱立新,等.脑胶质瘤中ppENK基因启动子区的甲基化状态研究[J].国际神经病学神经外科学杂志,2011,38(6):520-524.
[5]张信花,潘旋.肝细胞癌中FHIT基因启动子甲基化状态分析及其与临床病理特征之间的关系研究[J].现代生物医学进展,2010,10(2):290-294.
论文作者:王燕燕
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第8期供稿
论文发表时间:2015/7/2
标签：基因论文; 甲基化论文; 肿瘤论文; 子区论文; 胰腺癌论文; 组织论文; 引物论文; 《医药前沿》2015年第8期供稿论文;