黑龙江省中医药科学院
摘要：目的：本课题通过建立系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）大鼠模型，初步探讨养阴止血方的作用机理。方法：将50只 Wistar 大鼠。随机分为空白对照组、模型对照组、血尿安胶囊阳性药对照组、养阴止血方低、高剂量组复制大鼠 MsPGN 模型，光镜下观察肾脏组织形态学改变，用免疫组化法检测肾脏组织中 NF-κB 的表达水平。结果：模型对照组的肾小球系膜细胞及基质弥漫增生，血尿安胶囊对照组及养阴止血方各治疗组肾小球系膜可见局灶、节段系膜细胞增生；模型对照组NF-κB 阳性表达明显增强；血尿安胶囊对照组、养阴止血方高、低治疗组阳性表达明显减弱。结论：养阴止血方能改善模型大鼠肾脏组织病理损害，能够抑制模型大鼠 NF-κB的表达。
系膜增生性肾小球肾炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）以系膜细胞（GMC）增生和细胞外基质（ECM）积聚为主要病理改变，在此基础上激活一系列细胞因子和炎症介质参与致病。近来研究表明其发生机理可能与肾脏细胞凋亡率下降有关[1]。氧化应激和核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号活化与多种肾脏疾病的发生发展密切相关，尤其是在系膜细胞增殖有关的肾脏疾病中发挥重要的作用[2，3]。有实验表明，NF一KB可调控体内外肾小球系膜细胞的增生及其分泌的多种细胞炎症因子。临床上我们应用养阴止血方治疗系膜增生性肾小球肾炎血尿为主，为探讨其作用机制，进行如下研究：
1. 实验材料
1.1 实验动物
清洁级雄性健康4～6周的 wistar 大鼠50只，体重在150～200g 之间，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司（SCXK（吉）-2011-0004）。适应性饲养1周后，查尿红细胞和尿检蛋白都为阴性。随机分为5组，分别为空白对照组、模型对照组、养阴止血方低、高剂量组、血尿安胶囊对照组，每组10只；用苦味酸分别染色标记各只大鼠。
给药方法：自正式实验的第一天起经口灌服牛血清白蛋白（BSA）400mg/kg（4ml/kg）隔日一次，用蒸馏水配制 BSA，灌胃直至第8周；于实验第1天经皮下分点注射完全弗氏佐剂0.2ml（含BSA 2mg），第8天经皮下分点注射不完全弗氏佐剂0.2ml（含 BSA2mg）。于实验第8天和第15天，分别从尾静脉注射 SEB 0.4mg/kg 体重（配成无菌生理盐水溶液）各1次。
空白对照组经口灌服蒸馏水，每日一次，每次2ml/100g，持续14周。模型对照组均于第9周后开始蒸馏水每日灌胃，每次2ml/100g，至实验结束。养阴止血方高剂量组按0.676 g·kg-1·d-1，养阴止血方低剂量组0.17g·kg-1·d-1，血尿安胶囊组按0.042g·kg-1·d-1于造模第9周出现蛋白尿时开始给药，至实验结束。
1.2实验药物：
1.2.1养阴止血方，由生地、赤芍、玄参、麦冬、丹皮、连翘、板蓝根、白茅根、茜草、藕节、海螵蛸等组成。由黑龙江省中医药科学院制剂室配制，分别浓煎成0.85g/ml，1.69 g/ml，338g/ml.
1.2.2对照药物：血尿安胶囊，由肾茶、白茅根、黄柏、小蓟组成。生产企业：云南理想药业有限公司；批准文号：国药准字 Z20026104。配制成0.21g/ml水溶液。
2.实验指标检测
2.3.1 分别于实验第8，14周各检测1次尿沉渣红细胞计数。
2.3.2于实验第14周末采血后断颈处死大鼠，剖取双肾，在冰板上将肾纵向切开成4等份，一份切取皮质部分装入冰存管内，放入液氮罐中，备用；两份立即投入4%多聚甲醛（1/1000DEPC）固定2小时，梯度酒精脱水（50%～100%），二甲苯透明，石蜡包埋，石蜡切片厚度3μm，裱于用防脱片剂处理过的载玻片上，而后置60℃恒温箱中烤片，24h 后置4℃冰箱保存，以备免疫组化检测；余下一份肾，也切取皮质部分，放入甲醛中以备光镜检测。将大鼠血3000rpm/min 离心，取血清分装，﹣20℃保存。
2.3.3免疫组织化学染色方法检测NF-κB 免疫组化定量分析光镜下观察，每张图片随机选取5个视野，利用免疫组化定量分析软件 Image-ProPlus 6.0进行灰度值测定，结果用灰度值表示其表达强度，灰度值越高表达越低。
3.统计学处理
实验结果采用 SPSS 18.0 for Windows 统计软件进行统计分析。计量资料用（均数±标准差）表示；多组间比较用单因素方差分析的LSD 法进行多重比较；以 p＜0.05为具有统计学意义。
4.实验结果：
4.1肾脏病理改变
4.1.1 肾脏外观形态观测
正常组肾脏形态规整，如蚕豆样，红褐色，有光泽。纵切开，可见皮髓质分界清楚，髓质淡红，皮质红褐色，肾包膜结合紧密不易剥离。其余各组肾脏体积增大，暗红色，有少量灰白小点散布在肾脏表面，纵切面皮髓质分界较正常欠清，髓质色浅淡，尤以模型组明显，肾包膜可剥离。
4.1.2 肾脏组织 HE 染色光镜观测结果（病理图片见：图5-10）光镜下正常空白对照组肾小球形态均称一致，形状如常，毛细血管球及肾小囊结构清晰未见异常，无系膜基质与系膜细胞增生；肾间质无炎症细胞浸润，无水肿；肾小管上皮细胞无坏死变性等病理改变。模型对照组肾小球系膜细胞及基质弥漫增生，肾间质可见炎细胞浸润，肾小管上皮细胞空泡及颗粒样变性，提示造模成功。血尿安胶囊阳性药对照组及养阴止血方各治疗组：病理损害较模型组轻，肾小球系膜可见局灶、节段系膜细胞增生，肾间质未见炎细胞浸润，肾小管可见轻度空泡及颗粒样变性。
4.2MsPGN 大鼠肾脏组织中 NF-κB 的表达
4.2.1 MsPGN 大鼠肾脏组织中 NF-κB 的表达（病理图片见：图1-图5）
实验结果表明，NF-κB 阳性反应物为棕黄色颗粒。其在空白对照组大鼠肾组织中，呈弥漫性散布，染色较浅，为弱阳性，较均称一致。模型对照组切片中 NF-κB 阳性表达显著，阳性颗粒现于肾小球系膜区及肾小管上皮细胞，呈深棕色。与空白对照组相比，各组大鼠肾组织中 NF-κB 表达均明显增高；与模型对照组相比，养阴止血方各治疗组及血尿安胶囊阳性药对照组大鼠肾组织中 NF-κB 表达均明显降低，但血尿安胶囊阳性药对照组和养阴止血方各治疗组相比大鼠肾组织中 NF-κB 表达无明显差异。
4.2.2MsPGN 大鼠肾组织中 NF-κB表达定量
血尿安胶囊对照组、模型对照组、养阴止血方低、高剂量组与空白对照组 NF-κB定量比较差异显著（p<0.05）。养阴止血方低、高剂量组与血尿安胶囊对照组 NF-κB定量比较差异显著（p<0.05）
肾脏是对氧化应激高度敏感的器官之一，氧化应激刺激肾小球系膜细胞增殖、纤维化和肾小球硬化，最终导致肾脏损伤。氧化应激介导的NF-κB信号活化可能参与MsPGN发病机制中的免疫、炎症、细胞凋亡等方面[4]，体外细胞培养实验证实，NF一KB的活化与肾小球系膜细胞增生密切相关，Guijoarr等[5]发现，体外培养的GMc中NF一KB的活化能促进GMc增生，且对GMc分泌多种炎症细胞因子和化学因子起着中心调控作用。
养阴止血方由喉科专著《重楼玉钥》中养阴清肺汤化裁而来，以“清热解毒、滋阴凉血化瘀”为治则，方中生地黄养阴清热；玄参养阴生津、泻火解毒；麦冬养阴清肺。金银花、连翘、白花蛇舌草、半枝莲清热解毒消痈；板蓝根、白茅根清热凉血利咽。丹皮、益母草凉血清热化瘀；海螵蛸、生牡蛎、生龙骨收敛固涩止血；茜草、藕节凉血止血、化瘀。甘草泻火解毒、调和诸药。全方多而不散，药力专攻，直中病机，共奏清热解毒、滋阴凉血化瘀之功
实验结果表明，对照组尿红细胞从第 8 周到 14 周逐步增多，说明大鼠病情在逐渐加重，而且无自愈倾向。且实验结果显示养阴止血方可以通过降低 NF-κB表达水平，初步提示其作用机制可能是从细胞因子和细胞凋亡两方面抑制 GMC 增生和 ECM 积聚，改善病理变化，从而延缓病情进展。
参考文献：
[1]陈香美，王建中，傅博，等.精-甘-天-丝四肽对肾小球系膜细胞凋亡相关基因的作用.中华医学杂志，1998，78（1）：59.
[2]Danilewicz M，W?growska-Danilewicz M. The immunoexpression of glomerular NF-κB in proteinuric patients with proliferative and non-proliferative glomerulopathies[ J ] .Pol J Pathol，2013，64（2）：78-83.
[3]Huang W，Xu L，Zhou X，et al.High glucose induces activation of NF-κB inflammatory signaling through IκBa sumoylation in rat mesangial cells[ J ] .Biochem Biophys Res Commun，2013，438（3）：568-574.
[4]Bhatt SR，Lokhandwala MF，Banday AA. Vascular oxidative stress upregulates angiotensin II type I receptors via mechanisms involving nuclear factor kappa B[ J ] .Clin Exp Hypertens，2014，36（6）：367-373.
[5]GuijarroC，Kim Y，Kasiske BL，et al.Central role of the transcription factor NF一KB In mesangial cell production of chemokines [J」.Contrib Nephrol，1997，120：210~212
注：黑龙江省青年科学基金项目：编号：QC2011C113
论文作者:张春戬,郑佳新,白烨
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第15期
论文发表时间:2017/11/10
标签：对照组论文; 肾脏论文; 血尿论文; 细胞论文; 肾小球论文; 大鼠论文; 模型论文; 《中国误诊学杂志》2017年第15期论文;