1.新疆克拉玛依市人民医院 克拉玛依 834000；2.新疆克拉玛依市中心医院药学部 克拉玛依 834000
摘要：目的：建立反相高效液相色谱法测定人血浆中埃索美拉唑（esomeprazole，EMZ，）浓度。方法：血浆样品用二氯甲烷萃取后经 ymcc18（150mm*4.6mm，5μm）色谱柱（柱温：35℃），用流动相甲醇-0.02mol·L-1醋酸铵（NH3·H2O 调Ph7.6）=51：49，以流速1ml·min-1 洗脱分离，用卡马西平为内标，检测波长306nm。结果：标准曲线线性范围3.9~2000.0ng·ml-1；萃取回收率70.6%~76.7%；加样回收率 89.1~104.6%；日内测定RSD为4.8%~6.6%，日间测定为2.8%~5.6%。结论：本方法快速、灵敏、准确、简便，适用于EMZ 血药浓度测定及药代动力学研究。
关键词：埃索美拉唑；高效液相色谱法；药代动力学
Determination of Esomeprazole in Human Plasma by RP-HPLC
Hou Bao-lin 1，Zhao Jun-fang 2，Sun Ke-hong 1*，
1. Karamay People's Hospital，Xinjiang 834000，China；2. Department of Pharmacy，Karamay Central Hospital，Xinjiang 834000，China；
【Abstrac】t：Objectiv：Determination of Esomeprazole in human plasma by Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography. Methods：The plasma samples were extracted by dichloromethane after ymcc18（150mm*4.6mm，5 m）chromatographic column（column temperature：35℃），with the mobile phase of MeOH -0.02 mol·L-1 ammonium acetate（NH3·H2O Ph7.6）=51：49，with a flow rate of1ml·min-1 elution，Carbamazepine was used as an internal standard. The effluent was measured at 306nm. Results：The linear range of standard curve 3.9~2000.0ng·ml-1；the extraction recovery rate was 70.6%~76.7%；the recovery rate of sample was 89.1~104.6%；the daily determination of RSD was 4.8%~6.6%；the daytime determination was 2.8%~5.6%. Conclusion：This method is rapid，sensitive，accurate and simple. It is suitable for the determination of EMZ blood concentration and pharmacokinetic study.
【Keywords】：esomeprazole；RP-HPLC；Pharmacokinetics
埃索美拉唑（esomeprazole，简称EMZ，商品名：耐信）为世界上首次人工合成并用于临床的光学异构体质子泵抑制剂，它对胃食管反流性疾病患者的治疗和已愈合的腐蚀性食管炎的维持治疗均有显著疗效。为奥美拉唑的异构体，光学性质稳定，其特点为口服后的首过效应较奥美拉唑和 R-异构体少，生物利用度高，抑酸效果更好，药效较奥美拉唑更为持久。在胃食管反流病患者中，比奥美拉唑、兰索拉唑和泮托拉唑等质子泵抑制剂控制胃内的效果更好。为进行EMZ在中国人中的药代动力学及相关临床研究，本文建立了测定血浆浓度高效液相色谱测定法，尚未见到国内有相关报道。
A B C
图1 EMZ及内标血浆色谱图
A 空白血浆 B EMZ及卡马西平内标血浆色谱图 C患者血浆样品
1仪器和试药
1.1仪器和色谱条件 岛津公司LC-10AVP系列HPLC 仪，SCL-10AVP 系统
控制器，SPD- 10AVP紫外检测器：LC-10ATvp注液泵，SIL-10Advp全自动进样器，使用YMCC18（150*4.6mm，5μm）色谱柱。流动相；MeOH：0.02mol/NH4Ac（Ph7.6）=51：49，流速：1ml ·min -1。卡马西平做内标，检测波长306nm。
1.2试药 EMZ对照品由瑞士阿斯特拉公司提供（R比号117-01），内标卡马西平购自四川省药品检验所。甲醇、二氯甲烷为色谱纯，其余试剂均为分析纯，蒸馏水经MILLIPORE公司RoisTM/Elix仪纯化处理。
1.3对照品储备液
1.3.1EMZ对照品储备液 精密称取对照品5.0mg，加5ml甲醇溶解后，再用 0.1mol·l-1 NaHCO3（pH9.3）定容于50ml 棕色容量瓶中，即得EMZ对照品储备液（100μg·ml-1），置 2~8℃冰箱闭光保存。临用时将EMZ 对照品储备液用 0.1mol·l-1 NaHCO3（pH9.3）稀释成标准曲线工作液。
1.3.2内标储备液 精密称取卡马西平对照品5.0mg，加5ml甲醇溶解后，再用D.DH2O定容于50ml容量瓶中，即得内标对照品储备液（100μg·ml-1），置2~8℃冰箱储存备用。临用时取内标对照品储备液0.2ml，加纯水7.8ml，混匀后即得卡马西平内标工作液（1.25μg·ml-1）。
2 结果
2.1标准曲线制备
取空白血浆0.5ml共10份，分别加入100μlEMZ标准曲线系列工作液，再加入100μlEMZ 内标工作液，漩涡混匀后加入200μl0.02mol· l-1 Na2HPO4（pH9.0）缓冲液，漩涡混匀后加入3ml二氯甲烷，漩涡萃取5min，离心10min（2500rpm），抽弃上层液，转移有机相于尖底玻璃试管内，置40℃水浴中通空气流挥干，残渣溶于100μl流动相液，漩涡溶解1 min，分装入全自动进样器，进样50 μl。记录药物和内标的色谱峰高，以两者的峰高比对应其浓度进行线性回归，得EMZ血浆标准曲线 Y=0.00103X-0.000258，r=0.99999。EMZ浓度在3.9~2000ng·ml-1范围内线形关系良好。
2.2样品测定
取样品血浆0.5ml，分别加入100μl重蒸水，再加入 100μl内标工作液，漩涡混匀1 min，再按“血浆标准曲线制备”项下自“加入 200μl0.02 mol· l-1 Na2HPO4（pH9.0）液，”后操作，记录药物和内标的色谱峰高，以两者的峰高比从血浆标准曲线上求算其EMZ血浆浓度。EMZ及内标的血浆色谱图。（见图1）
2.3保留时间及定量限
EMZ及内标的保留时间分别为 11.6min和9.6min。实验测得血浆中 EMZ最低定量浓度为3.9ng·ml-1。
2.4萃取回收率 将一定量的EMZ标准工作液加入空白血浆中，制成15.6、125.0和 1000.0 ng·ml-1三种浓度的血浆样品，按前述样品测定法处理进样，同时制备对应浓度的水溶液样品直接进样，比较两者EMZ色谱峰峰高，计算其萃取回收率分别为70.6±6.4%、76.7±10.0%和73.8±12.1%。
2.5方法回收率 将一定量的EMZ标准工作液加入空白血浆中，制成 15.6、125.0和 1000.0 ng·ml-1三种不同浓度的
2.7稳定性考察 据文献报道奥美拉唑稳定性较差，故本文亦对EMZ作了以下稳定性考察。
2.7.1对酸碱的稳定性 取药物标准品分别溶于pH6的醋酸溶液和pH9.1的碳酸氢钠缓冲液，静置，观察溶液有无变化。在2min内醋酸溶液由无色至棕色变化，并在5min内迅速加深；碳酸氢钠缓冲液颜色无明显变化，故选择作为萃取条件。
2.7.2对温度的稳定性 配制高、中、低三种浓度EMZ溶液各三份，分别置室温（22℃）、40℃ 水浴、52℃水浴中加热，分别在不同时间点（0、10、20、30、60、90min）取50μl进样，记录色谱峰高，考察浓度变化情况。（见表 4）
2.7.3对光的稳定性
分别用棕色容量瓶和普通容量瓶配制EMZ标准储备液两份，置于冰箱中保存。为考察EMZ标准工作液的稳定性，特配制高、中、低三种浓度血样各两份，分别置-30℃冰箱保存，考察在低温保存不同时间其血药浓度变化情况。（见表4）。
图3 EMZ结构式
3讨论
3.1内标的选择 文献报道采用非那西丁作内标测定奥美拉唑［1-3 ］，检测波长302nm 和320nm［1，2］，本文对EMZ 和非那西丁的紫外吸收扫描结果显示，EMZ的最大吸收波长为215nm，在304.2nm处有次吸收峰，而非那西丁在300nm~400nm之间的吸收度极低，二者吸收响应差别较大，故在300nm左右测定EMZ，不宜选用非那西丁，而卡马西平（最大吸收在302nm）光谱性质与EMZ相似，故本文选择卡马西平作内标，得到满意结果。
3.2萃取条件的筛选 文献报道HPLC法测定奥美拉唑的最低检测限为10ng·ml-1，且经两次萃取后再反萃除去杂质［1］，预处理步骤复杂，灵敏度和排除杂质干扰亦不够理想。本文通过选择不同萃取条件，分别用乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、乙醚等试剂在不同的pH（pH7.0、8.0、9.0）条件下进行萃取，结果表明石油醚对药物和内标的萃取率最低，乙醚萃取药物虽有较高的萃取回收率，但在色谱分离过程中57min时有一未知峰干扰测定，乙酸乙酯与二氯甲烷萃取回收率相当，但前者无关色谱峰较多，基线不如用二氯甲烷萃取后平稳，虽未干扰药物和内标峰但考虑到该方法将同时用于测定EMZ的主要代谢物，所以选用二氯甲烷做萃取剂。在上述三个pH条件下，萃取回收率、色谱峰形及杂质差异很小，因在碱性条件下有利于EMZ的稳定，故选择pH9.0。
综上所述，在 200μl0.02 mol· l-1 Na2HPO4（pH9.0）条件下，采用3ml 二氯甲烷萃取液一次萃取，具有满意的萃取回收率和方法回收率，完全可满足药代动力学及生物利用度研究要求的检测限。
3.3EMZ稳定性
稳定性考察表明EMZ在酸性溶液中不稳定。化学结构式显示（见图3），EMZ由苯并咪唑环，吡啶环和连接两环的亚磺酰基构成，其中苯并咪唑环和吡啶环都具有碱性，所以EMZ在碱性条件中比酸性条件下稳定；S为手性中心，硫氧键与光学稳定性有关，故本研究做了标准工作液在一周内的光稳定实验，测定结果变异不明显，说明EMZ光学性质比较稳定，与有关文献报道EMZ光学性质稳定吻合［3-4］。由此推断，奥美拉唑光学稳定性可能与R-构型异构体密切相关，相关问题有待进一步深入研究。为保证结果准确性和重现性，试验过程中仍避光操作。有关EMZ在不同温度下的稳定性，由试验结果可知（见表3），在不同温度下，高、中、低三个浓度的EMZ测定结果差异不大，进一步支持了EMZ的稳定性较好的结论。
本法灵敏、准确、重现性好，血样预处理简单快捷，可用于埃索美拉唑临床药代动力学及相关研究。
参考文献：
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论文作者:候宝林1,赵俊芳2,孙克红1*（通讯作者），
论文发表刊物:《健康世界》2017年18期
论文发表时间:2017/11/15
标签：血浆论文; 色谱论文; 浓度论文; 西平论文; 回收率论文; 稳定性论文; 奥美论文; 《健康世界》2017年18期论文;