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【摘要】目的:探讨micro RNA-215(mi R-215)在结直肠癌Lovo细胞系中的表达并观察对结直肠癌细胞系增殖凋亡能力的影响。方法:结直肠癌细胞系Lovo与正常结直肠细胞系CCD-18Co分别行细胞培养，Real-time PCR检测mi R-215的表达差异；转染mi R-215表达质粒(mi R-215 mimics)、mi R-215抑制质粒(mi R-215 inhibitor)于Lovo细胞，筛选出稳定表达的细胞株，并Real-time PCR检测mi R-215的表达，MTT流式细胞仪检测mi R-215对Lovo细胞增殖和细胞凋亡的影响。结果:mi R-215在结直肠癌细胞系Lovo中的表达与正常结直肠细胞系相比均明显增高(P＜0.01)。稳定转染后，与NC组相比，转染mi R-215拟似物后mi R-215相对表达量明显升高(t=6.528,P<0.05)，MTT检测Lovo细胞增殖活力下降(t=3.472,P<0.05)，细胞凋亡比例明显升高(t=5.704,P<0.05)；而转染mi R-215抑制物后mi R-215相对表达量显著下降(t=6.324,P<0.05)，Lovo细胞增殖活力却明显上升(t=3.331,P<0.05)，细胞凋亡比例显著降低(t=2.300,P<0.05)。结论:mi R-215在结直肠癌细胞中呈低表达，抑制mi R-215表达可促进Lovo细胞的增殖，降低细胞凋亡比例。
【关键词】结直肠癌；微小RNA；增殖；细胞凋亡
【中图分类号】R73.3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）28-0131-03
结直肠癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，近几年其发病率和死亡率明显升高[1-2]。随着对结直肠癌研究加深，已经明确结直肠癌的发生、发展是一个多步骤、多因素参与的过程，这个过程中伴随着基因水平和表观遗传水平改变的累积[3-4]。Micro RNA (mi RNA)作为一种新发现的非编码的小RNA，在转录后水平参与基因表达的调节，从而在包括结直肠癌在内的多种肿瘤的发生、发展过程中扮演重要角色[5-6]。本研究通过分析mi R-215在结直肠癌细胞中的表达情况，为研究结直肠癌的小分子机制奠定基础。
1.材料与方法
1.1 材料
人结直肠癌细胞系Lovo购自中国科学院上海细胞库，人正常结直肠细胞系CCD-18Co购自北京北纳创联生物技术研究院，
1.2 试剂及仪器设备
培养细胞所需的培养基等购自GIBCO公司；引物由上海生工合成；RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；cDNA合成试剂盒和Real-time PCR试剂均购自Sigma公司；4%的多聚甲醛溶液购自武汉博士德生物工程有限公司；0.1%的结晶紫溶液购自北京博奥拓达科技有限公司；细胞转染用的脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；MiRNA质粒包括mi R-215表达质粒(mi R-215 mimics)、mi R-215抑制质粒(mi R-215 inhibitor)及其相应的对照质粒购自Genecopoeia公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒及Caspase-3活性检测试剂盒购自凯基生物公司。
1.3 实验方法
1.3.1 Real-time PCR检测mi R-215的表达 根据TRIzol操作说明书提取总RNA，应用RT-PCR试剂盒逆转录cDNA。使用TaqMan mi RNA Reverse Transcription试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)和TaqMa nHuman Mi RNA Assay试剂盒f Applied Biosystems)定量检测miR-215表达。采用U6作为内参。以校正后的Ct值(2-△△Ct)为检验统计量，公式为：△△Ct=(Ctmi R-215-CtU6)实验组-(Ctmi R-215-CtU6)对照组。实验所用到的相关引物如下所示。
qRT-PCR的相关引物序列基因引物序列(5’→3’)
mi R-215
上游：5'-GGGTCCGAGGTATTCGCACT-3'，
下游：5'-CGATGACCTATGAATTGACAGACG-3'；
U6
上游：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，
下游：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；
1.3.2细胞培养 人结直肠癌细胞系Lovo和人正常结直肠细胞系CCD-18Co培养于含10％胎牛血清(Gibco，USA)、1％青霉素／链霉素(Sigma，USA)的DMEM培养基(Gibco)中，置于37℃、5％CO2：细胞培养箱中，饱和湿度下培养。稳定传代2～3代后，取对数生长期细胞进行实验。
1.3.3质粒构建和转染 使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将mi RNA质粒包括mi R-215表达质粒(mi R-215 mimics)、mi R-215抑制质粒(mi R-215 inhibitor)及其相应的对照质粒转染Lovo系细胞，并应用潮霉素筛选稳定表达细胞株用于进一步实验。
1.3.4 MTT实验测定细胞活力 取对数生长期的细胞，用培养基制备细胞数为1×105/ml的单细胞悬液，以细胞计数后分别以1×103/孔(200μL)接种至96孔细胞培养板中。接种细胞24h、48h、72h后MTT检测细胞活力。在检测细胞活力前4h，每孔加入20μl 5mg/ml的MTT；继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μL DMSO，于室温轻微溶解结晶15 min。酶标仪在490nm波长处检测每孔的吸光值。绘制增殖曲线，每组设6个复孔，实验重复3次。
1.3.5流式细胞仪检测肠癌Lovo细胞的凋亡情况 取转染后48h后的细胞，用0.01mol/L PBS洗涤细胞，800r/min离心5min后弃去上清，将试剂盒中缓冲液添加入管中，调整细胞浓度为1×106/ml，每管加入500μl细胞悬液、5μl AnnexinV-FITC和10μl PI。混匀室温避光孵育20min后，将细胞移至流式管，上流式细胞仪检测细胞凋亡率，每个样本独立重复3次。
1.4 统计学方法
计量数据以x-±s表示，采用t检验和单因素方差分析，所有数据均采用SPSS 17.0统计软件进行分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1 mi R-215在结直肠癌细胞与正常结直肠细胞中的表达
PCR结果显示，mi R-215在结直肠癌细胞系Lovo中的表达水平为（1.283±0.246），与正常结直肠细胞系相比（2.031±0.315），明显降低，差异有统计学意义（t=4.584，P＜0.05）。
2.2 mi R-215拟似物和抑制物对Lovo细胞增殖能力的影响
将Lovo细胞分别转染mi R-215拟似物和抑制物，PCR检测发现，与NC组相比，转染mi R-215拟似物后mi R-215相对表达量明显升高（t=6.528，P＜0.05），MTT检测Lovo细胞增殖活力下降(t=3.472，P＜0.05)；而转染mi R-215抑制物后mi R-215相对表达量显著下降（t=6.324，P＜0.05），Lovo细胞增殖活力却明显上升（t=3.331，P＜0.05）。具体见下表。
2.3 mi R-215拟似物和抑制物对Lovo细胞凋亡的影响
与NC组相比，转染mi R-215拟似物的Lovo细胞凋亡比例明显升高(t=5.704，P＜0.05)，转染mi R-215抑制物的Lovo细胞凋亡比例显著降低(t=2.300，P＜0.05)。
表
与NC组比较，*P<0.05；与mi R-215拟似物组比较，P<0.05。
3.讨论
近年来，非编码RNA已成为生命科学研究的热点之一。迄今在人类中有1048中不同的miRNA。随着对miRNA研究的深入，人们逐渐认识到MicroRNA参与体内许多重要生命活动，如细胞发育、增殖、分化以及凋亡等与肿瘤的发生、进展、转移关系密切[7-8]。对结直肠癌的研究也发现，有很多mi RNA在结直肠癌中异常表达。如miR-592在结直肠肿瘤组织中显著上调[9]，mi RNA可能作为一类潜在的癌基因或抑癌基因起作用[10]。这些发现扩展了结直肠肿瘤的发病机制，显示出mi RNA可以作为一种新型的诊断标记物预后预测的指标及潜在的治疗靶点[11-12]。
相关文献报道在胃癌中，miR-215高表达，并且能够促进细胞的增殖和肿瘤细胞的侵袭能力，但是其发挥作用的机制和表达调控机制并不清楚。Chen[13]等发现miR-215在胃癌组织中表达显著上调，其表达水平与肿瘤的分化程度、临床TNM分期及淋巴结转移有关（P＜0.05）。张小静等[14]研究提示胃癌高转移细胞中miR-192、miR-193a、miR-194和miR-215的上调可能与胃癌的发生和转移等有关。miR-215似乎表现出致癌性质和促进胃癌的发展。而另一些研究则发现相反的现象。在关于肾细胞癌预后的meta分析[15]发现miR-215等在肾癌组织中表达降低，且与预后差有关。mi R-215在乳腺癌组织中表达低于癌旁正常组织，多因素分析认为miR-215低表达可作为乳腺癌预后的预测因子[16]。与其他实体瘤不同的是，miR-215结直肠癌中的表达，在更晚期结直肠癌中低表达[17]。miR-215在溃疡性结肠炎和溃疡性结肠炎性结肠癌动物模型中表达上调[18]。Li等[19]对行根治性手术后复发的Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者进行回顾性分析，与无复发结直肠癌患者相比，miR-215在复发患者中表达下调（P=0.001），miR-215低表达与3年复发率升高显著相关（P=0.001）。多元分析表明，miR-215表达可以作为一个独立的复发预测指标。
为了进一步研究mi R-215与结直肠癌的关系，本研究预实验选取Lovo细胞作为研究对象，Real-time PCR检测了mi R-215在结直肠癌细胞系Lovo和正常结直肠细胞系(CCD-18Co)中的表达差异。与CCD-18Co相比，mi R-215在结直肠癌细胞系中的表达明显降低，具有显著差异。通过转染mi R-215拟似物和抑制物的质粒，镜下观察Lovo细胞的状态比较稳定，Real-time PCR验证了Lovo细胞在稳定转染anti-mi R-215后，mi R-215表达降低，表明成功抑制了mi R-215在Lovo细胞中的表达。这与已有文献报道研究结果一致，推测mi R-215的表达下调可能与结直肠癌的发生、发展有关。本研究real-time PCR检测转染mi R-215拟似物后mi R-215相对表达量明显升高，而Lovo细胞增殖活力下降，细胞凋亡比例明显升高；转染mi R-215抑制物后mi R-215相对表达量显著下降，Lovo细胞增殖活力却明显上升，细胞凋亡比例显著降低。说明mi R-215与Lovo细胞的生长、增殖能力呈负相关性，与细胞凋亡呈正相关性。
由此我们得到初步的结论，mi R-215的低表达可能与结直肠癌的发生、发展有关，抑制mi R-215的表达后能够显著促进结直肠癌细胞的生长、增殖，并抑制其细胞凋亡能力。我们推测mi R-215是结直肠癌潜在的诊断、治疗的新靶点，为研究结直肠癌的分子机制提供新的思路。但对于mi R-215在结直肠癌中具体的作用机制尚不清楚，有待于更加深入研究。
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论文作者:刘凯1,2,武军驻1
论文发表刊物:《医药前沿》2016年10月第28期
论文发表时间:2016/10/10
标签：细胞论文; 转染论文; 细胞系论文; 质粒论文; 结直肠癌论文; 凋亡论文; 抑制论文; 《医药前沿》2016年10月第28期论文;