鲁松清[1]1999年在《苏云金芽胞杆菌对鳞翅目昆虫广谱高毒基因工程菌的构建》文中研究指明本论文主要是围绕构建苏云金芽胞杆菌对鳞翅目昆虫特别是针对甜菜夜蛾的高效广谱基因工程菌而开展的研究工作。研究结果总结如下： 1 菌株对甜菜夜蛾的毒力与基因类型的关系 PCR扩增检测了九个苏云金芽胞杆菌菌株所含杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProtein,ICP)基因，根据扩增结果将它们分为5种基因类型。高毒力菌株属于基因类型1和2。基因类型1含cry1Aa和cry1Ac，基因类型2含cry1Aa。这一结果为基因工程菌的构建提供了理论依据。国内尚未见基因类型与毒力关系的相关报道。 2 依赖芽胞形成ICP的cry1C启动子(P_(1C))对野生菌株特性的影响 将带P_(1C)及cry1C的质粒pBMBLC分别转入野生菌株YBT-1535，YBT-1520和YBT-833。结果菌株YBT-1535的转化子对甜菜夜蛾的毒力有非常显著的提高(8倍以上)，对棉铃虫和小菜蛾的毒力影响不大，转化子的综合毒力高于YBT-1535。菌株YBT-1520的转化子不论是对棉铃虫还是对小菜蛾的毒力均有不同程度的下降，对甜菜夜蛾的毒力也无大的变化。质粒pBMBLC电脉冲转入菌株YBT-833，得到了几个ICP基因背景不同的转化子，它们的综合毒力较出发菌YBT-833都没能得到提高。综合这三个菌株的实验结果，虽然菌株YBT-1535转化子的综合毒力有所提高，但那是建立在YBT-1535较低毒力水平之上的，转化子的毒效离实际应用相差甚远，工程菌构建的基本思路可能需作大的改变。将ICP基因转入野生菌株国内尚无人报道。 3 非依赖芽胞形成ICP的cry3A启动子(P_(3A))对野生菌株特性的影响 带P_(3A)和cry1C基因的重组质粒pBMB827转入YBT-1520，转化子对所测昆虫的毒力下降非常明显，芽胞和晶体也很难脱落。此外，PCR扩增发现转化子比出发菌YBT-1520多了cry1Ab的特异带，SDS-PAGE电泳证实Cry1Ab的存在。至于为何质粒pBMB827的转入导致隐性cry1Ab的表现及表达则不清楚。国内尚未有人报道P_(3A)对野生菌株特性影响的相关研究。 4 高毒力工程菌株YBT-833-2-1的遗传改造及其特性 对YBT-833-2进行无抗性压力选择，得到一株高毒力工程菌株YBT-833-2-1。YBT-833-2-1比其原始出发菌株YBT-833少了一条带cry1Ab的质粒。生物测定结果表明，它对小菜蛾的毒力比YBT-833有明显提高(P＞0.95)：对棉铃虫和甜菜夜蛾的毒力比YBT-833有大幅上升。与生产菌株YBT-1520比较，除对棉铃虫的毒力存在差距外，对小菜蛾和甜菜夜蛾的毒力都明显提高(P＞0.95)。工程菌株YBT-833-2-1的综合毒力明显高于菌株YBT-833和YBT-1520，它具有极高的商业开发价值。通过消除cry1Ab提高菌株毒力在国内外均未见相关报道。 5 影响菌株毒力的因素 体外将Cry2和Cry1Ab分别与菌株YBT-833，YBT-833-2-1的胞晶混合物混合测定，结合HD-1与HD-1-80-21，HD-133与HD-133-5的生测结果，发现Cry1Ab与其它ICP不存在拮抗作用。工程菌株YBT-833-2-1毒力远高于YBT-833的原因是：a．cry1Ab的丢失导致其它ICP量的增加(包括Cry2)；b．Cry2对其它ICP的增效作用。本文结果国内外均未见相关报道。
朱晨光[2]2003年在《苏云金芽胞杆菌抗病杀虫和广谱工程菌的构建》文中研究说明本论文用cry3Aa启动子驱动表达的aiiA基因和vip83基因，通过穿梭载体电转化苏云金芽胞杆菌高毒力细胞工程菌株YBT-833-2-1和高毒力野生菌株YBT-1520，构建了一株抗植物软腐病且具杀虫活性的工程菌和一株广谱工程菌。研究了芽胞杆菌CTC菌株伴胞晶体的形态发生，观察到CTC菌株的S-层结构，证实CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体。主要结果如下： 1．苏云金芽胞杆菌抗病杀虫工程菌的构建 自身诱导物AHLs分子是病源菌数量感知系统中必不可少的成分，苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白可以降解这类信号分子，从而抑制病原菌的致病性。本研究将转录不依赖芽胞形成的苏云金芽胞杆菌cry3Aa基因的启动子替换基因aiiA自身的启动子，构建了基因pro3A-aiiA。基因pro3A-aiiA插入穿梭载体并电转化对鳞翅目害虫高毒力的细胞工程菌株YBT-833-2-1，得到工程菌BMB821A。工程菌BMB821A对自身诱导物AHLs分子的降解活性和对欧文氏菌感染植物组织的抑制能力比出发菌株大大增强，对鳞翅目害虫甜菜夜蛾的杀虫毒力LC_(50)值为3.426μL／mL，与出发菌株的LC_(50)值2.912μL／mL相比无显著差异。至今国内外尚未见有其它杀虫抗病双重活性的Bt工程菌报道。 2．苏云金芽胞杆菌广谱工程菌的构建 苏云金芽胞杆菌的营养期杀虫蛋白Vip是一种在营养期开始表达的可溶性蛋白，对小地老虎和甜菜夜蛾具有特异高毒力。用cry3Aa基因的启动子替换基因vip83自身的启动子，构建了基因pro3A-vip。基因pro3A-vip在无晶体突变株BMB171中的蛋白表达量和蛋白对小菜蛾的毒力均高于基因vip83。将pro3A-vip基因插入穿梭载体然后电转化对鳞翅目害虫高毒力的野生菌株YBT-1520，得到工程菌BMB218V。工程菌表达的Vip蛋白依然为可溶性蛋白。工程菌对甜菜夜蛾的杀虫毒力比出发菌株提高了11倍，对棉铃虫则保持原有的高毒力。本研究在国内首次报道了用pro3A-vip基因构建广谱Bt程菌。通过剪接重叠PCR法，将cry1C基因中负责编码与晶体形成有关的片段与vip基因毒力核心片段融合在一起，构建了融合基因vip-1C，该基因在无晶体突变株中表达形成了90kD分子量大小的蛋白。 3．芽胞杆菌菌株CTC的S-层蛋白在细胞内可以形成伴胞晶体 芽胞杆菌菌株CTC晶体蛋白N-端序列和基因核苷酸全序列经测定发现与炭疽芽胞杆菌的S-层蛋白具有92％和87.5％的同源性，显示该菌株可能具有S-层结构。本研究结果表明菌株CTC在营养期细胞壁外可形成S-层结构，在细胞内可形成S-层的初体结构，在芽胞形成期可于细胞内形成伴胞晶体，并随芽胞的成熟而释放出来；结合氨基酸和核苷酸的序列同源性，进一步说明伴胞晶体在组成上与S-层蛋白密切相关；特别是发现当晶体蛋白基因ctc导入无晶体突变株后，可形成与菌株CTC相似的伴胞晶体。本研究结果证实芽胞杆菌菌株CTC的伴胞晶体由S一层蛋白表达形成。该菌株伴胞晶体成分的特殊性揭示苏云金芽胞杆菌种的鉴定原则还有待修订和改进。
张振宇[3]2005年在《苏云金芽胞杆菌新异杀虫晶体蛋白基因的克隆与基因工程菌WG-001的安全评估》文中提出新的苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的克隆对于控制害虫对苏云金芽胞杆菌杀虫剂的抗性和研究晶体蛋白对苏云金芽胞杆菌的生物学意义等理论研究都具有重要意义。在本文第一部分中，在以往从“无毒”菌株中发现其晶体蛋白对特定生物体具有毒杀作用的诸多实例的启发下，以实验室保藏菌种材料中部分晶体蛋白成分较新异且未发现杀虫活性的菌株为研究对象，进行了晶体蛋白基因的克隆，并成功的从华中亚种的标准菌株YBT978中成功的克隆到cry7Ba1，为cry7群中新亚群，其表达产物对小菜蛾具有高效杀虫活性；这为寻找新异杀虫晶体蛋白基因开辟了新的思路。本文第二部分进行了苏云金芽胞杆菌基因工程菌WG-001的安全评估，包括工程菌WG-001的定植能力、传播扩散能力、对土著微生物的影响、遗传变异能力以及特异基因cry1Aa和cry1Ac水平转移能力五个方面的内容，初步证明其对南方蔬菜地土壤环境有很高的安全性，为其推广应用提供了安全性实验数据支持。 具体结果如下： 1．筛选出BMB1518、YBT978、L60、NXP15-04、PBt53、HZ39-04、LT1L-57、NARCBt17、EA15196、EA14696、T70。其中，BMB1518、YBT978、L60、NXP15-04、EA15196的晶体蛋白已转至PVDF膜，BMB1518的45kD晶体蛋白、YBT978的130kD晶体蛋白、EA15196的42kD晶体蛋白已测得N-末端15个氨基酸序列。 2．构建了YBT978的基因组BAC文库。同时根据YBT978的130kD晶体蛋白N-末端15个氨基酸序列，采用结合接头的PCR扩增方法获得了此130kD晶体蛋白对应基因N-端的DNA序列，据此设计了引物130A1-2和130S1-2，用于从YBT978的基因组BAC文库中筛选含有130kD晶体蛋白基因的克隆子。对得到的阳性克隆子进行亚克隆，最终获得了3465bp的130kD晶体蛋白基因编码区，并预测了RBS序列和BtⅠ、BtⅡ重叠双启动子，终止子，以及全部的8个保守区。此多肽与其它已知的Cry与Cyt蛋白的氨基酸序列比较结果表明它与Cry7Ab2最相似，identity达到了58.2％；其中，其C-端序列非常相似，identity为87.9％，而N-端序列的相似度较低，identity为37.1％。此晶体蛋白已被杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为Cry7Ba1，为Cry7群的新亚群。将cry7Ba1转入无晶体突变株CryB，能形成晶体蛋白与野生菌株YBT978形状和大小相似的双金字塔形伴胞晶体，其晶体蛋白成分为预期的130kD大小。生测结果表明，伴胞晶体无毒的YBT978表达的Cry7Ba1蛋白在体外溶解后对小菜蛾具有高毒力。由于Cry的N-端为其毒力核心区域，因此根据Cry7Ba1的N-端与已知Cry的相似度很低的特点，推测此晶体蛋白识别昆虫中肠上皮细胞上新异的受体，具有很高的开发价值。cry7Ba1的发现从一定程度上预示在众多被认为“无毒”的苏云金芽胞杆菌中蕴藏着丰富的杀虫晶体蛋白基因资源，为寻找杀虫晶体蛋白提供了新的思路。
周臣飞[4]2007年在《苏云金芽胞杆菌抗病工程菌的构建》文中指出本文采用了以S层蛋白为基础的表面展示技术，在苏云金芽胞杆菌中表达了“植物激活蛋白基因”，构建了一株抗病工程菌，并研究了物理化学因子对苏云金芽胞杆菌芽胞萌发的影响，为该工程菌的应用解决了技术瓶颈。具体的结果如下：1．利用植物激活蛋白构建苏云金芽胞杆菌抗病工程菌植物激活蛋白是邱德文博士首次从交链胞菌(Alternaria spp.)等多种真菌中筛选、分离、纯化出的一种新型蛋白。该蛋白可以诱导植物产生系统获得抗性反应(SAR)，促进植物抗病相关基因或者酶类在短时间内高量表达，提高植物自身的免疫系统，从而使植物对多种真菌和细菌病害产生抗病作用。目前，国内外还未见有关于植物激活蛋白异源表达和工程菌构建的报道。本研究运用了以S-层蛋白为基础的表面展示技术，利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC的启动子来驱动植物激活蛋白基因ap36在苏云金芽胞杆菌中的表达，构建了融合基因slh-ap36，并将其分别导入到无质粒突变株BMB171中得到了一株抗病工程菌BMB0588。盆栽结果显示工程菌BMB0588能够诱导番茄幼苗叶片中抗病相关酶活性的提高；离体抗病试验证明工程菌BMB0588能够有效减轻软府欧文氏菌SCG1对土豆片的感染。2．苏云金芽胞杆菌芽胞萌发条件的探索苏云金芽胞杆菌相关产品主要以芽胞制剂应用于生产，而芽胞在自然环境中很难有效萌发和定殖，使得芽胞制剂很难发挥二次作用。另外，工程菌BMB0588诱导植物抗病的有效成分为融合蛋白SLH-Ap36，该蛋白主要在营养期表达，以芽胞制剂形式使用很难发挥作用。为了解决这些问题，本文对影响苏云金芽胞杆菌无晶体突变株芽胞萌发的一些因素(主要包括温度，单一氨基酸和碳源等)进行了系统的研究，结果发现：45(?)热激活处理芽胞3h可诱导70％左右芽胞的萌发；终浓度0.5mM的L-丙氨酸和L-半胱氨酸单独处理4h时芽胞萌发率可达到40％；蔗糖，D-葡萄糖单独使用时对芽胞萌发没有效果，但能够提高L-丙氨酸对芽胞萌发的诱导效果。最终，使用终浓度0.5mM的L-丙氨酸和4.5mM的D-葡萄糖在45(?)共同处理芽胞10h后，可以使芽胞萌发率达到99％左右。
张彦蕊[5]2012年在《苏云金芽胞杆菌HBF-18菌株毒力相关基因的克隆与活性研究》文中研究表明蛴螬是金龟子幼虫的总称，是地下害虫中最大类群，也是危害最大、造成损失最严重的种类。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是目前研究最多、应用最广的昆虫病原微生物。由河北农林科学院植保所分离的HBF-18菌株对大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）与暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）有较好杀虫活性，本实验室从中克隆了对暗黑鳃金龟与大黑鳃金龟都有活性的cry8Ga1基因。然而，cry8Ga1基因的表达产物杀虫活性与出发菌株（HBF-18）相比，有较大的差别，对大黑鳃金龟、暗鳃金龟的活性比出发菌株分别降低50倍与70倍。在本实验室克隆的其他对蛴螬有活性的cry8类基因则没有这种现象。由此推测HBF-18菌株中除了含有cry8Ga1基因外，还可能含有其他新的杀虫基因。但是通过传统的鉴定方法我们没有鉴定出来新的杀虫基因，本研究在菌株基因组测序的基础上，对HBF-18菌株中可能含有的新的杀虫基因进行发掘，克隆了3个新的基因，并对其表达产物进行了生物活性的测定和增效研究，具体进展如下：本研究在前期基因组测序的基础上，利用生物信息学分析，发现了三种新的杀虫基因。从HBF-18菌株中分别克隆了cry8-like、vip1、vip2基因。其中cry8-like基因长度2214bp，具有完整的阅读框架，编码738个氨基酸，与Cry8Db氨基酸序列相似性最高，达到51%，包含了完整的Cry毒素活性区所必需的三个结构域；在cry8-like基因上游存在SigA、SigD、SigE转录因子的结合位点及RBS序列，在其下游存在两个反向重复序列。该基因是一个完整的、不同于一般3.5kb的Bt cry8类基因。vip1全长基因2634bp，编码878个氨基酸，推导分子量为98.1kD，与Vip1Ba氨基酸序列相似性最高，达到76%，Vip1蛋白N端1-31位氨基酸为信号肽序列。vip2全长基因1386bp，编码462个氨基酸，推导分子量为52.6kD，与Vip2Ac氨基酸序列相似性最高，达到88%，Vip2蛋白N端1-30位氨基酸是其信号肽序列。vip2基因位于vip1基因上游，二者ORF间仅相差7个碱基；在vip2基因上游存在SigB、SigG转录因子结合位点，在vip1下游存在一个反向重复序列。反转录PCR结果显示上述基因在原始菌株HBF-18中能够正常转录。在大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株中成功表达了vip1、vip2、cry8-like基因，SDS-PAGE分析结果显示vip1基因表达约98kDa的蛋白，vip2基因表达约52kDa的蛋白，cry8-like基因表达约75kDa的蛋白。为了在Bt中表达cry8-like基因，本研究利用重叠PCR技术在cry8-like基因末尾加上了一段cry8Ea基因的3′末端序列，使其成为3528bp的杂合基因cry8X。将vip1、vip2、cry8X基因分别转化Bt无晶体突变株HD73-中，成功表达了三种蛋白，Vip1蛋白约80kD，Vip2蛋白约40kD，Cry8X蛋白约133kD。将构建的含有vip1、vip2、cry8X基因的Bt工程菌分别命名为HDVIP1、HDVIP2、HD8X；电镜观察结果表明HD8X可以形成球形晶体。分别测定了HD8X、HD8G、HD8X+HD8G、HDVIP1+HDVIP2、HDVIP1+HDVIP2+HD8G等菌株或菌株组合对暗黑鳃金龟幼虫的杀虫活性。结果表明，HDVIP1+HDVIP2及HD8X菌株对暗黑鳃金龟幼虫有杀虫活性，其LC50分别为3.51×1011和6.66×1011CFU/g土壤，二者杀虫活性都比HD8G及HBF-18低。HDVIP1+HDVIP2+HD8G菌株组合预期LC50与实测LC50的比值为4.15，具有协同增效作用，HD8X+HD8组合预期LC50与实测LC50的比值为1.86，属于相加作用。对不同的菌株和组合进行差异显著性检验，结果显示HDVIP1+HDVIP2+HD8G菌株组合对暗黑鳃金龟幼虫杀虫活性与HBF-18相比差异不显著。因此，HBF-18菌株杀虫活性比HD8G高的原因是该菌株中vip1、vip2、cry8X这些基因表达产物提高了Cry8Ga的杀虫活性。此外，Cry8X蛋白对铜绿丽金龟具有较好的杀虫活性，对小菜蛾没有杀虫活性。综上所述，本研究鉴定和克隆了三个新的杀虫基因vip1、vip2和cry8X，并揭示了只含有cry8Ga基因的表达菌株HD8G和原始菌株HBF-18之间杀虫活性有显著差异的原因。本研究为蛴螬的生物防治提供了新的基因来源。
谭芙蓉[6]2008年在《四川生态区苏云金芽胞杆菌资源的筛选鉴定及其新型杀虫基因的克隆表达研究》文中进行了进一步梳理苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前研究最深入、使用最广泛的杀虫微生物之一。深入发掘我国丰富的苏云金芽胞杆菌资源,筛选高毒力及特异性菌株,对其基因型进行分析,分离克隆新型杀虫基因,其结果对微生物杀虫剂的研制、构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物都具有重要的理论及实践意义。本研究对四川盆地不同生态区的Bt资源进行了较为系统的调查研究,从中分离克隆了数个新型杀虫基因,并进行了初步的表达研究,具体结果如下:1.采集四川不同生态区的土壤样品2650份,利用醋酸钠-抗生素法分离Bt菌791株,平均分离率为13.2%。分离出的菌株产生的伴胞晶体形态各异,有长菱形、短菱形、大菱形、小菱形、方形、球形、不定形等,充分显示了四川生态区Bt菌株资源多样性的特点。利用PCR-RFLP鉴定体系鉴定了791株Bt菌的杀虫晶体蛋白基因类型:其中522株含有cry1型基因,312株含有cry2型基因,20株含有cry3型基因,33株含有cry9型基因,28株含有cry4/10型基因,33株含有cry30型基因,3株含有cry40型基因。有80株菌未鉴定出基因型,对这些菌株的伴胞晶体SDS-PAGE分析结果表明:有的菌株表达130kDa和60kDa的蛋白;有的菌株表达90kD和40kDa的蛋白;有的菌株表达60kDa的蛋白;有的则表达90kDa左右的蛋白,可以推测,这些菌株极有可能含有新型的杀虫基因。2.系统地研究了四川生态条件下分离的Bt菌株Rpp02和Rpp39的生物学特性。根据形态特征、培养特征、细胞壁化学组分和生理生化分析,Rpp02菌株被定名为苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种(Bacillus thuringiensis subsp.morrisoni),Rpp39被定名为苏云金芽孢杆菌杀虫变种(Bacillus thuringensis var.entomocidus)。Rpp02生长3h进入对数生长期,生长速率略快于Rpp39(4h),Rpp39与已知标准菌株HD-1生长速率相当。Rpp02产生大菱形、小菱形、圆形、不定形伴胞晶体,Rpp39产生菱形、方形和圆形伴胞晶体。PCR-RFLP鉴定结果表明Rpp02含有cry1Ab、cry1Ac、cry1Ca和cry1Ia四种基因,Rpp39含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia和cry2Aa五种基因。SDS-PAGE电泳分析Rpp02主要产生130kDa和40kDa大小的蛋白,Rpp39主要产生130kDa和60kDa的蛋白。3.设计了一对cry1Ac基因的特异引物,对Rpp02菌株基因组DNA进行PCR扩增,得到大约4kb的产物。测序结果表明,克隆到的片段含有一个较大的ORF框,该基因编码区为3534bp,编码1177个氨基酸,分子量为133.144kDa;等电点pI=4.825,为弱酸性蛋白质;亮氨酸(Leu)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)3种氨基酸含量最高,分别为7.98%、7.81%、7.73%。与已报道的cry1Ac序列同源性达到99%,存在着几个核苷酸以及编码氨基酸的差别。该基因序列的Accessionnumber为DQ285666,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ac20。该基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物具有较强的杀虫效果。4.以Rpp39为出发菌株,分离克隆了cry2Aa类杀虫晶体蛋白全长基因。序列分析显示该基因的开放阅读框(ORF)为1902 bp,编码由634个氨基酸组成的蛋白质。其氨基酸序列与Cry2Aa1蛋白同源性为99.7%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry2Aa12。根据cry2Aa12基因ORF两端序列,设计1对特异引物P3/P4,PCR扩增获得cry2Aa12完整ORF。将获得的片段与大肠杆菌表达载体pET-30a连接,构建了重组表达质粒pET-2Aa。将该质粒导入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导能正常表达,SDS-PAGE电泳验证含有65kDa表达蛋白。生物活性测定表明表达的包涵体蛋白对小菜蛾和二化螟具有杀虫活性,LC_(50)分别为5.4μg/mL和22.3μg/mL。5.采用PCR-RFLP鉴定法,从菌株BtMC28中挖掘出一个新型杀虫模式基因,其部分序列与已知模式基因cry4Aa和cry10Aa的同源性分别为57%和60.5%。进一步采用Tail-PCR和Son-PCR技术获得了基因的全长序列。该基因的编码区为2022bp,编码673个氨基酸组成的蛋白,与Cry10Aa蛋白所氨基酸序列同源性最高为38%;其分子量为76.32kDa:异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、天冬酰胺(Asn)含量最高,分别为9.65%、9.36%、8.91%;它的等电点为7.535,属弱碱性蛋白。该新基因已在GenBank中注册,Accession number为EU339367。根据cry基因国际命名原则(即新发现的基因编码的氨基酸序列与已知蛋白同源性在45%以下为第一分类等级,用阿拉伯数字表示,如cry1、cry2、cry3…),该基因被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry54Aa1基因。根据cry54Aa1基因ORF两端序列,设计1对特异引物经扩增获得了cry54Aa1完整ORF。随后与大肠杆菌表达载体pET-30a连接,构建了重组表达质粒pET-54Aa。将该质粒导入E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导能正常表达,SDS-PAGE电泳验证含有76kDa表达蛋白。生物活性测定表明表达的包涵体蛋白对甜菜夜蛾的LC_(50)为5.8μg/mL,对伊蚊的LC_(50)为6.02μg/mL。
闫贵欣[7]2009年在《对金龟甲科、叶甲科害虫高毒力苏云金芽胞杆菌杀虫基因及工程菌的研究》文中研究说明苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的晶体蛋白。但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、杀虫毒力有限等缺点,因此,必须通过生物技术等手段寻找新的基因资源,并且构建高效广谱的Bt工程菌来满足生产的需要。目前,发掘新的杀虫基因,研究其晶体蛋白结构和作用机制都是国内外研究的热点,本论文围绕对鞘翅目害虫高毒力Bt基因的克隆、工程菌的构建、杀虫晶体蛋白杀虫特异性机理等方面进行了一系列的研究,主要结果如下:1、对蛴螬高杀虫活性cry8类基因的克隆:从自行筛选的菌株Bt145中克隆了cry8Ga2新基因,并获得正式命名。转化无晶体突变株HD-73-,构建了新的Bt工程菌株HD8G2,生物活性测定结果表明,工程菌株HD8G2与野生菌株均对鞘翅目害虫暗黑鳃金龟表现出杀虫活性,LC50分别为1.25×108 cfu/g和5.59×108 cfu/g。从自行筛选的菌株BtSU4中克隆了cry8Ha1和cry8Ia1新基因,并获得正式命名。转化无晶体突变株HD-73-,获得了两株新型Bt工程菌株HD8H和HD8I。室内生物活性测定结果表明,HD8H和HD8I都对暗黑鳃金龟幼虫有较高的杀虫活性,LC50分别为2.19×1010cfu/g和8.50×109 cfu/g,对鳞翅目害虫无杀虫活性;从HD8H提取的蛋白经胰凝乳蛋白酶活化后,对叶甲科害虫大猿叶甲表现出较高的杀虫活性,LC50为18.00μg/ml。通过RT-PCR以及Western杂交证实cry8Ha1和cry8Ia1基因在宿主菌株BtSU4中均能正常的表达。两个新基因分别申请了国家发明专利,为其应用奠定了基础。2、对鞘翅目金龟甲科和叶甲科害虫工程菌的构建:将对鞘翅目叶甲科害虫高毒力的cry3Aa7基因,通过电击转化到对蛴螬高毒力的野生菌株BtSU4和HBF-1中,得到工程菌株3A-SU4和3A-HBF。室内生物活性测定结果表明,两株工程菌不仅对蛴螬表现出较高毒力,而且还获得对叶甲科害虫的杀虫活性。工程菌3A-SU4对马铃薯甲虫、大猿叶甲和暗黑鳃金龟幼虫的LC50分别为2.62μg/ml、1.25μg/ml和3.60×108 cfu/g;3A-HBF对马铃薯甲虫、大猿叶甲和铜绿丽金龟幼虫的LC50分别为1.74μg/ml,1.10μg/ml和0.73×108 cfu/g,两株工程菌扩大了对鞘翅目害虫的杀虫谱,具有良好的开发和应用前景。3、Cry8类蛋白杀虫特异性机理的研究:从蛋白的结构、蛋白的活化、蛋白与昆虫体内受体的结合三个方面进行Cry8类蛋白杀虫特异性机理的初步探索。通过结构域互换的方法,得到Cry8Ca2和Cry8Ea1两种蛋白不同结构域组合的8种杂合蛋白,分析8种杂合蛋白对蛴螬的杀虫活性与其结构的对应关系,其中工程菌株HD (3+15()含由Cry8C的DomainⅠ和DomainⅡ及Cry8E的LoopⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因)、HD (7+11) (含由Cry8E的DomainⅠ和DomainⅡ及Cry8C的LoopⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因)、HD (6+10)(含由Cry8E的DomainⅠ和LoopⅠ及Cry8C的DomainⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因)在浓度为1010 cfu /g时,对铜绿丽金龟幼虫的较正死亡率分别为44%、36%和32%。但所有的杂合蛋白都对暗黑鳃金龟幼虫失去了杀虫活性。通过Cry8Ha1、Cry8Ia1、Cry8Ga1和Cry8Ga2四种蛋白被暗黑鳃金龟中肠液与胰凝乳蛋白酶消化,胰凝乳蛋白酶活化的Cry8Ha1蛋白对大猿叶甲幼虫有较高的杀虫活性,而活化的Cry8Ga1、Cry8Ga2和Cry8Ia1蛋白对大猿叶甲幼虫无杀虫活性。用生物素标记的Cry8Ha1和Cry8Ia1蛋白均能与暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟幼虫的BBMV结合,但是这两种蛋白仅对前者具有杀虫活性。
束长龙[8]2013年在《苏云金芽胞杆菌资源多样性分析与杀虫基因发掘》文中进行了进一步梳理苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis， Bt），革兰氏阳性细菌，在芽胞形成期可产生具有杀虫活性的伴胞晶体。Bt晶体主要由cry基因编码的杀虫晶体蛋白组成，在害虫的防治中具有重要作用，有巨大的商业价值，因此发掘新基因并进行知识产权保护是Bt资源研究的重要内容。知识产权作为综合竞争力的重要体现，而目前我国在Bt杀虫基因资源的知识产权方面处于劣势，大部分Bt杀虫基因的专利权掌握在西方各大型农业生物技术企业手中，我国掌握的Bt新的基因发明专利不足60项。高通量测序技术的发展为发掘杀虫基因提供了新思路，成为国内外发掘Bt杀虫基因的主要手段。但是测序价格较高，Bt资源库中存在的冗余菌株会造成较大的资金浪费，目前尚没有便捷的方法去除重复菌株。因此，迫切需要建立可以快速分析比较大量样品的方法，来排除重复菌株，进一步提高杀虫基因发掘效率。本论文在分离1500株Bt菌株的基础上，进一步建立了菌株多样性分析方法，对菌株多样性进行研究，去除冗余菌株，对其中90株菌株进行了杀虫基因测序筛选，主要结果如下：Bt菌株分离与鉴定：杀虫活性评估结果显示多数菌株对鳞翅目害虫有较高活性，1500株测试菌株中，对棉铃虫有活性的菌株有1346株，对玉米螟有活性菌株有813株，而对叶甲类害虫大猿叶甲有活性的菌株较少，只有42株；镜检结果显示不同菌株产生的晶体形状、大小、种类有较大差异，晶体种类主要为菱形，部分为球形和不规则的晶体形状；杀虫晶体蛋白图谱显示大部分菌株表达了130kD蛋白，部分菌株还表达了100Kd、60kD蛋白，具有典型Bt杀虫晶体蛋白的特征；质粒图谱显示不同菌株质粒图谱条带数量和大小都有所不同，并且有部分菌株图谱相似，说明资源库中有冗余菌株。建立Bt菌株多样性分析方法：首先，设计了可以扩增多个基因家族的兼并引物，fastPCR软件分析结果显示该引物可以对超过30种的杀虫基因家族进行较好的扩增，PCR实验检测显示，该引物可以扩增出预期条带但是条带较弱。进一步通过增加侧翼特异序列的办法对兼并引物进行改良，改良后的引物显著提高了扩增效率。同时，还对引物浓度与退火温度进行了优化，利用72个不同血清型的标准菌对优化后的PCR体系进行了评估，结果显示95%以上的菌株都可以获得预期条带；利用含有多个基因的HD12菌株评估了优化后体系对多个基因同时扩增的能力，结果显示优化后的PCR可以从HD12获得9种不同的RFLP类型。这些结果说明优化后的PCR体系具备了cry基因指纹图谱的基本要求。此外，本论文还对Bt基因组提取方法进行了改良，改良后的方法可以提取并获得质量均一的基因组DNA。用改良的PCR体系对Bt基因组进行扩增，并用HinfI对PCR产物进行消化，利用LabChip GX电泳系统进行分析，获得了888个菌株的RFLP图谱。进一步对电泳图谱进行数字化、计算相似性、构建系统发生树分析。结果显示，该方法可以有效分析菌株多样性，去除冗余菌株，获得可用于进一步基因发掘的菌株。90株Bt菌株杀虫基因测序筛选：利用高通量测序技术分析了90株不同的Bt菌株的序列，进一步通过SOAPdenovo软件拼接、GeneMark基因预测、模式杀虫基因数据库及专利数据库blast比对，最终获得全新杀虫基因21个。总之，本论文建立菌株多样性研究方法，解决了冗余菌株会造成资金的浪费的问题，最终完成了“菌株分离去除冗余基因测序筛选”这一杀虫基因高通量发掘平台的构建，为提升我国在Bt资源发掘中的竞争力提供了重要保障。
刘云飞[9]2012年在《苏云金杆菌高效菌株的筛选及固体发酵研究》文中进行了进一步梳理苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前应用最广研究最深入的生防微生物。但是Bt制剂在应用过程中仍存在杀虫谱窄、抗逆性差、防治成本偏高等缺点,限制了其进一步扩大应用。为了得到具有应用潜力的自然菌株,本实验室利用分子鉴定的方法,前期筛选得到两株基因型丰富的苏云金杆菌野生菌株Bt CYZ-4和Bt S-19,通过基因型分析,预测其可能为杀虫广谱的野生株。本研究利用生物测定方法系统研究了两菌株对7种常见农林害虫和卫生害虫的毒力及对紫外线和高温等不良环境条件的抗逆能力,同时,对Bt与化学药剂的协同作用方式进行了探索实验。得到了杀虫谱广、抗逆性强的Bt CYZ-4菌株,为了降低生产成本,对Bt CYZ-4菌株的低成本固体发酵技术进行了系统研究;得到以下主要结果:1.两菌株杀虫广谱,但因基因型不同对不同害虫活性表现出差异。室内生物测定结果表明,Bt CYZ-4菌株对粘虫(Mythimna separata)初孵幼虫48h的LC_(50)为6.6×10~6 cells/mL,对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、淡色库蚊(Culex pipiens paliens)初孵幼虫和美国白蛾(Hyphantria cunea (Drury)、苹掌舟蛾(Phalera flavescens)、杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)二龄幼虫72h的LC_(50)分别为4.7×10~6 cells/mL、2.25×10~5 cells/mL、2.01×10~5 cells/mL和2.9×10~6 cells/mL、6.6×10~7 cells/mL、1.7×10~6 cells/mL;相同处理的Bt S-19菌株对上述害虫的LC_(50)则依次为3.1×10~7 cells/mL、9.0×10~6 cells/mL、4.1×10~4 cells/mL、3.5×10~4 cells/mL和1.8×10~5 cells/mL、1.7×10~6 cells/mL,对杨扇舟蛾活性较差,这两株菌对美国白蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾和淡色库蚊均表现出了很强的杀虫活性。Bt CYZ-4菌株对粘虫、棉铃虫、杨扇舟蛾和苹掌舟蛾的活性高于Bt S-19菌株,而对美国白蛾、甜菜夜蛾和淡色库蚊则表现了相反的趋势。2. Bt CYZ-4菌株抗逆性优于Bt S-19。研究了温度,紫外线处理不同时间两菌株对美国白蛾幼虫活性的变化。分别采用30℃,33℃,37℃,42℃温度梯度处理及30min,60 min,120 min,180 min ,240min和360 min不同处理时间,结果表明两株菌在高温处理下,随着温度的升高和处理时间的延长,活性均呈现出下降趋势。但Bt CYZ-4抗高温的能力明显高于Bt S-19;两菌株紫外线处理随着照射时间的延长,杀虫活性也均明显降低,Bt CYZ-4经紫外线照射6h,二龄美国白蛾幼虫平均校正死亡率为56.7%,活性降低了40%。Bt S-19经紫外线照射6小时,二龄美国白蛾幼虫平均校正死亡率为13.33%,活性降低了81.67%。说明Bt CYZ-4抗紫外线能力明显高于Bt S-19;综合而言,Bt CYZ-4菌株抗逆性优于Bt S-19,应用潜力较大。3.得到了以玉米淀粉和玉米芯为基质的Bt CYZ-4菌株低成本固体发酵配方。参考LB培养基C源、N源和矿质元素的组成及比例,通过单因子优化和正交试验,得到了以玉米淀粉为碳源的固体发酵配方,各成分含量为:玉米淀粉1%、氮源A 0.5%、氮源B 2%、酵母粉0.1%、K_2HPO_4 0.075%、MgSO_4 0.035%、CaCO_3 0.05%。利用此培养基,按照4%接种量,30℃发酵培养6d,孢子浓度可达到5×10~9cells/mL;在上述矿质元素含量,接种量,pH不变的情况下,30℃发酵培养6d,以单一玉米芯为培养基质发酵培养Bt CYZ-4菌,含水量为70%时孢子浓度最大。以玉米芯、氮源A和氮源B为基质,按玉米芯7.2g、氮源A 3g、氮源B 3.2g、蒸馏水23.3g时孢子浓度最高,可达到1.6×10~(10)个/g。上述两配方发酵产物浓度优于文献报道的固体发酵水平。4.苏云金杆菌Bt S-19与高效氯氰菊酯协同作用方式为Bt预处理。采用Bt预处理及直接混用2种方式施药,室内饲毒法测定了2种药剂对美国白蛾2龄幼虫的活性。结果表明:试虫先用每mL含l×10~6个/mL孢子的Bt S-19菌悬液预处理,1d后再用系列浓度的高效氯氰菊酯处理,其48 h的LC_(50)值为0..76 mg/L,而未经预处理,仅用高效氯氰菊酯处理48 h的LC_(50)值为1.28 mg/L;2种处理在高效氯氰菊酯质量浓度为2. 25 mg/L时对试虫的半致死时间(LT_(50)值)分别为9. 2 h和34. 7 h,两者间增效作用明显。对于直接混用,采用1 x 106个/mL的Bt S-19与6 mg /L的高效氯氰菊醋混剂处理,增效作用明显,72 h的共毒系数为122. 5,此后再增加高效氯氰菊酯的浓度则表现出轻微的桔抗作用。说明先用Bt预处理后再使用高效氯氰菊酯对美国白蛾的作用效果优于二者直接混用。
关鹏[10]2013年在《苏云金芽胞杆菌MC28基因组完成图及其杀虫功能基因研究》文中研究指明苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis,Bt)MC28是从四川盆地沐川原始森林土壤中分离得到的,能在芽胞形成期产生大量球形伴胞晶体蛋白,对鳞翅目和双翅目昆虫具有明显的杀虫活性。前期研究采用PCR-RFLP (restricted fragment length polymorphisms, RFLP)鉴定方法从MC28中鉴定并克隆了5个杀虫晶体蛋白基因cry30Fa1、 cry53Ba1、cry54Aa1和cyt2Aa3),其中cry54Aa1编码蛋白对棉铃虫Helicoverpa armigera, Lepidoptera)、甜菜夜蛾(Laphygma exigua, Lepidoptera)和伊蚊(Aedes aegypti, Diptera)具有特异的杀虫活性；cry30Fa1编码蛋白对水稻褐飞虱(Nilaparvata lugens, Homoptera)具有特异的杀虫活性。为了研究MC28的基因组结构和进化特点,我们采用Illumina GA Ⅱ测序技术对MC28菌株进行全基因组测序。全基因组测序获得原始reads并过滤得到18,324,961个双末端reads,其对基因组的覆盖度达到451倍。采用SOAPdenovo组装软件将大约97.13%的reads组装成113个scaffolds。通过PCR、长片段PCR扩增以及构建Fosmid文库等策略对Scaffold内部和scaffold之间的gaps进行补洞,最终获得大小为6.68Mb的基因组完成图。利用Glimmer3.02对Bt MC28全基因组进行基因的预测,然后使用blast软件,将预测得到的蛋白序列与NR库进行比对,选择最好的比对结果作为相对应蛋白的注释,最终,MC28基因组总共注释得到6,555个蛋白。采用perl+SVG工具对Bt MC28和BtCT43及Bt YBT-020分别做共线性分析,结果表明：MC28与CT-43及YBT-020具有非常相似的基因组结构和共线性关系。采用MEGA和SplitsTree软件分别对Bt MC28和其它相关菌株构建系统发育树,两个结果均表明：Bt MC28菌株同其它Bt菌株在进化上距离较远,而是同Be Rock3-28、Bc Rock4-18、Bc Rock1-3和Be Rock3-29处在一个独立的分支上Bt MC28全基因组由8个环状复制子构成(1个染色体DNA和7个内生质粒),总长为6.68Mb。其中环状染色体DNA长度为5,414,461bp,编码5,279个预测的开放阅读框(ORFs),染色体DNA的G+C的百分含量为35.41%；7个环状内生质粒分别为pMC8、pMC54、pMC95、pMC183、pMC189、pMC319和pMC429,这些质粒共编码1,278个预测的开放阅读框(ORFs),其G+C的百分含量在32.11%和34.78%之间。Bt MC28基因组共编码74个tRNA和45个rRNA。通过Bt MC28全基因组测序,我们从中发现了3个编码杀虫晶体蛋白基因的质粒,而且从这些质粒上发现了6个新型的杀虫晶体蛋白基因分别为cry54Ab1、cry68Aa1、cry69Aa1、cry69Aa2、cry70Ba1和cyt1Da1,至此在Bt MC28菌株中共得到11个新型杀虫晶体蛋白基因。其中质粒pMC189上共携带了7个杀虫晶体蛋白基因分别为cry30Fa1、cry53Ab1、cry54Aa1、cry54Ab1、cry68Aa1、, cyt1Da1和cyt2Aa3；而质粒pMC95上共携带有3个杀虫晶体蛋白基因分别cry4Cc1、 cry69Aa1和cry70Ba1;质粒pMC183上仅含有一个与cry69Aa1同源性为96.2%的杀虫晶体蛋白基因cry69Aa2。cry68Aa1、cry70Ba1和cyt1Da1的长度分别为2,511bp、2,427bp和1,527bp。为了研究这三个基因编码蛋白的杀虫活性,我们通过PCR扩增将这三个基因分别插入到原核表达载体pET-28a中,再转入到原核表达感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,通过IPTG诱导表达,cry68Aa1, cry70Ba1和cyt1Da1基因分别产生约95kDa、90kDa和60kDa的表达产物,这与其预测表达蛋白的大小一致。生物活性测定结果表明：Cry68Aa1和Cry70Ba1均只对鳞翅目的甜菜夜蛾幼虫具有杀虫活性,其LC50分别为20.16μg/ml(95%的置信区间为16.34-35.72μg/ml)和30.22μg/ml(95%的置信区间为27.15-36.53μg/ml)，而两者对鳞翅目的棉铃虫和双翅目的蚊虫无杀虫活性；Cyt1Da1对所测的昆虫均无杀虫活性。cry69Aa1基因全长为3,651bp,编码1,216个氨基酸,其预测编码蛋白大小约为137.1kDa,与已知的Cry4Ba蛋白的同源性最高,但仅为39%。比较结果表明：Cry69Aa1和已知大分子量的Cry蛋白均含有8个保守区域(见图5-1),因此,Cry69Aa1蛋白属于大分子量Cry蛋白中的一类新型Cry蛋白。为了研究cry69Aa1基因编码蛋白的杀虫活性,我们将扩增得到cry69Aa1全长基因插入到穿梭载体pSTK中,再转入到Bt无晶体突变株HD73-中。重组菌株的扫描电镜(SEM)观察结果表明：cry69Aa1在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,能够形成大量的球形伴胞晶体。生测结果表明：重组菌株的芽胞晶体混合物对双翅目的致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)幼虫具有明显杀虫活性,其LC5o为23.7μg/ml,95%的置信区间为20.5-26.4μg/ml。cry54Ab1操纵子是由两个相同编码方向的ORFs组成的,第一个ORF是与ory54A类似的cry基因,长度为2,232bp,其编码743个氨基酸,预测编码蛋白分子量84.5kDa,根据编码蛋白的同源性,这个cry基因被命名为cry54Ab1;第二个ORF位于cry54Ab1的下游,两者之间被一个长67bp的非编码区所间隔,这个ORF在本研究中暂命名为orf2基因,该基因长1,524bp,编码503个氨基酸,其预测蛋白分子量为58.2kDa。为了研究cry54Ab1操纵子的杀虫活性,我们将cry54Ab1基因、orf2基因以及完整的cry54Ab1操纵子通过PCR扩增后分别插入到穿梭载体pSTK上,再转入到Bt无晶体突变株HD73-中表达。重组菌株的扫描电镜观察表明：当完整的cryS4Ab1操纵子在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,能够形成大量的球形伴胞晶体；当cry54Ab1基因或orf2基因单独在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,均不能形成伴胞晶体。SDS-PAGE电泳分析结果表明：完整的cry54Ab1操纵子在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,两个ORFs均能够大量表达,然而当cry54Ab1基因和orf2基因单独表达时,两个基因的表达量非常低,尤其是orf2基因几乎不表达。另外生测结果表明：完整的cry54Ab1操纵子和cty54Ab1基因的表达产物均对双翅目的致倦库蚊有杀虫活性,但是完整的cry54Ab1操纵子表达产物的杀虫活性是cry54Ab1基因单独表达时的杀虫活性的10倍之多。由以上结果可知,orf2基因的表达不仅能够使Cry54Ab1蛋白形成球形伴胞晶体,而且能够提高Cry54Ab1蛋白的杀虫活性。
参考文献：
[1]. 苏云金芽胞杆菌对鳞翅目昆虫广谱高毒基因工程菌的构建[D]. 鲁松清. 华中农业大学. 1999
[2]. 苏云金芽胞杆菌抗病杀虫和广谱工程菌的构建[D]. 朱晨光. 华中农业大学. 2003
[3]. 苏云金芽胞杆菌新异杀虫晶体蛋白基因的克隆与基因工程菌WG-001的安全评估[D]. 张振宇. 华中农业大学. 2005
[4]. 苏云金芽胞杆菌抗病工程菌的构建[D]. 周臣飞. 华中农业大学. 2007
[5]. 苏云金芽胞杆菌HBF-18菌株毒力相关基因的克隆与活性研究[D]. 张彦蕊. 中国农业科学院. 2012
[6]. 四川生态区苏云金芽胞杆菌资源的筛选鉴定及其新型杀虫基因的克隆表达研究[D]. 谭芙蓉. 四川农业大学. 2008
[7]. 对金龟甲科、叶甲科害虫高毒力苏云金芽胞杆菌杀虫基因及工程菌的研究[D]. 闫贵欣. 中国农业科学院. 2009
[8]. 苏云金芽胞杆菌资源多样性分析与杀虫基因发掘[D]. 束长龙. 东北农业大学. 2013
[9]. 苏云金杆菌高效菌株的筛选及固体发酵研究[D]. 刘云飞. 河北农业大学. 2012
[10]. 苏云金芽胞杆菌MC28基因组完成图及其杀虫功能基因研究[D]. 关鹏. 四川农业大学. 2013