（1．湖南省衡阳市中医医院 湖南衡阳 421001；
2.健康元药业集团股份有限公司 广东深圳 518000；3南华大学医学院）
摘要：目的 建立高效液相色谱法（HPLC），用于测定三七黄芪颗粒中丹参素的含量。方法 采用YMC Triart C18（4.6mm*250mm，5um）高效液相色谱柱，流动相为甲醇-1%乙酸（10：90），流速为1.0mL/min，检测波长280nm。结果 线性回归方程为y=750.96x+3.5891（r=0.999），丹参素0.0793~0.7934ug范围内与峰面积呈现良好的线性关系，准确度平均回收率为98.3%（RSD为1.5%，n=6）。结论 本方法简便、快速、准确，可用于三七黄芪颗粒中丹参素的含量测定。
关键词：高效液相色谱法；丹参素；含量测定
[Abstract] Objective：To establish a method to determine sodium danshensu in Sanqihuangqi Keli by HPLC. Method：Column：YMC Triart C18（4.6mm*250mm，5um）；Mobile phase：methanol-1% acetic acid（10：90）；Flow rate：1.0mL/min；Detective wabelength：280nm. Result：The regression equation was y=750.96x+3.5891（r=0.999），The content of danshensu showed good linearity in the range of 0.0793~0.7934ug，The averaging accuracy of content’s was 98.3%（RSD=1.5%，n=6）. Conclusion：The method is found to be simple，quick，accuracy，it can be used as a standard of determining the concentration of sodium danshensu in Sanqihuangqi Keli.
Key Words：HPLC Danshensu Content determination
三七黄芪颗粒是由三七、丹参、黄芪、枸杞子等组成，经提取、浓缩、干燥、制粒、包装的工序制成颗粒剂。本方中的丹参采取的是水提工艺，因此选择水溶性成分丹参素作为质控成分。研究表明，丹参素具有很强的生理活性[1-3]，具有抗血小板和解聚的作用，是丹参活血化瘀的主要有效成分。据文献报导，丹参素的含量测定方法有薄层扫描法[4]、高效液相色谱法[5-7]等，近年来有关丹参素含量测定方法研究较少，尤其是制剂中丹参素的含量测定。本方法选用高效液相色谱法，通过参考文献[5-7]，对三七黄芪颗粒丹参素含量测定方法中的色谱条件、提取溶剂、提取时间、溶剂体积等进行考察，筛选最优方法，并对该方法进行分析方法验证。
1.材料与方法
1.1仪器
Agilent1260高效液相色谱仪（配备二级阵列管检测器）、超声波清洗器、梅特勒-托利多XSE 205电子分析天平
1.2试剂和试药
丹参素钠对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号：110855-201614），三七黄芪颗粒（批号：20170501）、甲醇（分析纯、色谱纯）、乙酸（36%）、高纯水
1.3试验方法
1.3.1色谱条件 色谱柱：YMC Triart C18（4.6mm*250mm，5um）高效液相色谱柱；流动相：甲醇-1%乙酸（10：90）；检测波长：280nm；进样量：10uL；理论板数按丹参素计应不低于3000。
1.3.2丹参素对照品溶液的制备 精密称取丹参素钠对照品适量，加甲醇配制成0.1mg/mL的对照品储备液。精密移取对照品储备液加水配制成0.04mg/mL的溶液，即得。
1.3.3供试品溶液的制备 取三七黄芪颗粒适量，研细，精密称取1.0g，至25mL棕 色容量瓶中。加水适量使完全溶解，并定容至刻度，摇匀，用0.45um滤膜滤过，即得。
1.3.4阴性溶液的制备 按产品配方除丹参以外的其他成分，按三七黄芪颗粒制得丹参阴性样品溶液。取阴性提取液2mL，按1.3.3供试品配制方法配制阴性溶液。
2.方法学考察[8]
2.1专属性试验
分别取对照品溶液、丹参阴性样品溶液、供试品溶液按1.3.1项下色谱条件分别进行测定，记录色谱图。结果在供试品溶液色谱图中，存在于与丹参素钠对照品溶液色谱峰保留时间相同的色谱峰，且阴性溶液在相同保留时间位置未出现色谱峰，表明本方法专属性好，阴性样品没有干扰。供试品中，丹参素与相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论板数按丹参素计符合要求。见图1。
A.对照品溶液；B.丹参阴性溶液；C.供试品溶液
图1 HPLC色谱图
2.2精密度试验
精密吸取丹参素钠对照品溶液10uL，重复进样6次，记录峰面积。峰面积RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。
2.3稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0，4，8，12，16h时，分别吸取10uL进样，测定峰面积。结果峰面积RSD为0.5%，表明供试品溶液在16小时内稳定，表明该方法的稳定性较好。
2.4重复性试验
取同一批三七黄芪颗粒样品，精密称取5份，依上述方法测定丹参素含量，含量RSD为1.8%，表明本方法重复性良好。
2.5线性考察
分别取精密吸取丹参素钠对照品溶液2μl、5μl、10μl、15μl、20μl（相当于丹参素0.0793μg、0.1984μg、0.3967μg、0.5951μg、0.7934μg）注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积A对含量C进行线性回归，得到回归方程y=750.96x+3.5891（r=0.999，n=5）。结果表明，丹参素在0.0793~0.7934ug范围内与峰面积成良好的线性关系。
2.6准确度（回收率）试验
精密称取已知含量的本品（批号：20170501，含量为149.2mg/100g）1.0g，加水适量使溶解，加入对照品储备液8mL，混匀，按“供试品溶液的制备方法”配制。同法操作6份，结果见表1。
3.结论
本法用于测定三七黄芪颗粒中的丹参素钠，精密度高，准确度好，方法稳定，且良好的保留时间使丹参素与杂质彻底分离，达到分离度要求，测定结果可靠，可作为丹参素钠的含量测定的有效方法。
4.讨论
4.1对照品溶液配制方法的考察
丹参素对照品溶液使用甲醇作为溶剂时，色谱峰会出现严重的前延使峰形不对称。而改用水配制后峰前延消失。但用水配制对照品溶液不利于保存，最终，丹参素对照品溶液采用二步稀释的方法，先用甲醇配制成对照品储备液，再用水稀释后进样。最终，峰前延现象得以解决。
4.2流动相的选择
丹参素属于有机酸类，流动相中酸度的大小对丹参素的保留时间及峰形均有影响。本实验设计了甲醇-1%乙酸（10：90）[5]、甲醇-0.2%冰醋酸（1：5）[6]、甲醇-0.5%冰醋酸（16.7：83.3）[7]进行考察。结果表明，甲醇-1%乙酸（10：90）为流动相可将丹参素与其他组分分离，且峰形对称，保留时间合理，系统适用性均能达到要求。
4.3提取溶剂的选择
丹参素的解离与酸度有关，而供试品中杂质的溶出量与甲醇的浓度有关，因此，分别考察以水、1%乙酸、甲醇、50%甲醇、甲醇-1%乙酸（1：1）为供试品的提取溶剂，考察最佳提取溶剂。考察结果表明，杂质方面，水、1%乙酸杂质情况接近，最大峰高小于60；甲醇、50%甲醇、甲醇-1%乙酸（1：1）杂质情况接近，最大峰高大约在150，各溶剂的杂质均不干扰丹参素的定量检测。含量方面，除使用甲醇作为溶剂处理的样品含量明显偏小外，其他各溶剂含量基本一致，基于环保无害的原则，选择水作为本方法的溶剂。
4.4提取时间的选择
由于三七黄芪颗粒的制备过程添加了辅料，对主药进行赋形与稀释，因此可能对供试品的提取过程带来一定的影响。本实验对供试品的前处理采用超声的形式助溶，考察不超声、超声处理10min、20min、30min、40min对提取效果的影响。结果表明，供试品超声与否及超声时间长短对含量影响不大，说明供试品在水中能快速完全溶解，因此，供试品的处理过程不需要超声处理。
4.5创新点
优化了丹参素钠对照品溶液的配制方法，解决了对照品溶液在进样过程中出现的前沿峰问题，提高检测准确性。且在本文研究中，采用了无毒无害的水作为提取溶剂，通过考证流动相的酸浓度，调整目标峰的保留时间，使之与相邻峰之间的分离度符合要求，为三七黄芪颗粒的质量控制提供很好的参考作用。
参考文献
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[7] 李桃，王春娥.高效液相色谱法测定丹参药材中丹参素的含量[J].中国医院药学杂志，2005，25（9）：832-833
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论文作者:刘琪1,刘娟2,曾菊香2,成烨2,侯懿峰2,邹娟3
论文发表刊物:《航空军医》2019年5期
论文发表时间:2019/7/23
标签：丹参论文; 溶液论文; 甲醇论文; 色谱论文; 黄芪论文; 含量论文; 方法论文; 《航空军医》2019年5期论文;