吴菲菲[1]2013年在《鹿角盘提取物的体外抗骨质疏松作用》文中指出骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构退行性改变,骨的脆性增加,易于发生骨折为特征的全身代谢性骨骼疾病,多发于绝经后妇女及老年人。骨质疏松性骨折发病率高,严重威胁着人们的生命健康,并给社会和国家带来了沉重的经济负担。目前,用于治疗骨质疏松症的西药,如鲑鱼降钙素、双膦酸盐类和重组人甲状旁腺素等,具有明显的副作用且价格昂贵。因此,研究开发安全、高效、经济的抗骨质疏松症药物已成为目前的研究热点。据《神农本草经》记载,鹿角盘具有温补肝肾、强筋健骨、活血消肿等作用。经我们课题组前期的体内实验研究发现,鹿角盘微切助粉对去卵巢大鼠绝经后骨质疏松症模型有明显且良好的治疗效果。但是,关于鹿角盘防治骨质疏松症的作用机制至今仍未有报道。因此,本论文旨在系统地研究鹿角盘提取物对体外培养的成骨细胞骨形成功能和破骨细胞骨吸收活性的影响,并进一步探讨其防治骨质疏松症的作用机制。具体研究内容和结果如下：(1)采用微切变-助剂互作技术加工制备鹿角盘微切助粉。然后经粒径分析及扫描电镜观察分析细胞的破碎程度,并检测其中与骨质疏松症相关的活性物质的含量。粒径分析及扫描电镜观察结果显示,经微切变-助剂互作技术处理后,鹿角盘微切助粉在粒径1-30μm范围内的颗粒数占82.73%,且细胞已被充分破碎,细胞内有效成分被暴露出来,呈释放的状态。活性物质含量分析结果显示,鹿角盘微切助粉中含有328.79士34.21pmol/L雌二醇、25.38士4.48nmol/L睾酮、17.56士3.45nmol/L孕酮,0.750±0.033μg/g类胰岛素生长因子-1,16.17±0.52mg/L柠檬酸钙和133.6±13.55mg/L钙,而不含有延胡索酸钙。且这些活性物质的含量均高于其粗粉,说明微切变-助剂互作技术增加了目标活性物质的溶出量,有利于鹿角盘中活性成分的释放,体现了该技术的优越性。(2)以人类成骨样细胞MG-63为研究对象,系统地研究了鹿角盘提取物(水提物和醇提物)对成骨细胞生长、分化和矿化的影响及其防治骨质疏松症的可能作用机制。LDH活性检测和细胞形态观察结果表明,鹿角盘提取物对成骨细胞没有细胞毒性作用。采用结晶紫试验、中性红吸收试验、台盼蓝排斥试验、MTT法和ALP活性检测考察细胞的生长和分化情况。结果表明,鹿角盘提取物不仅刺激了成骨细胞的生长和增殖,而且还促进了成骨细胞的分化。此外,茜素红-S染色和4-羟脯氨酸含量的检测结果显示,鹿角盘提取物是通过促进钙的沉积和增加Ⅰ型胶原蛋白的合成和分泌,促进矿化骨基质的形成,从而发挥促进骨形成的作用。采用ELISA法和RT-PCR分别检测了OPG和RANKL的蛋白含量和mRNA的表达量,结果显示,鹿角盘提取物极显着地增加了成骨细胞中OPG蛋白含量和OPG mRNA的表达量,而降低了RANKL蛋白含量和RANKL mRNA的表达量,提高了成骨细胞中OPG/RANKL的比值,间接地抑制破骨细胞的分化和成熟,从而起防治骨质疏松症的作用。(3)以RAW264.7细胞作为一种破骨前体细胞模型,诱导其分化成破骨细胞,并研究鹿角盘提取物对破骨细胞的形成和骨吸收活性的影响。TRAP染色和破骨细胞计数结果显示,用50ng/mL RANKL成功地诱导RAW264.7细胞分化成为成熟的破骨细胞。而且鹿角盘提取物可剂量依赖性地减少破骨细胞的数量,降低破骨细胞中TRAP的活性,从而抑制了RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成成熟的破骨细胞。LDH活性检验、PI染色和DNA碎片定量分析结果一致表明,鹿角盘提取物是通过诱导成熟的破骨细胞发生凋亡而抑制其活性。而且,RT-PCR检测结果表明鹿角盘提取物是通过下调破骨细胞表型基因TRAP mRNA和MMP-9mRNA的表达,来抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性,从而起防治骨质疏松症的作用。(4)采用p38特异性抑制剂SB203580干预处理MG-63成骨细胞,进一步验证鹿角盘提取物的抗骨质疏松作用机制。用p38特异性抑制剂SB203580干预处理成骨细胞,然后采用MTT法、ALP法、茜素红-S染色和4-羟脯氨酸含量的检测分别评价SB203580对成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响。结果表明,SB203580可以有效地阻断鹿角盘提取物对成骨细胞增殖、分化和矿化骨基质形成的促进作用。而且,用ELISA法和RT-PCR检测OPG和RANKL蛋白含量和基因的表达,结果显示鹿角盘提取物上调了OPG蛋白和mRNA的表达,下调了RANKL蛋白和mRNA的表达,且通过调控成骨细胞中OPG和RANKL的表达,间接地抑制破骨细胞的分化和成熟。而SB203580能有效地阻断鹿角盘提取物对破骨细胞的抑制作用,提示鹿角盘提取物是通过调控p38MAPK信号通路,双向影响成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡,从而起抗骨质疏松的作用。综上所述,本研究证实了鹿角盘提取物是通过调控p38MAPK信号通路来促进成骨细胞的骨形成和抑制破骨细胞的骨吸收,从而起抗骨质疏松的作用,为鹿角盘用于治疗骨质疏松症提供了理论依据。
顾伟伟[2]2017年在《应用成骨细胞生物色谱法研究牡丹皮促进骨折愈合的效应物质》文中认为目的:建立MC3T3-E1成骨细胞固相色谱方法,研究骨折合剂君药牡丹皮促进骨折愈合的效应物质;并应用MC3T3-E1成骨细胞增殖和分化效应验证所得结合物质的活性,为牡丹皮在临床治疗骨折提供实验依据,也为骨折合剂的进一步开发提供基础。方法:采用Agilent5TC-C18色谱柱,0.4%的甲酸水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱,检测波长为254nm,柱温为30℃,进样量为5μL,流速为1mL·min-1,建立牡丹皮水提液的指纹图谱,并对其叁个主要成分没食子酸、芍药苷和丹皮酚进行定量研究。建立MC3T3-E1成骨细胞固相色谱法:采用高温灭菌法处理牡丹皮水提液,药液与MC3T3-E1成骨细胞共同孵育4 h,洗脱4次后将细胞失活,使结合效应成分解离下来,再将细胞进行裂解,使进入细胞内的效应成分释放出来。应用HPLC和HPLC/MS对解离液和裂解液中的物质成分进行分析。采用MTT法和ALP活性测定法,研究筛选出的准活性成分对MC3T3-E1成骨细胞活性的影响。结果:得到10批牡丹皮的对照指纹图谱和共有峰30个,其中4号色谱峰为没食子酸、7号色谱峰为没食子酸甲酯、14号色谱峰为芍药内酯苷、16号色谱峰为芍药苷、21号色谱峰为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(PGG)、30号色谱峰为丹皮酚。各批次牡丹皮水提液的指纹图谱及对照图谱相似度均大于0.9。叁个主成分方法学考察的结果显示:没食子酸、芍药苷和丹皮酚的线性范围分别在1.691～270 μg·mL-1(R2=0.9997)、1.847～250 μg·mL-1(R2=0.9999)、0.181～29.0μg·mL-1(R2=0.9999)与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率(n=3)在94.12%～100.01%;含量测定结果显示,牡丹皮中没食子酸、芍药苷和丹皮酚的平均含量分别为 0.34%、0.54%和 0.0091%,RSD 分别为 5.01%、5.40%和 2.41%。应用MC3T3-E1成骨细胞固相色谱法,筛选分析得到4个主要的准活性成分,其中与细胞膜结合的成分为没食子酸和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(PGG),进入细胞内部的成分为没食子酸甲酯和芍药内酯苷。药理学验证结果显示:0.6～1.6 mg/mL的没食子酸对MC3T3-E1成骨细胞的增殖与分化均具有明显的促进作用(P<0.05,0.001);0.5～1.0 mg/mL的没食子酸甲酯对MC3T3-E1成骨细胞的增殖与分化均具有明显的促进作用(P<0.05,0.01,0.001);4.0 mg/mL的芍药内酯苷对MC3T3-E1成骨细胞的增殖具有明显的促进作用(P<0.05),但0.5～4.0 mg/mL的芍药内酯苷对MC3T3-E1成骨细胞的分化具有抑制作用;1.2mg/mL的1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖对MC3T3-E1成骨细胞的增殖与分化均具有明显的促进作用(P<0.05,0.01)。结论:1)本课题建立的牡丹皮水提液的HPLC指纹图谱,方法简便、重复性好;没食子酸、芍药苷和丹皮酚多成分检测的方法学考察结果表明,该分析方法稳定可靠,为本课题牡丹皮的提取工艺提供质控标准。2)本课题建立的MC3T3-E1成骨细胞固相色谱法通过验证,说明方法可行性,可用于牡丹皮促进骨折愈合成分的筛选。3)通过课题研究,初步确定牡丹皮中促进骨折愈合的效应物质为没食子酸、没食子酸甲酯与1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(PGG)。
高颖[3]2008年在《骨碎补抗骨质疏松活性部位的化学成分研究》文中研究指明槲蕨(Drynaria fortnei(Kunze)J.sm.)为水龙骨科植物,其根茎是中药骨碎补的主要来源之一,主要产于浙江、福建等地。中医辨证施治用于治疗各种原发性骨质疏松症,用以补肾填精,壮腰健骨。其主要成分是以柚皮苷为主的二氢黄酮类化合物,也足骨碎补活血祛淤、接骨疗伤和增强心肌细胞机能的主要活性成分,药用价值很高。通过文献调研,我们发现以往对于本药材植物化学成分的研究主要集中在极性很小的脂溶性成分上,而其他部分的研究报道很少。本课题利用去卵巢小鼠动物实验和体外UMR106细胞增殖实验确定了骨碎补总提取物的活性部位。利用硅胶柱色谱,大孔吸附树脂柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、ODS开放柱色谱、制备Rp-HPLC等手段,从骨碎补60%乙醇提取物大孔树脂50%甲醇水洗脱部分中分离得到15个化合物。综合运用化合物的理化性质及IR、UV、GC-MS、ESI-MS、一维、二维核磁共振谱等光谱学方法确证其结构,分别为:5-乙氧基-2-羟基苯乙酯(1);北美圣草素(2);山柰酚3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(3);山柰酚-7-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(4);3-乙酰胺基-4-羟基苯甲酸(5);原儿茶酸(6);江户樱花苷(7);紫云英苷(8):柚皮苷(9);5,7-二羟基色原酮-7-O-α-L-鼠李糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷(10);山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-7-O-β-D-葡萄糖苷(11);金鱼草素-6-新橙皮糖苷(12);5,7,3',4'-四羟基二氢黄酮-7-O-α-L-鼠李糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷(13);4-O-β-D-吡喃葡萄糖基反式咖啡酸(14);β-谷甾醇(15)。在分离得到的15个化学成份中,化合物1～8,10～14为首次从该属植物中分离得到的。共分离得到黄酮类化合物10个。
王大为[4]2001年在《促进成骨细胞骨形成的中药及其活性成分的研究》文中认为成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，因此刺激成骨细胞骨形成的药物将具有独特的抗骨质疏松的活性。为了筛选和开发新型、高效的防治骨质疏松的药物，本研究首次建立了成骨样UMR106细胞体外培养为抗骨质疏松药物的活性筛选模型。以成骨样细胞的增殖和分化为活性检测指标，成骨样细胞的增殖以MTT法测定，氟化钠为阳性对照药。成骨样细胞的分化采用测定细胞内碱性磷酸酶活性的方法，地塞米松为阳性对照药，同时考察了溶剂乙醇和二甲基亚砜对细胞增殖和分化的影响。 依据传统中医“肾主骨”的理论，选择补肾中药为主要研究对象，考察它们对成骨样细胞骨形成的活性。将中药和一些未作药用的植物的提取物与成骨样细胞体外共同培养，在所研究的15种补肾中药中对成骨样细胞增殖有促进作用的有9种，在所研究的15种其它中药中对成骨样细胞增殖有促进作用的有4种，而对53种还未作药用的植物的活性测试发现只有2种有显着活性；12种中药中有6种能促进成骨样细胞分化。其中有4种补肾中药既能促进成骨样细胞增殖，又能促进成骨样细胞分化，它们是：补骨脂、槲寄生、淫羊藿、川牛膝。 对补骨脂不同极性萃取物进一步进行成骨样细胞增殖和分化活性测试，发现补骨脂乙酸乙酯萃取物为补骨脂中的主要活性部分。又选用雌性大鼠双侧去卵巢所致的骨质疏松模型，依替膦酸二钠盐为阳性药，考察补骨脂乙酸乙酯萃取物对骨质疏松模型大鼠的作用。结果表明，给予补骨脂乙酸乙酯萃取物的大鼠与模型组大鼠相比，骨密度、骨钙含量显着增加。 为了追踪分离补骨脂乙酸乙酯萃取物中的活性成分，本实验采用多种色谱分离技术，以活性测试为导向，结合波谱技术及理化数据，从补骨脂乙酸乙酯萃取物中分离并鉴定了4个活性化合物的化学结构，它们是具有促进细胞增殖和分化作用的补骨脂异黄酮（corylin）和补骨脂二氢黄酮（bavachin），对细胞分化有一定促进作用的异补骨脂素（isopsoralen）和补骨脂素（psoralen）。 由于补骨脂中黄酮类化合物的分析测定未见报道，因此，本研究首次建立了同时测定补骨脂中补骨脂异黄酮和补骨脂二氢黄酮的HI，LC分析方法。色谱靴为：ODS柱，流动相：甲醇20 nnnoM醋酸铰缓冲液，pH4刀的733，州；流速：0．SInljlnin；检测波长：240nln。本实验采用普通回流6小时后用乙酸乙酪苹取叁次的样品制备方法，以补骨脂二氢黄酮和补骨脂异黄酮计RSD分别为3＊％和3．6％，回收率分别为94．9％和96．2％。并对8个不同产地的补骨脂药材中补骨脂二氢黄酮和补骨脂异黄酮进行了含量测定。 此外，本研究考察了一些黄酮类化合物对成骨样细胞的作用。结果发现：中药淫羊蕾中的主要成分淫羊蕾昔及其大鼠体内主要代谢物淫羊霍次苦H具有类似的作用，可显着促进成骨样细胞的增殖：中药懈寄生总黄酮对成骨样细胞的增殖有一定的促进作用，并可显着提高细胞内ALP活性；大豆昔元及其衍生物对U’MR106细胞的增殖作用不明显。对于中药补骨脂中分离的两个促成骨样细胞增殖的活性成分补骨脂H氢黄酮和补骨脂异黄酮，采用 Western blotting的方法考察不同时间对 U’MR106细胞周期蛋白 CyClin E的表达，结果它们对 CyClinE的表达没有显着影响。 本实验所建立的细胞培养方法具有快速、所需样品量少和作用直接的优点，尤其适用于中药中微量成分的药效及活性成分的追踪研究，而且动物体内实验结果证实了本方法的可靠性，为从天然药物中寻找和开发新型有效的防治骨质疏松的药物提供了一种便捷的手段。大量中药及植物促进成骨样细胞骨形成活性筛选结果表明，补肾中药的“壮骨”作用可能与其对成骨细胞活性的促进作用有关，中药补骨脂中的黄酮成分可能具有防治骨质疏松的活性。
孟繁浩[5]2004年在《中药精选小复方骨疏丹促成骨细胞骨形成作用的研究》文中研究指明“骨疏丹”处方是基于传统中医学和现代医学对骨质疏松症的认识，利用“中药小复方精选系统操作技术平台”及“《普济方》数据库管理系统”精心拟定而成。骨疏丹方剂由淫羊藿、蛇床子、骨碎补和丹参四味中药组成。 本论文首先建立了君药淫羊藿中3种有效成分--淫羊藿苷、朝藿定B和朝藿定C同时定量的分析方法。采用高效液相色谱法，色谱柱为Hypersil BDS C_(18)，流动相为乙腈-醋酸水溶液(pH 3.0，25：75，ν/ν)，检测波长为260nm，流速为1.0mL·min~(-1)，内标为甲氧苄啶，测定了16个不同产地不同品种淫羊藿药材中淫羊藿苷、朝藿定B和朝藿定C的含量。结果表明：淫羊藿苷、朝藿定B和朝藿定C分别在0.21～172μg·mL~(-1)、0.18～144μg·mL~(-1)和0.16～132μg·mL~(-1)范围内，线性良好(r≥0.9996)；平均回收率分别为97.2％、98.0％和98.7％；RSD分别为2.0％、2.1％和1.9％(n=9)。不同产地不同品种淫羊藿药材中各成分的含量差别较大。其次，建立了臣药蛇床子中蛇床子素和欧前胡素2种成分同时定量的分析方法。采用高效液相色谱法，Kromasil C_8为色谱柱，甲醇-水(65：35，ν/ν)为流动相，检测波长为310nm，流速为0.8mL·min~(-1)，醋酸氟轻松为内标，测定了13个不同产地蛇床子药材中蛇床子素和欧前胡素的含量。结果表明：蛇床子素和欧前胡素分别在13～208mg·mL~(-1)和8～128mg·mL~(-1)范围内，线性良好(r≥0.9998)；平均回收率分别为98.2％和97.5％；RSD分别为1.7％和2.0％(n=9)。不同产地蛇床子药材中各成分的含量差别较大。再次，建立了臣药骨碎补中柚皮苷和新北美圣草苷2种成分同时定量的分析方法。采用高效液相色谱法，Hypersil ODS_2为色谱柱，乙腈-水(20：80，ν/ν)为流动相，检测波长为283nm，流速为1.0mL·min~(-1)，测定了7个不同产地骨碎补药材及5个易混品或伪品中柚皮苷和新北美圣草苷的含量。结果表明：柚皮苷和新北美圣草苷分别在10～400mg·mL~(-1)和12～480mg·mL~(-1)范围内，线性良好(r≥0.9997)；平均回收率分别为100.0％和99.4％；RSD分别为1.4％和2.0％(n=9)。骨碎补正品与易混品或伪品中的成沈阳药科大学博士学位论文摘要分差异很大。 成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，因此刺激成骨细胞骨形成的药物将具有独特的抗骨质疏松的活性。本论文应用本实验室建立的成骨样细胞UMR106活性检测技术，以促进成骨细胞增殖和分化的作用为活性检测指标，利用正交试验设计法对骨疏丹方剂进行了拆方研究，考察了16个子方对成骨样细胞UMR106的作用，从细胞水平确证了骨疏丹处方中四种单味药之间君臣佐使的配伍作用，确定了骨疏丹最佳组方为淫羊蓉:蛇床子:骨碎补:丹参(2:1:1:1)。并且采用成骨样细胞UMR106体外共培养的方法，从多个侧面考察了骨疏丹方剂促成骨细胞的活性作用。结果表明骨疏丹方剂的75%乙醇提取液在试验的浓度范围内，具有显着的促细胞增殖和分化作用，当浓度为1.0x10-amg’mL一，时，增殖率为46.8%;当浓度为1 .ox 10一mg’mL一时，分化提高率为40.1%。 中药的活性成分(群)是中药防治疾病的物质基础，在骨疏丹方剂促成骨样细胞增殖和分化活性研究中，发现不同的药物具有不同的作用特点，说明成骨样细胞的增殖分化与细胞培养液中药物的成分有关。采用多种色谱分离技术，以活性测试为导向，对君药淫羊蓝的主要活性部位正丁醇层、臣药蛇床子的主要活性部位氯仿层和骨碎补的主要活性部位正丁醇层分别进行了活性成分的追踪分离，结果表明:淫羊落昔、朝蓝定B和朝菠定C等黄酮类化合物是淫羊蓝中的主要活性成分(群);蛇床子中的主要活性成分(群)是香豆素类化合物，蛇床子素、欧前胡素和香柑内醋具有显着的促进成骨样细胞增殖和分化作用;新北美圣草昔和抽皮昔是骨碎补中促成骨样细胞增殖的主要活性成分(群)。 本论文对骨疏丹方剂的提取工艺与质童控制方法进行了研究。采用正交试验设计法，以淫羊茗昔、蛇床子素、抽皮昔和丹参酮11^的含量以及浸膏重量为评价指标，对提取溶剂用量、提取溶剂浓度和提取时间叁个因素进行优化，确定了骨疏丹方剂的最优提取工艺为:12倍量75%乙醇为提取溶剂，提取3次，每次90分钟。采用薄层色谱法对骨疏丹方剂进行了定性鉴别，斑点清晰，专属性好。采用高效液相色谱法建立了骨疏丹方剂中淫羊蕃昔、蛇床子素、袖皮昔和丹参酮H^的含量测定方法，结果表明:淫羊蓝营、蛇床子素、抽皮昔和丹参酮11^分别在11.5一115林g·mL’l、38.5礴62林g·mL”、15.0一299林g·mL一1和1.90一3.80陀.mL’’范围内，线性良好(;多0.9998);平均回收率分别为99.4%、99.2%、99.1%沈阳药科大学博士学位论文摘要和97.8%;RSD分别为1 .7%、1 .6%、2.2%和2.4%(n=9)。本研究为骨疏丹方剂的质量控制提供了定性、定量分析依据。 选用双侧去卵巢所致雌性大鼠骨质疏松模型，骨疏康颗粒为阳性药，考察了骨疏丹方剂的骨质疏松作用。给予骨疏丹方剂后，与模型组的大鼠相比，高剂量给药组大鼠的骨密度和骨强度明显增加，血清ALP活性明显降低，血清骨钙素、?
熊志立[6]2003年在《青娥方促进成骨细胞骨形成活性成分的相关研究》文中研究指明成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，因此刺激成骨细胞骨形成的药物将具有独特的抗骨质疏松的活性。为了开发新型有效的防治骨质疏松的药物，促进防治骨质疏松症复方中药的现代化，本研究以中医“肾主骨”理论为指导，选用了《太平惠民和剂局方》中收载的补肾壮骨经典方——青娥方作为研究对象，采用与国际标准成骨样细胞系UMR106体外共培养的方法，以促进成骨样细胞增殖和分化的作用为活性检测指标，从多个侧面考察了青娥方促成骨样细胞的活性作用：在不同浓度的乙醇提取液中，青娥方75％乙醇提取液显示出最强的促细胞增殖和分化的活性；利用系统溶剂萃取法，确立了青娥方乙醇提取物的乙酸乙酯层和水层为主要活性部位；利用撤药分析法对青娥方进行了拆方研究，考察了11个子方对成骨样细胞增殖和分化的作用，本研究首次从细胞水平验证了青娥方组方中四种单味药之间君臣佐使的配伍作用，证明了青娥方组方的科学性。 采用多种色谱分离技术，以活性测试为导向，对青娥方乙酸乙酯层、杜仲乙酸乙酯层和水层的活性部位分别进行了活性成分的追踪分离，逐步分离纯化得到了7种化合物，并运用波谱学技术并结合理化数据鉴定其中6种化合物的化学结构，它们是具有促进细胞增殖和分化作用的松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucopyranoside)、补骨脂素(psoralen)和异补骨脂素(isopsoralen)，对细胞增殖有显着促进作用的白桦脂酸(betulic acid)和胡萝卜苷(daucosterol)，对细胞增殖有一定作用的β-谷甾醇(β-sitostero1)。上述结果表明，松脂醇二葡萄糖苷、补骨脂素和异补骨脂素是青娥方促成骨样细胞增殖和分化的主要活性成分。 对青娥方进行了提取工艺与质量控制方法的研究。采用正交试验设计法，以松脂醇二葡萄糖苷、补骨脂素和异补骨脂素含量以及浸膏重为评价指标，对提取溶剂用量、提取溶剂浓度和提取时间叁个因素进行优化，确定青娥方的醇沈阳药科大学博士学位论文扮歹提工艺最优水平为:用10倍量的75%乙醇为提取溶剂，提取3次，每次2小时;采用薄层色谱法对青娥方中杜仲和补骨脂两味药材进行了定性鉴别，斑点清晰，重现性好;采用高效液相色谱法对10批青娥方提取液中松脂醇二葡萄糖昔、补骨脂素和异补骨脂素进行定量测定:松脂醇二葡萄糖昔的平均含量为0.520mg·g一，，RsD为3 .2%;补骨脂素的平均含量为1 .1 43 mg·g一，，RsD为2.20，0;异补骨脂素的平均含量为1.o07mg.g一’，RsD为2.3%。本研究为青娥方质量控制方法提供了定性、定t分析依据。 选用双侧去卵巢所致的雌性大鼠骨质疏松模型，骨疏康颗粒为阳性药，考察了青娥方醇提物对骨质疏松模型大鼠的作用。给予青娥方醇提物后，给药组与模型组的大鼠相比，给药高剂量组大鼠的骨密度和骨强度明显增加，血清ALP活性明显降低，血清骨钙素、雌二醇水平有显着性的提高(P<0.05)，提示青娥方具有一定的雌激素样作用，可有效抑制过高的骨转换率，促进骨形成而发挥抗骨质疏松作用。 采用细胞血清药理学方法，首次利用青娥方含药血清进行体外促成骨样细胞UMR106增殖和分化作用的试验。本试验在排除空白血清对成骨样细胞增殖和分化活性的干扰后，建立了青娥方含药血清对成骨样细胞的生长曲线，证实了青娥方含药血清对成骨样细胞的增殖和分化活性同样具有显着的促进作用。同时结合青娥方在大鼠体内的抗骨质疏松药效学实验，进一步证实了青娥方具有促进骨形成的抗骨质疏松作用。 本研究在中医药学理论和实践的指导下，将天然药物化学、细胞分子生物学、分析化学和药理学等多学科技术相结合，从多侧面研究了青娥方对成骨细胞的作用，初步探讨了复方中药青娥方的配伍作用、药效物质基础和质量控制指标，优化了其提取工艺，建立了其质量控制方法，并对其进行了药效学和细胞血清药理学研究。为研制能促进骨形成，从根本上治疗骨质疏松症的中药新药奠定基础，同时也为防治骨质疏松症复方中药的现代化作了有意义的探索。
周振雷[7]2007年在《骨疏康防治笼养蛋鸡骨质疏松症的效果及其机理研究》文中认为笼养蛋鸡骨质疏松症是以全身性结构性骨丢失及骨脆性增加和易发生骨折为特征的一种严重骨骼疾病。饲养管理、营养、遗传、内分泌因素等对本病的发生均有一定的作用，但其确切作用机制仍不明了。本文研究了ISA蛋鸡的骨代谢变化规律，探讨了中药骨疏康对笼养蛋鸡骨质疏松症的防治效果和作用机理。1 ISA蛋鸡骨代谢的增龄性改变研究了15、35、58和70周龄ISA蛋鸡骨代谢变化规律。试验表明，与15周龄比较，70周龄ISA蛋鸡的AKP、TRAP水平分别下降了61.06％和54.38％(P<0.05)，肱骨、胫骨、股骨、龙骨的放射密度分别增加了35.23％、34.86％、28.38％和34.86％(P<0.05)，而肱骨、胫骨、股骨的平均皮质骨宽度分别下降了11.43％、36.96％和28.75％(P<0.05)，皮质骨面积百分率分别下降了13.97％、38.02％和28.53％(P<0.05)。结果显示，70周龄ISA蛋鸡骨形成减弱，骨吸收增加，已发生显着的骨质疏松症。皮质骨在产蛋周期的持续性重吸收是笼养蛋鸡骨质疏松症的重要发病机理之一。2骨疏康对蛋鸡骨代谢的影响研究了中药骨疏康对蛋鸡骨代谢的影响。选择90羽58周龄蛋鸡，随机分为3组。对照组饲喂基础日粮，骨疏康组在基础日粮中添加1％的骨疏康，依普拉芬组在基础日粮中添加25 mg/kg的依普拉芬。试验为期90 d。结果显示，与对照组比较，骨疏康组和依普拉芬组血清Ca、P、AKP、TRAP、BGP水平显着降低，肱骨、胫骨、股骨的骨指数、骨放射密度、皮质骨厚度、皮质骨面积、皮质骨面积比例以及血清中IGF-1水平显着升高，而骨疏康组与依普拉芬组之间无显着差异，表明骨疏康能显着抑制产蛋后期蛋鸡的骨吸收，促进骨形成，改善骨代谢。3骨疏康在集约化鸡场的应用及其对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋壳品质和骨代谢的影响研究了骨疏康在集约化鸡场的应用及其对产蛋后期蛋鸡生产性能和骨代谢的影响。选择1000羽55周龄的蛋鸡，随机分为2组。对照组饲喂基础日粮，骨疏康组在基础日粮中添加1％的骨疏康，试验为期10周。结果显示，与对照组比较，骨疏康组的破壳蛋率和饲料转化率显着降低，产蛋率、蛋壳强度，肱骨、胫骨、股骨的骨指数、骨放射密度、皮质骨指数、皮质骨比例以及胫骨的骨强度显着增加，胫骨的髓质骨面积比例以及血清AKP水平显着降低，表明骨疏康能显着提高产蛋后期蛋鸡的生产性能和蛋壳品质，改善骨代谢，有效防治笼养蛋鸡骨质疏松症的作用。4骨疏康对成骨细胞增值和活性的影响研究了中药骨疏康血清对成骨细胞增值和活性的影响。采用二次酶消化法获得鸡胚成骨细胞，与骨疏康血清混合培养，MTT法和PNPP法检测成骨细胞增值率和AKP活性。结果显示，与对照组比较，骨疏康血清可促进成骨细胞的增值和AKP的分泌，给药5 h后的骨疏康血清作用最佳，表明骨疏康可促进成骨细胞的增值、分化和活性，促进骨形成。5骨疏康有效成份对成骨细胞增殖和AKP活性的影响研究了骨疏康有效成份对鸡胚成骨细胞增殖和分化的影响。将不同浓度的柚皮苷、黄芪甲苷加入第二代成骨细胞中，分别于培养24、48、72 h时，使用MTT法和PNPP法检测成骨细胞的增殖和AKP活性。结果显示，与对照组比较，适宜浓度的柚皮苷和黄芪甲苷(10～80 ng/mL)具有显着促进鸡胚成骨细胞增殖和AKP活性的作用(P<0.05)。40 ng/mL浓度作用效果最佳，表明柚皮苷和黄芪甲苷对鸡胚成骨细胞增殖和分化均有促进作用。
毛翠平[8]2006年在《基于细胞水平的抗骨质疏松中药药效学评价方法的建立》文中指出骨质疏松症是危害人类健康的主要疾病之一,寻找切实有效的抗骨质疏松药物已成为当今医学领域的重大课题。传统中药里有许多活性物质具有抗骨质疏松作用,又因其具有副作用小等优点,在治疗骨质疏松中发挥着越来越重要的作用。但长期以来,临床医生只是凭经验使用中药来治疗疾病,中药成分复杂,即便是临床上经常使用的中药,也很少有人去研究它们的作用机制。目前中药现代化的实现和细胞培养技术的逐步发展,使得在更深的层次上研究中药的药理作用成为可能。本研究的目的就是建立一种基于细胞水平的抗骨质疏松中药药效学的评价方法。 首先,建立成骨细胞和破骨细胞的体外培养方法。通过酶消化法获得新生大鼠的成骨细胞。通过碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨细胞;用1,25(OH)_2D_3诱导骨髓单核细胞获得破骨细胞,并用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色进行鉴定。最后应用激光共聚焦显微技术,Bodipy FL Phallacidin荧光抗体和碘化丙啶(PI)进行标记后,观察两种细胞的细胞骨架F-actin。 然后本文采用传统血清药理学的方法制备含药血清,并对这一方法进行了改进。传统的方法是对成年大鼠直接灌胃给药,一段时间后取血制备含药血清。我们知道,骨质疏松症有很大一部分发生在绝经后的女性,雌激素的下降对骨质疏松症有着明显的作用。而本文在灌胃前将雌性SD大鼠进行去势处理,消除血清中雌激素的影响,从而更好的研究血清中的药物成分对细胞功能的影响。 再次,我们用体外培养的成骨细胞,建立了抗骨质疏松中药作用于骨形成的药效学评价方法。通过WST-1检测细胞代谢情况与增殖活力,用酶标仪检测成骨细胞分泌碱性磷酸酶和胰岛素样生长因子的功能。最后加入龟鹿复方不同剂量组10%含药血清,观察其对成骨细胞各项功能指标的影响。结果发现,高剂量组血清可明显促进成骨细胞增殖、ALP活性和IGF-1的分泌,说明龟鹿复方可以促进成骨细胞的骨形成。 最后,我们用体外培养的破骨细胞,建立抗骨质疏松中药作用于骨吸收的药效学评价方法。我们用扫描电镜(Scanning Microscope)技术观察破骨细胞形成的骨凹陷;同时检测TRAP(+)细胞数和破骨细胞TRAP活性。最后加入龟鹿复方含药血清进行干预,方法同成骨细胞。结果表明,中剂量组血清可明显抑制骨髓细胞向破骨细胞转化,抑制骨凹陷形成,降低细胞内TRAP的活性,减少TRAP(+)细胞数。说明龟鹿复方可以抑
赵丕文, 牛建昭, David, Yue-Wei, Lee, 王继峰, 孙艳玲[9]2012年在《中药及其活性成分对绝经后骨质疏松症的治疗及其作用机制》文中提出绝经后骨质疏松症是更年期妇女的常见全身性骨代谢疾病,体内雌激素水平下降是其重要病因。激素替代疗法(HRT)虽然在多年的临床实践中有着良好和肯定的疗效,但其在提高妇科肿瘤发生率等方面具有明显的副作用。临床实践已经证明,多种妇科中药方剂、单味中药及中药植物雌激素样活性成分对骨质疏松症有确凿疗效且副作用小。其主要通过作用于靶组织、靶细胞的雌激素受体并进而影响其下游信号传导通路中骨代谢相关调节蛋白和因子的表达情况,达到对骨质疏松症的防治效果。同时,近年来雌激素相关受体的研究也为全面揭示中药及其活性成分抗骨质疏松症的作用机制提供了新的可能角度和途径。
郑苏阳[10]2017年在《基于内质网应激与Wnt/β-catenin信号通路研究蛇床子素对成骨细胞增殖与分化的影响及机制》文中研究说明背景:骨质疏松症是由体内骨吸收-骨形成耦联失衡引起的代谢性骨病,其治疗着眼于恢复骨代谢平衡。蛇床子素被证实具有抗骨质疏松的药理作用,但其抗骨质疏松的机制尚不清楚。目的:观察蛇床子素对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响,探讨蛇床子素抗骨质疏松的机制。方法:通过改良酶消化法及反复贴壁纯化法从新生大鼠颅骨中获取原代成骨细胞;通过光镜下形态观察、碱性磷酸酶染色、茜素红法矿化结节染色等方式鉴定成骨细胞。采用CCK-8法筛选出10-6M、10-5M、10-4M作为低、中、高浓度蛇床子素组,以10-8Mβ-雌二醇作为阳性对照组,0.25%DMSO作为溶剂对照组,最后设立空白组排除DMSO对成骨细胞的干扰。本研究采用CCK-8法测定成骨细胞增殖能力、偶氮偶联法测定细胞内碱性磷酸酶表达、茜素红染色法测定成骨细胞矿化能力以及酶联免疫法测定骨钙素分泌量,从不同角度、不同阶段检测蛇床子素对成骨细胞分化的影响。并通过检测内质网应激标志分子GRP78、PDI、CHOP以及Wnt/β-catenin信号通路的Wnt、β-catenin蛋白的表达来分析蛇床子素影响成骨细胞增殖和分化的机制。结果:10-4M的蛇床子素可以抑制成骨细胞增殖,10-5M的蛇床子素在给药72h后也会抑制成骨细胞增殖;104M的蛇床子素可以促进成骨细胞表达,10-5M蛇床子素组在给药48h后成骨细胞内碱性磷酸酶也开始提高;各浓度蛇床子素均可以促进成骨细胞骨钙素的分泌和矿化结节形成,其中10-4M的蛇床子素效果最强;各浓度蛇床素均可以降低GRP78表达,尤以10-4M浓度最为显着,而PDI的表达与蛇床子素的浓度呈正相关,其中10-4M浓度蛇床子素可以增加PDI表达,CHOP的表达只在10-4M浓度组检测到;Wnt1蛋白在10-4M及10-5M组表达增加,而β-catenin只有104M组升高。结论:蛇床子素可通过提高Wnt1蛋白水平来促进β-catenin介导的成骨细胞增殖与分化,但是高浓度蛇床子素过强的促分化能力会通过内质网应激途径造成成骨细胞凋亡,从而大大抑制成骨细胞增殖,蛇床子素刺激成骨的最佳浓度在5×10-5M～10-4M之间。本研究证实了蛇床子素促进骨形成的作用并提出其作用机制,为后续以蛇床子素为有效成分的新药研发提供了研究基础。
参考文献：
[1]. 鹿角盘提取物的体外抗骨质疏松作用[D]. 吴菲菲. 大连理工大学. 2013
[2]. 应用成骨细胞生物色谱法研究牡丹皮促进骨折愈合的效应物质[D]. 顾伟伟. 南京中医药大学. 2017
[3]. 骨碎补抗骨质疏松活性部位的化学成分研究[D]. 高颖. 沈阳药科大学. 2008
[4]. 促进成骨细胞骨形成的中药及其活性成分的研究[D]. 王大为. 沈阳药科大学. 2001
[5]. 中药精选小复方骨疏丹促成骨细胞骨形成作用的研究[D]. 孟繁浩. 沈阳药科大学. 2004
[6]. 青娥方促进成骨细胞骨形成活性成分的相关研究[D]. 熊志立. 沈阳药科大学. 2003
[7]. 骨疏康防治笼养蛋鸡骨质疏松症的效果及其机理研究[D]. 周振雷. 南京农业大学. 2007
[8]. 基于细胞水平的抗骨质疏松中药药效学评价方法的建立[D]. 毛翠平. 浙江大学. 2006
[9]. 中药及其活性成分对绝经后骨质疏松症的治疗及其作用机制[J]. 赵丕文, 牛建昭, David, Yue-Wei, Lee, 王继峰, 孙艳玲. 中国中药杂志. 2012
[10]. 基于内质网应激与Wnt/β-catenin信号通路研究蛇床子素对成骨细胞增殖与分化的影响及机制[D]. 郑苏阳. 南京中医药大学. 2017
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