山东省济宁市第一中学 山东济宁 272000
摘要：胶原蛋白是保健品中的明星分子，是由动物结缔组织提取而来。对皮肤表面的蛋白质分子具有较大的亲和力、较弱的抗原性、良好的生物相容性和生物降解安全性，可降解吸收，适应性强，在生物医学材料、组织工程、美容、食品等方面都具有良好的发展前景和较高的研究价值。本实验使用实验室以猪皮为原料制备的胶原蛋白为样本，对胶原蛋白的定量分析和鉴定，认识其生化性质，熟悉其蛋白组成，以便更好地辨识目前市场上的胶原蛋白产品。
关键词：胶原蛋白，考马斯亮蓝，聚丙烯酰胺电泳，
1引言
胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25%～30%，某些生物体甚至高达80%以上。
胶原蛋白应用广泛。作为肌体自然蛋白，它还具有生物降解性、止血性能、对皮肤表面的蛋白质分子具有较大的亲和力、较弱的抗原性和良好的生物相容性，可降解吸收，粘着力好；胶原蛋白亦可用于食品，具有适用于食品的一些属性。
胶原蛋白有着巨大的生物化学作用与潜质、良好的发展前景。目前胶原蛋白是保健品中的明星分子，产品众多。但如何认识胶原蛋白的组成，如何了解它的功能以及如何辨识真伪是消费者遇到的问题。本实验以猪皮为原料制备的胶原蛋白为实验材料，对其进行蛋白定量分析和鉴定，从而认识其生化性质，熟悉其蛋白组成，以便更好地辨识目前市场上的胶原蛋白产品。。
2胶原蛋白的含量测定
2.1考马斯亮蓝法
2.1.1实验用品
标准蛋白质溶液：5.0 mg/mL的牛血清蛋白(BSA)
考马斯亮蓝G-250染料试剂
可见光分光光度计；比色管；移液器。
2.1.2标准蛋白溶液的配制
精密称取牛血清白蛋白 0.25g，倒入蒸馏水到试管中定容至50ml，配制成浓度为 5.0mg/mL 的标准蛋白质溶液。用该标准蛋白溶液二倍梯度稀释，得到浓度分别为2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL的标准蛋白溶液。
2.1.3考马斯亮蓝 G-250 溶液的配制
称取考马斯亮蓝 G-250 5.0mg，然后将其倒入烧杯中，加入 2.5mL 95% 的乙醇溶解和6.0mL 85% 的磷酸溶解，再用蒸馏水稀释50mL备用。
2.1.4标准曲线的绘制
取 6 支试管按表 3 所示分别加入标准蛋白溶液（如表1），再分别向这 6 支试管中加入 0.9mL 考马斯亮蓝 G-250溶液，摇匀振荡后放置 10min 左右，将溶液倒入比色皿中，在 A595nm 处测定吸光度。横坐标为蛋白质浓度，纵坐标为吸光度，根据测出的数据使用软件绘制出标准曲线。
表 1 标准蛋白溶液、蒸馏水、蛋白质浓度
由以上数据可得出标准曲线如下：
图1 考马斯亮蓝法标准曲线
2.1.5样品测定
称量0.15g胶原蛋白粉于试管中，然后将生理盐水倒入试管中定容至 50mL，摇匀振荡后等待测量。
取 3 支试管，往试管中分别加入胶原蛋白溶液0.1mL、考马斯亮蓝G－250 溶液0.9 mL，摇匀混合，放置 10min 后在 595nm 下比色，测定出样品吸光度为0.190。将该数据代入标准曲线，可得样品浓度约为0.023mg/mL。
2.2紫外分光光度法
2.2.1实验用品：5mg/mL的标准蛋白溶液等、胶原蛋白样品溶液、紫外分光光度仪。
2.2.2标准蛋白溶液的配制
配制出浓度为 5.0mg/mL 的标准蛋白质溶液，用该标准蛋白溶液二倍梯度稀释，得到浓度分别为2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL的标准蛋白溶液。
2.2.3样品溶液的准备
将样品溶液平均分为三份，记为样品A、样品B、样品C。
2.2.4吸收曲线的绘制
首先用紫外分光光度仪测定胶原蛋白样品溶液在250nm-350nm之间的吸光度并利用电脑绘制曲线，确定最大吸收峰。波谱扫描结果如下：
图2 胶原蛋白光谱扫描曲线
结果显示，280nm处测试样品有最大吸收峰。
2.2.5标准曲线的绘制
用紫外分光光度仪测定6种浓度的标准蛋白溶液在280nm下的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。数据如表2。
表2 牛血清白蛋白吸光度与浓度数据
绘制出标准曲线如下图：
图3 紫外分光光度法标准曲线
2.2.6样品测定
用紫外分光光度仪测定相同体积样品溶液在280nm下的吸收度，平行测三次，数据如下：
取平均值得吸光度为0.475，将该吸光度代入标准曲线可得：样品可溶性蛋白浓度为1.931mg/mL。
3 SDS-PAGE法分析和鉴定胶原蛋白的成分
3.1 SDS-PAGE电泳法测定胶原蛋白成分
试剂的配制、凝胶板的灌制、电泳操作和电泳胶的染色、脱色参照汪建雄，隋秀芝，陈育晖的《用SDS-PAGE电泳法测定小分子多肽分子量的研究》。
3.2 电泳结果
图4 12% SDS-PAGE分析胶原蛋白样品的图谱
可以看到：提取胶原蛋白，分子量较大的集中在95kDa~180kDa间，符合没有水解的胶原蛋白特点；电泳谱带上可以清楚地看到α1和α2组分，且α1的分子量为130 kDa，α2的分子量为110 kDa。
4 讨论和分析
4.1测定方法方面的讨论
4.1.1溶液浓度问题：胶原蛋白浓度过低导致电泳图谱痕迹过淡，模糊不清，不易看出其条带分布与数目。
4.1.2不同含量测定方法导致的偏差：考马斯亮蓝法与紫外分光光度法的原理不同。考马斯亮蓝法的原理是考马斯亮蓝染料与蛋白质结合而导致最大吸收峰的变化，这种方法无法测出氨基酸、小肽等的含量，而紫外分光光度法则可以测出样品中的氨基酸、小肽等的存在。而且胶原蛋白恰恰含有大量氨基酸和小肽，所以用紫外分光光度法测出的蛋白质浓度高于用考马斯亮蓝法测出的结果。
4.1.3操作问题：操作不熟练而导致误差的存在。例如，测定蛋白浓度时，用移液器加样时，移液体积不准确。
4.2实验认识方面
通过本次的学习研究，对胶原蛋白这一重要蛋白质有了更好更深入的认识，即目前市场上的胶原蛋白，多以小肽和氨基酸的形式存在，有利于肠胃或者皮肤吸收。
大量小肽和氨基酸的存在，会使用紫外分光光度法和考马斯亮蓝发含量测定产生比较大的偏差。
提取和制备过程中，没有被降解或者消化的胶原蛋白，分子量范围为95kDa～180kDa，符合胶原蛋白的分子量范围。
对胶原蛋白理化性质的研究，使我对于生物化学方面的研究工作、实验室操作等有了更深的认识与体会。
参考文献：
[1]张秋红 等.酸枣仁中蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析[J].中国现代中药，2017（7）：972-977，991.
[2]袁野 等.胶原蛋白检测方法研究进展[J].明胶科学与技术，2014(4)：175-180.
[3]李莹莹 等.白果蛋白质提取及SDS-PAGE分析[J].食品科学，2010（22）：36-40.
[4]王爱英 等.微拟球藻蛋白质含量和氨基酸组成分析[J].山东师范大学学报（自然科学版），2014（1）：137-140.
[5]李春梅 等.乳制品中胶原蛋白检测方法研究[J].中国乳品工业，2018（4）：35-38.
作者简介：
王加贝（2002-），女，山东济宁人
论文作者:王加贝
论文发表刊物:《基层建设》2018年第35期
论文发表时间:2019/3/12
标签：马斯论文; 胶原蛋白论文; 溶液论文; 光度论文; 标准论文; 蛋白论文; 浓度论文; 《基层建设》2018年第35期论文;