青海大学研究生院肝胆外科
摘要：分子生物学越来越多的在临床当中得到应用，涉及到诊断、治疗以及一些疾病的监测。本文简单介绍了近几年分子生物学在肝胆胰外科中的应用，如生物学的共性、癌基因与抑癌基因、分子生物学在肝脏临床上的应用、分子生物学在胰腺临床上的应用等方面介绍。
关键词：肝脏，胰腺，分子生物学基础。
Abstract：molecular biology has been applied more and more in clinical，involves the diagnosis，treatment，and the monitoring of some diseases. This article simply introduces the application of molecular biology in recent years in hepatobiliary surgery，such as biology，oncogene and tumor suppressor genes，the generality of the molecular biology in the clinical application of liver，molecular biology in the pancreas of clinical application，etc.
Keywords：liver，pancreas，basis of molecular biology.
对外科医师而言，工作是以手术治疗为主，无需对没有直接关系的分子生物学知识有更多的认识。对刚从医学院毕业的青年医师来说，本已具有分子生物学的基本知识，阅读文献和讨论问题不应有太大困难，但对肝胆胰外科疾病的分子生物学基础则了解不多。但如果工作中能较多地分析疾病的成因、变化及药物作用机制等，则对相关的分子生物学知识应有所了解，可能更有助于疾病的诊断及治疗。本文简单介绍近几年分子生物学在肝胆胰外科中的应用。
一、生物学的共性：遗传法则
在我们所生活的大千世界里生物的种类有成千上万，据不完全统计自然界现存物种约有500万～1000万，其中有科学记载的物种就有170万。如此众多的生物物种，其共同特性是：繁衍和自身相似的同类。生物就是依据这一中心法则进行繁殖生育：如亲-子之间的物质联系是通过细胞核内的染色体进行的。人体共有1013个细胞所组成。人的每个细胞中有23对染色体，这些染色体携带着10万以上基因。
二、癌基因与抑癌基因
肿瘤分子生物学发展历史已有25年。1970年以前，在癌变分子基础方面基本上是处在瞎子摸象的阶段。1970年，Steve Martin，PeterVogt，Pe-ter Duesberg证明，Rous肉瘤病毒（RSV，引起鸡肉瘤，1911年由Rous发现）中的一个基因能够使正常鸡细胞转化为恶性细胞，他们把这个基因命名为src（源自sarcoma，肉瘤），这是科学家发现的第一个癌基因（oncogene，亦可译成“瘤基因”）或病毒癌基因（viral oncogene）。5年后，Micheal Bishop和Harold Varmus发现，鸡细胞本身就携有src基因。这一发现意味着，在禽类细胞中本来就有能引起肿瘤的基因，而RSV病毒中的src基因是在病毒感染鸡细胞时从后者取走的。这一发现的重要意义在于：首次证明细胞本身就有能够致癌的基因（1989年获诺贝尔奖）。
后来发现，不但禽类细胞中有这个src基因，哺乳类动物（直至人类）细胞中也都有这个基因。这表明，这个基因的结构在漫长的进化过程中十分保守，也就是说，src在正常状态下必定拥有十分重要的生理功能。于是，引发了2个疑问：（1）在正常情况下它做些什么?（2）它又在何种情况下引起细胞癌变?解开第一个疑问的研究工作打开了一个重要的调控蛋白（酶）新领域。1978年2位科学家报道：src编码的蛋白质是1种蛋白激酶。即可通过把磷酸根加到其他蛋白而调控后者的活性。1980年，另一位科学家发现src蛋白不像当时已知的蛋白激酶那样，把磷酸根加到丝氨酸和苏氨酸上，而是使酪氨酸磷酸化。随后，又发现了一系列具酪氨酸激酶活性的其他癌基因，组成了一类属蛋白激酶族的癌基因。
表皮生长因子受体（epiderma1 growthfactor receptor）。这一系列发现把癌基因产物直接纳入到细胞增殖调控的环节中。至今已鉴定出20种左右的癌基因编码酪氨酸激酶，它们有的是受体，接受生长因子信号并将其转导到细胞，另一些（包括src）定位于胞膜之下或胞浆中转导生长因子信号。虽然src基因在开辟整个癌基因领域方面占有十分重要的地位，但同人体肿瘤的关系不大。第一个同人体肿瘤发生关系的癌基因是ras。1979年Weinberg等发现用化学致癌物恶性转化的细胞内有一个活性癌基因，提示该化学致癌物的攻击目标就是癌基因。由于该细胞从未遭受过病毒感染，该结果又提示，癌基因活化可能是肿瘤发生的通常事件，并不一定要经病毒感染。随后有几个实验室（1982）同时证明ras基因既是化学致癌物激活的基因，也是人膀胱癌细胞中的激活基因。这种激活只是改变了基因中的1个核苷酸，从而使其编码的Ras蛋白出现了1个氨基酸的变化，这说明，癌基因的突变在人体肿瘤发生中可能十分重要。随后的工作证明，大约30%的人体癌细胞中可发现突变的ras；还有一些研究证明，人体细胞中癌基因的激活并不限于点突变。1982年发现，Burkitt淋巴瘤的发生是由于位于第8号染色体上的myc基因由于染色体易位，而转到位于另一条染色体上的免疫球蛋白基因附近，于是在免疫球蛋白强大启动子的控制下过度表达了（即被激活）。
20世纪60年代初发现的慢性粒细胞白血病Ph染色体是人体肿瘤中第一个恒定的畸变，到20世纪70年代已被弄清是由于2条染色体易位所致。至20世纪80年代进一步弄清，这种易位产生了1种新的融合基因，编码1种异常的融合蛋白（abl-BCR），随即发现，不少肿瘤中出现这种因染色体易位而产生的异常融合蛋白。这一领域成为癌基因研究的另一个热点，并因此鉴定出一系列新的癌基因。这种融合蛋白仅出现于癌细胞中，因此，可以成为肿瘤治疗的攻击靶点。1994年12月Nature上刊载了一篇英国科学家设计出1种针对上述abl-BCR结合点6对核苷酸的DNA结合蛋白，已在动物体内抑制了这种白血病细胞的增殖（Nature，1994，372：642）。[1]前面提到的一大类癌基因都是通过突变、易位等机制而被激活，从而使正常功能变成具致癌活性。它们的作用方式是显性的。自20世纪80年代中期以来科学家开始对另一类癌基因发生了很大兴趣，这一类癌基因被称为抑癌基因（tumor suppressor genes），参见表1。
第一个抑癌基因Rb于1986年被分离出来。1989年，原先一直被认为是癌基因的p53，被证明是一种抑癌基因。而且在大约50%的人体恶性肿瘤中都发生p53的变化（突变、缺失等），对p53的研究热潮大大丰富了肿瘤分子生物学和细胞生物学，并把p53推向了1993年“分子明星”的显赫地位。
抑癌基因的正常功能是防止肿瘤的发生，一旦它们在某个正常细胞中不能行使正常功能，这个细胞就可能发生癌变。一个正常细胞变成癌细胞一般都发生多次改变，包括某些癌基因的被激活和某些抑癌基因的失活或丢失，抑癌基因的研究不仅使人们对癌变分子基础获得更完整和深刻的了解，而且把细胞生物学的基本领域，如细胞增殖周期，细胞分化凋亡和细胞进化都联系起来了。1995年1月美国集会纪念Bishop和Varmus发现细胞本身就有能够致癌的基因20周年。
虽然25年来肿瘤分子生物学研究在认识癌细胞和推动细胞生物学的发展方面成果累累，但在将这些重要知识转变到癌症防治方面还刚刚开始，预计在下一个25年中这些知识将直接造福于人类。[1]
三、分子生物学在肝脏临床上的应用
1.肝癌时的癌基因异常：大量的实验结果表明在肝癌的发生过程中有多种癌基因的异常表达。目前已经发现多种肝细胞转化过程中c-myc，Ha-ras，N-ras和C-fos等癌基因的表达明显增加。根据上述发现可以认为，肝癌生成过程中，一个或数个癌基因表达过强可能反映某些细胞群体的增殖状态，或可能是正常细胞调节失控的一个标志。在此之后，人们陆续发现肿瘤抑制基因（p53）、肿瘤转移基因和转移抑制基因（nm23），这些基因与肝癌的发生、转移以及基因治疗有着密切的联系。
2.肝脏疾病的基因诊断：肝脏疾病的基因诊断在研究和临床已经得到了广泛的应用。包括各型肝炎病毒的检测和分析，肝癌的诊断及有关遗传病的诊断等。对病毒性肝炎来说，基因诊断由于灵敏度高，可测出标本中极低水平的病毒核酸，包括已经发生变异的核酸，并能对其加以分析。例如日本有学者报道，1b型HCV RNA基因组NS5a的C端编码的氨基酸序列2 209～2 248与干扰素治疗的敏感性有关，称为干扰素敏感决定区（ISDR），此区如出现4个氨基酸变异，将对干扰素出现良好的应答。这类问题都有待于基因诊断解决。当然，除了肝炎病毒以外，各种病原微生物和寄生虫都可以应用基因诊断。
3.肝细胞再生的调控因子：成年动物与人的肝脏在正常情况下处于相对稳定状态。但在病毒性或药物性肝炎、中毒或部分肝脏切除术后，肝细胞会大量再生，直至恢复正常的大小、组织学结构与功能。如大鼠在70%肝脏切除后10 d内恢复正常大小。人的肝脏在相的情况下也会出现类似反应，只是稍慢而已。这种不同于其他器官的再生现象何以发生，尚不完全清楚。但是，由于近年来分子生物学技术的迅速发展，发现了肝内存在着多种细胞因子，通过复杂的介质网络系统，调控着肝细胞再生的启动、终止及正常“静止态”的维持。
（1）促进肝细胞生长的因子：表皮生长因子（EGF）、转化生长因子α（TGFα）、肝细胞生长因子（HGF）、肝素结合生长因子Ⅰ（HBGF-Ⅰ）、胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-Ⅱ）。
（2）抑制肝细胞再生的细胞因子：转化生长因子β（TGFβ）、干扰素（IFN）、白介素1（IL-1）、白介素2（IL-2）。
4.原发性肝癌的基因治疗：主要有以下几种：
（1）淋巴因子的转基因治疗。主要有干扰素类、白细胞介素（IL）类、克隆刺激因子类、肿瘤坏死因子（TNF）及转化生长因子。用白细胞介素基因导入靶细胞的疗法主要有2种：①导入肿瘤细胞，使之丧失致瘤性，同时增强肿瘤的免疫原性，起所谓“肿瘤疫苗”作用。其分泌的产物，可以原位激活CTL作用，协助杀灭肿瘤细胞。②导入TIL进行过继免疫疗法，增强其杀瘤活性，同时避免全身大剂量使用白介素、TNF等细胞因子所引起的严重毒副反应。另外一种思路是将淋巴因子的受体基因导入肿瘤细胞。这些转染了受体的肿瘤细胞容易被杀灭。
（2）将MHC-Ⅰ类分子的基因（如HLA-B7，HLA-B27等）原位导入缺乏MHC-Ⅰ抗原表达肿瘤细胞中，诱导产生肿瘤特异性的细胞毒作用来杀灭肿瘤。这种在体内原位修饰肿瘤的免疫原性，诱导肿瘤的特异性细胞反应具有重要实用价值。
（3）采用反义核酸与mRNA特异性结合，阻断癌基因的表达。目前在这方面已经进行了较多的临床前研究。如应用N-ras反义核酸治疗肝癌等，尽管效果尚不满意，但积累了不少有益的经验。用替代或添加的方法将某种抗癌基因导入肿瘤细胞中，使其发挥抗癌功能，也是一种令人感兴趣的基因治疗思路。
四、分子生物学在胰腺临床上的应用
1.分子生物学标记联合检测
朱萱[2]对58例胰腺癌高危患者内镜抽取的纯胰液行细胞学、k-ras基因点突变及端粒酶活性联合检测，5例胰液中发现可疑恶性细胞（8.62%），点突变阳性率为37.9%，端粒酶活性弱阳性13.8%，3例均阳性6.89%.k-ras基因点突变及端粒酶活性两者阳性12％。刘晓川对犯例临床与手术证实的胰腺癌患者ERCP胰液收集标本行PCR-SSCP。发现k-ras12密码子点突变率为56.3%，且与肿瘤的大小相关，k-ras12密码子突变阳性与阴性表达病例3a复发率分别为66.7%和33.3%.高血清CA19-9水平且k-ras12密码子点突变阳性病例复发率69.2%。低血清CA19-9水平且k-ras12密码子点突变阳性病例复发率为20%。认为联合检测k-ras12密码子点突变与血清CA19-9水平可作为胰腺癌术后复发的有效指标.[3]
端粒酶
端粒由许多简单重复序列结合蛋白质组成，位于真核细胞染色体末端，与细胞凋亡，细胞转化和永生化密切相关。端粒酶在胰腺正常组织和良性病变中处于低活性状态，在胰腺癌中被激活[4]，说明端粒酶活化对胰腺癌的发生发展具有重要作用。
GDEPT
采用来源于细菌或病毒的基因转入肿瘤细胞内，表达具有酶活性的功能蛋白，可将肿瘤细胞内的前体药物进一步转变为具有较强细胞毒的药物，从而干扰肿瘤
细胞的生长。日前较常用是单纯疱疹胸腺嘧啶激酶—甲基鸟嘌（HSV-TK-GCV）。TK可将非毒性的GCV转换成单磷酸形式，在细胞激酶的作用下进一步代谢为二磷酸和三磷酸，从而引起DNA链合成终止。但目前应用GDEPT还存在两大问题。首先，由于细胞间隙连接的存在，其终产物可进入邻近细胞，使邻近正常细胞坏死。其次是肿瘤的靶向问题，即该基因仅表达于肿瘤细胞。至今，在胰腺癌中较多采用CEA启动子和erbB2启动子构建HSV-TK，由于此两种基因在胰腺癌中高表达，使得TK仅表达于肿瘤细胞[5]。
参考文献：
[1].纪小龙. 肝胆外科疾病的分子生物学基础[J]. 中华肝胆外科杂志，2001，7（2）：119-121.
[2].朱萱，李弼民，陈兴玲，等. 胰液细胞学及肿瘤相关标志物联合检测在胰腺癌诊断中的价值[J]. 江西医药，2006，41（6）：343-345.
[3].刘晓川，孟垂华，刘铁夫，等. 胰液K-ras密码子点突变联合血清CA199水平与胰腺癌复发关系的研究[J]. 临床消化病杂志，2006，18（2）：95-97.
[4].陈颖，朱明华. 胰腺癌的病理学及相关分子生物学研究进展[J]. 外科理论与实践，2005，10（3）：280-283.
[5].靳大勇. 胰腺癌的分子生物学治疗[J]. 中国实用外科杂志，2004，24（5）：279-280.
论文作者:郭弘扬
论文发表刊物:《健康世界》2016年第9期
论文发表时间:2016/7/22
标签：基因论文; 细胞论文; 肿瘤论文; 分子生物学论文; 突变论文; 染色体论文; 发现论文; 《健康世界》2016年第9期论文;