王翠娥[1]2004年在《SARS病原体鉴定、动物模型建立及灭活疫苗保护效果的病理学研究》文中研究表明为了鉴定急性烈性传染病SARS的病原体，阐明其形态特点和侵袭过程，建立用于SARS预防和治疗研究的动物模型并评价SARS灭活疫苗的保护效果，本研究以实验动物和离体细胞为对象，采用多种病理学技术手段进行了系统研究，主要结果如下：1． 通过透射电镜在接种SARS死亡患者肺组织标本的Vero E6细胞和乳鼠肺泡上皮细胞内发现了典型的冠状病毒。2． 接种SARS患者标本的发病乳鼠组织以及病变的Vero E6细胞与SARS患者血清发生免疫学了反应。3． SARS冠状病毒呈空心和实心两种状态，有散在和包涵体两种形式，以圆形和椭圆形为主，并具有多形性的特点；动态观察证实，其在Vero E6细胞内复制迅速，且能大量增殖；以膜融合方式侵入细胞，在细胞质内增殖，以出芽方式成熟，通过胞吐释放。4． 滴鼻接种SARS冠状病毒可致恒河猴和食蟹猴肺脏发生间质性肺炎，且呈渐进性发展，以感染后12～17d较明显，其病变与SARS病人肺损伤特征基本一致，只是病变程度较轻；从鼻咽拭子标本中分离出SARS冠状病毒，经免疫组化方法在肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞胞质内查见SARS冠状病毒，透射电镜观察也在肺泡上皮细胞内发现冠状病毒；肺泡上皮细胞膜SARS冠状病毒受体抗体染色阳性；肺组织超微结构损伤明显，Ⅱ型上皮细胞板层小体空化或缺如；病变部位SP-A表达减少。5． 注射SARS灭活疫苗的食蟹猴和恒河猴在受到SARS冠状病毒攻击后肺损伤明显减轻，且在中和抗体效价较低的情况下也未见感染增强现象。结论：1． 本研究在国内率先通过形态学方法发现并证实了SARS冠状病毒是SARS的病原体，其具有复制迅速、致伤快速的特点，该病毒的多形性特征提示我们在进行病原体诊断时应引起注意。2． 恒河猴和食蟹猴可以作为SARS研究的模型动物；SARS冠状病毒的主要靶器官是肺组织，肺损伤机制与病毒直接作用有关。中文摘要.SARS灭活疫苗对SARS冠状病毒的攻击有保护作用，且未引起感染增强现象。.电镜形态学技术对新发传染病特别是病毒性疾病的病原体诊断具有重要作用;病理学研究结果可以作为临床前评价SARS疫苗和药物效果的主要依据和指标。
钟琼[2]2005年在《SARSCoV灭活疫苗对恒河猴的免疫原性、保护性与安全性研究》文中研究说明目的: 建立SARS相关冠状病毒感染恒河猴动物模型,并用该模型评价一种实验性SARS冠状病毒灭活疫苗免疫原性、保护性与安全性,同时也为该疫苗进一步完善及投入临床试验提供理论和实验依据。 方法: 动物免疫分3组,分别为肌肉注射0.5μg、5μg、50μg疫苗组及磷酸盐缓冲液(PBS)对照组,同时设超大剂量(5000μg)观察疫苗安全性。于初次免疫后7天再次以同等剂量加强免疫,0.5μg、5μg、50μg剂量组和阳性对照组于免疫后22天接受SARS相关冠状病毒的攻击,并在攻毒后15天处死所有动物。观察免疫和攻毒前后动物临床症状和生化指标的改变。ELISA检测IgG和IgA抗体,观察不同动物组IgG的变化和鼻咽部IgA分泌情况,了解动物体液免疫和粘膜免疫的情况。双抗体夹心ELISA试剂盒定量分析恒河猴血清IL-4和IFN-γ水平。采用病毒分离、免疫荧光、光镜及RT-PCR方法对实验动物不同时间、不同组织或分泌物进行检测。病理切片了解免疫和攻毒前后动物脏器的改变。 结果: 1.血清IgG抗体反应:大部分免疫猴在初次免疫7天后产生较高IgG滴度(>100),高剂量组呈现高水平抗体滴度(≥1600),随疫苗剂量的升高,免疫应答亦增强。 2.粘膜免疫:肌肉接种引起的粘膜抗体反应,12只免疫动物中有5只(41.7%)表达SARS-CoV特异性分泌型IgA抗体。 3.细胞因子评价:初次免疫后,5μg,50μg疫苗组动物血清中IFN-γ显著增加,明显高于免疫前水平(P<0.05和0.01),再次免疫后继续增加。0.5μg剂量组动物仅在再次免疫后IFN-γ显著升高(P<0.05),而PBS组无明显变化。叁个实验组及对照组IL-4水平在免疫前后均无显着变化。 4.血清中和抗体效价:在初次免疫后14天,叁个免疫组出现不同水平针对SARS-CoV的中和抗体,同时随着疫苗剂量的增加,中和抗体滴度也升高。 5.组织病理学检查:各免疫组及阴性对照动物及肺部、肝脏、肾脏病理检查均未发现异常,而阳性对照动物肺部及肝脏病理学检查均发现异常变化。
方谱县[3]2015年在《猪脑心肌炎病毒NJ08株感染性cDNA克隆构建及拯救病毒生物学特性》文中提出脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)属于微RNA病毒科心病毒属成员,是一种无囊膜、单股正链的RNA病毒,是一种重要的人畜共患病病原体。EMCV感染后可造成仔猪急性致死性心肌炎,致死率可高达100%。本研究以我国中东地区EMCV NJ08分离株为材料,采用体内转录的方法成功建立了此毒株的反向遗传操作系统,成功拯救到病毒,并对该病毒的生物学特性进行鉴定;拯救病毒的免疫原性也得到初步的研究,为今后深入研究脑心肌炎病毒的分子致病机制、基因功能以及新型疫苗奠定了基础。具体研究内容如下:1猪脑心肌炎病毒感染性克隆的构建及鉴定本研究采用RT-PCR方法获得覆盖EMCV NJ08株全基因组(GenBank HM641897)的A、B和C叁个基因片段,其中C片段第6243位的T突变为A,引入EcoRI标记位点,分别克隆至pEasy simple Blunt载体,基因测序正确。采用PacI、XhoI、NheI和SpeI将3个片段依次克隆至CMY-β质粒,获得含EMCV全基因组cDNA的重组质粒pCMV-NJ08。采用脂质体将其转染至BHK-21细胞,结果出现明显细胞病变,经RT-PCR产物EcoRI酶切和间接免疫荧光试验鉴定,证明获得重组EMCV rNJ08;拯救病毒rNJ08株在BHK21细胞上的TCID_(50)、一步生长曲线和空斑形态与亲本毒NJ08相似,但对小鼠致病性明显降低,为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础。2重组脑心肌炎病毒灭活疫苗小鼠免疫特性本研究使用终浓度为0.002mM的BEI将重组病毒(rNJ08)和亲本病毒(NJ08)进行灭活处理,加入ISA15A和ISA206佐剂分别配制成灭活疫苗。将6周龄ICR小鼠随机分成8组,每组5只。第1、2组分别皮下注射由ISA15A佐剂配制的NJ08和rNJ08灭活疫苗,第3、4组分别皮下注射由ISA206佐剂配制的NJ08和rNJ08灭活疫苗(抗原浓度均为10~7 TCID_(50)/0.2ml)。第5-7组依次皮下多点注射等体积的由ISA15A佐剂配制的梯度抗原浓度(10~6TCID_(50)/0.2ml、10~5 TCID_(50)/0.2ml、10~4TCID_(50)/0.2ml)的 rNJ08灭活疫苗;第8组皮下注射2%DMEM作为阴性对照。间隔叁周进行加强免疫。首免后3周采集小鼠血清测其ELISA抗体水平;二免后3周采集血清测定ELISA抗体效价和中和抗体效价,同时分离脾脏淋巴细胞进行淋巴细胞增殖转化试验。结果为:rNJ08疫苗免疫组ELISA和中和抗体水平具有明显的抗原剂量依赖性关系;各免疫组小鼠血清ELISA和中和抗体水平在加强免疫后显着提高(1:16以上)·淋巴细胞增殖试验结果显示,接种相同剂量的各免疫组刺激指数均在3.0左右。结果表明rNJ08与NJ08具有相似的免疫原性,均能有效地刺激机体产生良好的免疫反应,并能产生中和抗体。由于该重组病毒毒力较弱,因此,安全性更高。
参考文献：
[1]. SARS病原体鉴定、动物模型建立及灭活疫苗保护效果的病理学研究[D]. 王翠娥. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004
[2]. SARSCoV灭活疫苗对恒河猴的免疫原性、保护性与安全性研究[D]. 钟琼. 武汉大学. 2005
[3]. 猪脑心肌炎病毒NJ08株感染性cDNA克隆构建及拯救病毒生物学特性[D]. 方谱县. 南京农业大学. 2015