郭郁[1]2016年在《针剌调控抑郁模型大鼠海马活性氧—线粒体途径—凋亡机制研究》文中认为目的抑郁症是一种发病机制复杂的常见精神疾病,具有高患病、高复发、高致残、高医疗成本的特点。抑郁症与应激密切相关,研究表明,长期的慢性心理应激会造成神经系统的退行性病变,不仅会引起显着的躯体症状,而且还会引起认知损伤,引发抑郁症。心理应激引发抑郁状态的核心在于使大脑海马神经元细胞发生凋亡,中间关键机制可能涉及使活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的产生过多诱发氧化应激,从而通过对蛋白质、DNA和生物膜等直接损伤和激活与其密切相关的线粒体细胞凋亡途径促使海马神经元细胞凋亡发生。由于海马是抑郁症发病机制中的关键脑区,因此,如何抑制海马神经元的凋亡成为治疗抑郁症的关键。本团队在前期研究发现,针刺可以从信号通路及相关因子等途径改善海马神经元凋亡情况,但关于心理应激一氧化应激一线粒体细胞凋亡途径与抑郁症之间联系的相关研究甚少,针刺改善心理应激引发凋亡的机制是否涉及通过调控氧化应激抑制凋亡途径的相关报道也极为少见。因此,本研究延续前期的针刺抗凋亡的研究,选择孤养结合慢性束缚心理应激抑郁模型大鼠为实验对象,模拟人类抑郁发病的心理应激过程；选取心理应激密切相关的氧化应激和氧化应激主要激活的线粒体细胞凋亡途径作为研究重点。采用针刺“百会”“印堂”“叁阴交”穴作为干预措施,氟西汀作为阳性对照药,通过旷场实验、体质量和糖水偏好实验评价心理应激模型的成立,运用荧光探针技术观察大鼠海马组织活性氧含量(ROS)和运用蛋白质印迹法(Western Blot)观察线粒体细胞凋亡途径上的主要效应因子细胞色素C、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteine-containing Aspartate-specific Proteases-3, caspase-3)、凋亡诱导因子(Apotposis Inducing Factor, AIF)的蛋白表达水平,研究针刺对心理应激引起的活性氧(ROS)含量的调节作用和针刺的抗凋亡机制是否涉及抑制活性氧(ROS)引起的线粒体细胞凋亡途径,旨在结合前期的研究,初步构建针刺的抗凋亡网络,完善针刺的抗抑郁机制,为临床针刺防治心理应激引起的早期抑郁提供实验依据。.方法1.动物分组：将32只雄性SD大鼠随机分成空白组、模型组、针刺组、氟西汀组,共4组,每组8只。各组大鼠在实验前适应性喂养一周。2.造模方法：本课题应用慢性束缚方法建立慢性心理应激动物模型,具体方法：应用铁丝网,两端用夹子固定,保持大鼠呼吸通畅,且不压迫大鼠,躯体应激小,大鼠承受到的仅是心理应激,基本控制了生理应激对其的影响,结果主要反映心理和情绪因素的作用,于每日9：00-15：00束缚应激六小时,束缚期间,禁食禁水。束缚结束后,将大鼠放回笼中,自由摄食摄水。连续束缚28天。3.处理方法(1)空白组：常规饲养,每日仅在9：00-15：00断食断水,其余时间自由摄食摄水,持续28天。(2)模型组：慢性束缚结合孤养,每日9：00-15：00,束缚期间断食断水,其余时间自由摄食摄水,持续28天。(3)针刺组：慢性束缚结合孤养,每日9：00-15：00,束缚期间断食断水,其余时间自由摄食摄水,同时在每日束缚应激处理前1h选取相当于人体解剖部位的“百会”、“印堂”、“叁阴交”穴,进行针刺干预,留针20min,每日1次,持续28天。(4)氟西汀组：慢性束缚结合孤养,每日9：00-15：00,束缚期间断食断水,其余时间自由摄食摄水；同时在每日应激刺激前30min,用盐酸氟西汀分散片用蒸馏水配成1.8mg/kg的混悬液,以l0ml/kg灌胃给药。4.检测指标及方法采用旷场实验(Open-field Test)、体质量(Body Weight)和糖水偏好实验(Sucrose Preference Test)评价模型大鼠行为学改变情况,运用DCFH-DA荧光探针技术检测大鼠海马组织活性氧(ROS)的含量,使用蛋白质印迹法(Western Blot)检测海马组织细胞色素C, caspase-3和AIF的蛋白表达水平。结果1.行为学变化实验前各组大鼠行为学表现均无统计学差异(均P>0.05)。实验结束后,模型组大鼠旷场实验水平穿越格数、垂直竖立次数、体质量和糖水消耗量及糖水偏好指数均低于空白组(均P<0.01)；与模型组相比,在旷场实验方面,针刺组与氟西汀组大鼠水平穿越格数、垂直竖立次数均显着高于模型组(均P<0.01),并且针刺的改善作用显着优于氟西汀的作用(P<0.01,P<0.05)；在体质量方面,针刺组和氟西汀组大鼠的体质量增加,有统计学差异(P<0.01,P<0.05)；在糖水偏好实验方面,针刺组和氟西汀组大鼠的糖水消耗量和糖水偏好指数显着增加(均P<0.01)。2.海马组织活性氧(ROS)含量实验应激28天后,与空白组相比,模型组大鼠的海马组织活性氧(ROS)含量水平显着升高(均P<0.01)；与模型组相比,针刺组和氟西汀组大鼠海马组织活性氧(ROS)含量水平显着降低(均P<0.01)。3.海马组织细胞色素C、caspase-3蛋白表达水平实验应激28天后,与空白组相比,模型组大鼠的海马组织细胞色素C、caspase-3蛋白表达水平显着升高(P<0.01);与模型组相比,针刺组和氟西汀组大鼠海马组织细胞色素C、caspase-3蛋白表达水平显着降低(均P<0.01)。但在下调caspase-3蛋白表达水平方面,针刺改善作用显着优于氟西汀(P<0.01)。4.海马组织AIF蛋白表达水平实验应激28天后,与空白组相比,模型组大鼠的海马组织AIF蛋白表达水平显着升高(P<0.01)；与模型组相比,针刺组和氟西汀大鼠的海马组织AIF蛋白表达水平均显着降低(均P<0.01)。结论1.孤养结合慢性束缚心理应激刺激可使大鼠出现抑郁样行为,针刺与氟西汀干预均能改善抑郁模型大鼠行为学变化,在改善探究行为和躯体活动状态方面针刺明显优于氟西汀。2.针刺干预均能有效降低心理应激导致的模型大鼠海马组织活性氧(ROS)高含量水平,抑制氧化应激引起的一系列不良效应。3.针刺干预能显着降低模型大鼠海马组织线粒体细胞凋亡途径的关键因子细胞色素C和caspase-3、AIF的蛋白表达水平,有效抑制模型大鼠海马线粒体细胞凋亡途径的激活,可能与下调活性氧(ROS)含量有关。4.针刺可能通过调控慢性心理应激—氧化应激—线粒体细胞凋亡途径这一特殊的通路对海马神经元的凋亡产生改善效应,从而发挥抗抑郁的作用。
兰金鑫[2]2007年在《调肝方药加味四逆散抗应激性抑郁症作用机理的初步研究》文中研究说明第一部分理论探讨一、应激与抑郁症的关系应激(stress)是Han Salye于20世纪30年代提出的一种在外环境剧变的刺激时，机体出现的综合应答状态，包括精神、神经、内分泌和免疫等方面的反应。当机体感受应激源时，下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)兴奋性提高，肾上腺分泌应激激素糖皮质类固醇(glucocorticoids，GC)升高，从而动员储能，提高心血管张力，同时血中葡萄糖水平提高，免疫功能受抑制；适当应激反应有利于机体度过短期恶劣环境，保存生命，但若机体长期处于应激状态，HPA轴功能持续亢进，使机体长期处于高水平的GC中，即使是生理性的应激反应对机体也将十分不利。研究表明，长期强烈身心应激严重影响着人类的身心健康，使机体出现抑郁症等多系统疾患，而这些疾患的严重程度无一不是与HPA轴持续亢进、血中GC水平升高密切相关。慢性应激可以诱导抑郁症已成为公认事实，有抑郁症史的自杀病人的行为表现与慢性应激引发症状非常一致。抑郁症病人表现出神经精神缺陷的机制不明，研究发现，抑郁症病人不仅有情绪紊乱，而且有神经精神系统损伤。李云峰等就慢性应激与抑郁症之间的关系提出了如下假设：慢性应激→血中GC水平持续提高→海马等脑区GC受体失敏，盐皮质激素受体(mineralocorticoid reccptors)MR／糖皮质激素受体(glucocorticoidreccprors)GR比例异常→HPA轴功能亢进→高皮质酮血症→缝核-海马系统5-HT等单胺系统传导功能低下、兴奋性氨基酸(EAAs)释放→受体后信号转导系统异常(包括Ca~(2+)失衡)→神经生长因子(neurotrophic growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等神经营养因子mRNA表达降低→海马神经元受损→抑郁症。二、抑郁症的发病机制(一)传统的单胺神经递质假说“单胺假说”由最初的药理学发现发展而来，由于利血平能耗竭中枢儿茶酚胺而导致易患个体抑郁症发作，单胺氧化酶(monoamine oxydise，MAO)为生物胺代谢中的重要酶，单胺氧化酶抑制剂(monoamine oxydise inhibitors，MAOIs)有抗抑郁作用，与其能阻止单胺递质的代谢而增加单胺递质的含量有关，叁环类抗抑郁剂(tricyclicantidepressants，TCAs)能阻止突触前膜对单胺递质的吸收而增加单胺递质的利用。由此，单胺递质假说认为，抑郁症的生物学基础是中枢神经系统突触间隙单胺类神经递质水平或功能下降，药理学的研究也显示，提高中枢神经系统胺类神经递质功能或提高它们在突触间隙的浓度的药物都有改善情绪或治疗抑郁症状的作用。单胺类递质主要包括儿茶酚胺(catecholamine，CA)、5-HT和组胺(HC)。其中儿茶酚胺类递质主要包括NE、DA和肾上腺素(epinephrine，E)，其合成过程是以酪氨酸(tyrosinel作为底物，经过酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)羟化，多巴脱羧酶(DOPA decarboxylase，DDC)脱羧生成，多巴胺经多巴胺-β-羟化酶羟化生成去甲肾上腺素，去甲肾上腺素经苯乙醇胺氮位甲基移位酶催化获得甲基，生成肾上腺素。目前发现主要是5-HT、DA、E、NE与抑郁症的发病关系较为密切。5-羟色胺(serotonin，5-HT)与抑郁症：机体内5-HT有99％存在于外周，有1％存在于中枢神经细胞内。与抑郁症相关的是中枢5-HT系统含量减少。血中色氨酸通过血脑屏障进入脑后，首先在色氨酸羟化酶作用下生成5-羟色氨酸，然后在5-羟色氨酸脱羧酶的作用下脱羧生成5-HT。5-HT被释放到突触间隙后，大部分被神经末梢重摄取，被重摄取后其中一部分重新进入突触小泡内贮存，另一部分是在线粒体单胺氧化酶的作用下，首先脱氨基生成醛，再经醛脱氢酶的作用氧化成5-羟吲哚乙酸，这是5-HT代谢的主要方式。5-HT在脑内灭活的主要方式为5-HT神经元对游离5-HT的摄取。5-HT功能活动降低与抑郁症患者的抑郁心境、食欲减退、失眠、昼夜节律紊乱、性功能障碍、焦虑不安、不能应付应激、活动减少等密切相关。部分叁环类抗抑郁药、5-HT重摄取抑制剂可阻碍5-HT的回收，有抗抑郁作用；而5-HT的前体色氨酸、5-羟色氨酸也可增加突触间隙的5-HT含量，有治疗抑郁症的作用；选择性5-HT耗竭剂可逆转叁环类和单胺氧化酶抑制剂的抗抑郁效应；利血平可耗竭5-HT，导致抑郁。去甲肾上腺素(noradrenaline，NE)与抑郁症：有学者认为，NE缺乏可导致抑郁症的发生，尤其是从脑干的蓝斑色素上皮向边缘系统的投射通路中的NE匮乏。这一假说得到了许多实验的证实，如在抑郁症患者的尿与脑脊液中，NE的代谢产物明显减少。尸检研究发现在抑郁症自杀者的皮层中NE受体的密度明显增加。而当突触的NE释放降低时会使突触后受体上调以发挥代偿作用，因此受体密度的增高反映了NE水平的降低。药理学的研究表明NE再摄取抑制剂可以改善许多病人的抑郁症状，更加说明NE可能参与了抑郁症的形成。NE不足的患者通常难以将注意力集中在目标行为上，并且伴有工作记忆障碍、信息加工过程缓慢、抑郁的情感、注意障碍、精神运动迟滞、疲乏等表现。多巴胺(dophamine，DA)与抑郁症：抑郁症患者脑内DA的代谢与抑郁症有关。一些实验结果显示在抑郁症患者的脑脊液中DA代谢产物的含量减少，另外一些实验的结果却显示出DA代谢产物的含量没有变化或增高，因此DA与抑郁症的关系尚无定论。(二)抑郁症的海马神经元损伤1．长期慢性应激刺激能够持续激活HPA轴，导致GC水平升高。海马是调节HPA轴的高位中枢，且富含糖皮质激素受体(Glucorticoid receptor，GR)，因此极易受到过量GC攻击而受损。正常情况下，海马对HPA轴具有抑制作用，海马受损后这种抑制作用明显减弱，进一步加重HPA轴的亢进。抑郁症时过量的GC会使谷氨酸(glutamate，Glu)释放增加，并抑制Glu在突触间隙内被重摄取，从而引起Glu在细胞外大量聚积。Glu是中枢内主要的兴奋性神经递质。海马内，无论是传入、传出或是中间神经元，绝大多数都属Glu能神经元，而海马CA_3区神经元则全部为Glu能神经元，适量的Glu可介导神经元之间的兴奋传递而维持大脑正常的兴奋性，但过量Glu会对海马产生神经毒性作用。突触间Glu的大量聚积，会激活神经细胞膜上N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体通道，使Ca~(2+)通道开放，Ca~(2+)大量内流，造成胞内Ca~(2+)超载，与钙调蛋白结合于一氧化氮合酶相应位点，催化一氧化氮(NO)生成。NO是一种自由基，它与超氧自由基产生过氧化酸根(ONOO-)，ONOO-损伤线粒体，导致神经元变性、死亡，而且ONOO-能与氢离子形成ONOOH，ONOOH很快分解生成亚硝酸根，亚硝酸根和过氧化亚硝酸根都是损伤性的自由基：ONOO~-又易和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)反应生成一个很强的亚硝基化剂，能使SOD活性中心上的酪氨酸发生亚硝化反应，从而影响SOD的催化功能。此外，由于NO带有额外电子，还可与过氧化氢酶(catalase，CAT)活性中心的铁离子发生反应而抑制了过氧化氢酶的活性。CAT及SOD在体内能消除有害的过氧化物，这样，NO对机体的毒性作用就愈加明显。同时大量NO可进一步增高GC。这样，NO既可通过自身引起的毒性损害海马，又可加重GC对海马的损害。2．BDNF的下调可导致海马神经元的萎缩甚至死亡，这在应激相关的心理疾病中起重要作用。BDNF是5-HT能神经元的生长因子，大鼠中脑慢性注射BDNF可增加5-羟色胺更新率和去甲肾上腺素水平；在成年大鼠新皮质注射脑源性神经营养因子甚至可以产生新的茂盛的5-HT神经末梢。BDNF对5-HT神经元生长和再生的作用提示了神经营养因子与抑郁症之间的关系。在大鼠中缝背核注射BDNF可改善不可逃避电击引起的获得性无助和强迫游泳引起的抑郁。抑郁症患者或创伤后应激失调患者海马体积明显缩小，表明BDNF在抑郁症中的作用已于基础和临床研究中被证实。多种抗抑郁药如单胺氧化酶抑制剂、单胺回收抑制剂可增加脑内BDNF mRNA的表达，上调内源性BDNF水平、逆转海马神经元的萎缩。急慢性电休克治疗的抗抑郁作用至少部分依赖脑源性神经营养因子的上调。叁、抗抑郁剂的作用机制目前，临床上广泛使用的抗抑郁剂主要是基于提高中枢单胺抵制含量策略研发的，主要可以分为以下四类：(一) MAOIs：属于第一代抗抑郁药。作用机理是使脑内神经细胞MAO的活性降低，使单胺类神经递质降解减少，从而提高NE、5-HT、DA的含量而起到抗抑郁的作用。(二) TCAs：是第二代抗抑郁药。属于第一代单胺再摄取抑制剂，作用机理是抑制突触前膜对NE、5-HT的再摄取，提高突触间隙NE、5-HT的含量，从而起到抗抑郁的作用，而且还有抗胆碱的作用。(叁)选择性NE重摄取抑制剂：属于第叁代抗抑郁剂。作用机理是抑制突触前膜对NE的再摄取，但不影响5-HT的再摄取。(四)选择性5-HT重摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)：属于第四代抗抑郁剂。可选择性的抑制突触前膜对5-HT的重摄取，对E、DA、HT及胆碱能神经影响较小。具有与TACs类似的作用。(五) SNRI(5—羟色胺和NE再摄取抑制剂)和NaSSA(去甲肾上腺素能和5—羟色胺能抗抑郁剂)：属于第五代抗抑郁剂。作用机理是能阻断NE能神经元突触前膜α_(2~-)受体，阻断负反馈，促进神经元释放NE，还可以阻断5-HT神经元突触后膜α_(2~-)受体，促进5-HT的释放。四、抑郁症从肝论治的中医理论分析虽然中医学没有“抑郁症”这一病名，但“郁症”、“百合病”等病症实际上属于抑郁症范畴。对郁证早在《内经》时代便有较系统的研究，其中情志内郁致病的思想对后世影响深远。汉代张仲景进一步提出情志之郁以肝郁为主，并创立了治疗肝郁的方药。肝郁多由长期情志不畅所致。临床表现以精神抑郁、萎靡不振、胸闷胁胀、不思饮食、失眠多梦、多疑善虑、悲伤欲哭、善长太息为主症，与现代医学抑郁症的临床表现基本相符。这是因为郁怒不畅使肝失条达，气失疏泄，而致肝气郁结。从中医临床辨证分型也能看出肝郁是造成郁证的核心，同时涉及影响多个脏腑，出现脾虚、肾虚、气郁化火、郁久伤阴、阴虚火旺等多种证型。治疗虽有健脾、补肾、清火、化瘀、安神等方法。但调肝解郁是必不可少的重要环节。由此可见抑郁症与肝关系甚为密切，从调肝的角度治疗抑郁症具有一定的理论基础。关于抑郁症与中医肝的相关性研究可见大量报道。第二部分实验研究第一节加味四逆散(JWSNS)抗抑郁作用的药效学研究采用悬尾方法观察JWSNS的抗抑郁效应。SPF级KM小鼠，雄性，体重17—22g。广州中医药大学实验动物中心提供。自由摄食、饮水，在光暗周期为12h，室温为20-23℃的安静环境适应一周后，小鼠悬尾实验1：将小鼠按体重随机分为5组，按以下方法连续给药7d。(1)正常对照组：每天定时灌服生理盐水0.8ml；(2)中药低剂量组：每天定时灌服0.294g／ml生药0.8ml：(3)中药中剂量组：每天定时灌服0.588g／ml生药0.8ml；(4)中药高剂量组：每天定时灌服1.176g／ml生药0.8ml；(5)氟西汀组：每天定时灌服生理盐水0.8ml，悬尾实验前30分钟以10mg／kg的量腹腔注射百优解溶液。第(1)、(2)、(3)、(4)组给药后1h，第(5)组给药后30分钟，进行小鼠悬尾实验。距小鼠尾尖部约1cm处用医用胶布贴于悬尾箱的支架上，小鼠头部距离箱底约40cm。悬挂时间为6min，用秒表记录后5min的不动时间。不动的标准是小鼠停止挣扎，完全不动。小鼠悬尾实验2：方法同实验1，给药时间延长至14d。小鼠悬尾实验3：方法同实验1，给药时间延长至21d。药物JWSNS组成：柴胡5g、白芍15g、枳壳6g、枸杞子15g、山栀5g、干地黄18g、石决明30g。药材由本校第一附属医院药房提供，经药剂科鉴定均为纯正药材。将中药制成粗粉，首煎将中药粗粉置8倍温水中浸泡0.5h，沸腾后文火煎煮4h，注意均匀搅拌，取汁后经叁层纱布过滤；第二次和第叁次煎煮均分别以6倍水文火煎煮2h，同样方法取汁，合并叁次药液，常规煎煮取汁后浓缩至含生药0.294g／ml、0.588g／ml、1.176g／ml(即用药剂量为成人70kg体重剂量的1、2、4倍)，药液常温冷却后，置4℃冰箱内保存备用。所有数据均以(?)±s表示，采用SPSS11.0统计软件包进行统计分析灌胃JWSNS 7d后，JWSNS低、中、高剂量组与正常对照组比较均无统计学差异，氟西汀组与正常对照组有统计学差异(P＜0.05)；灌胃JWSNS 14d后，JWSNS低、中、高剂量组与正常对照组比较均无统计学差异，氟西汀组与正常对照组有统计学差异(P＜0.05)，灌胃JWSNS 21d后，JWSNS高剂量组与正常对照组比较无统计学差异，JWSNS低、中剂量组与正常对照组比较有统计学差异，氟西汀组与正常对照组有统计学差异(P＜0.05)。说明JWSNS低中剂量有确切的抗抑郁作用。但同时也说明，中药JWSNS的作用时间较长，要连续21天给药方可取效，这说明复方中的抗抑郁活性成分需较长时间才能达到最稳定的血药浓度，发挥疗效，由此可见，进行中药复方成分的优化筛选是我们今后工作的方向。第二节调肝方药加味四逆散对慢性轻度不可预见性应激模型体重和糖水消耗的影响采用Willner P慢性轻度不可预见性应激动物模型，并加以改进。SD大鼠，雄性，体重160-200g广州中医药大学实验动物中心提供。购进后，自由进水进食，在明暗周期为12小时，温度为23±2℃的安静环境饲养一周，进行3天双瓶训练，然按照体重和基础糖水消耗分为3组：正常组(不施加任何刺激)，慢性轻度不可预见性应激组，加味四逆散组(每次早上8：30灌胃中药JWSNS，每次2ml)，慢性应激组每次灌胃等量蒸馏水。正常组与其余各组分房饲养。慢性轻度不可预见性应激模型的复制：正常组与造模组大鼠分房饲养。接受应激处理的组别大鼠单独放在一间独立的房间，在21天接受不同应激源的刺激，应激源包括有限制空间1h、45度斜笼7h、湿笼17h(湿笼是300g铺料倒100ml水，使垫料湿透)、新入侵者(两笼并笼)23h、禁食禁水23h。大鼠按体重和基础糖水消耗分为3组：正常组(不施加任何刺激)，慢性轻度不可预见性应激组，加味四逆散组加味四逆散组，慢性应激组每次灌胃等量蒸馏水。正常组与其余各组分房饲养。经过禁食禁水23小时后，于造模的第7、14、21天进行糖水消耗，并测量体重。糖水消耗实验：用纯水将蔗糖配制成浓度为1％的蔗糖水，于造模后的第一、二、叁周上午8：30，将标号、称重过的盛有纯水和蔗糖水的饮水瓶(200ml)，分别插入鼠笼笼盖左右两端(蔗糖水在左，纯水在右)1h，1h后将饮水瓶取下，称重。计算大鼠的糖水偏爱度。糖水偏爱度=[1h蔗糖水饮用量／(1h蔗糖水饮用量＋1h纯水饮用量)]×100％。造模期间各组大鼠一般状况观察。统计学处理，同第一节二、结果造模第一周，中药组大鼠一直对灌胃表现比较抗拒，前叁天中药组有大便溏臭的状况，从第四天起逐渐好转并消失。精神状态尚可，存在修饰行为。进入造模第二周，中药组大鼠对灌胃抗拒现象逐渐减轻，模型组毛色比较晦暗，修饰行为减少，但中药组和模型组在精神状态上无明显差别。进入造模的第叁周，模型组大鼠整体状况较前两周明显下降，表现在状态，毛色，体重及糖水消耗上；修饰行为基本消失。中药组整体状态要优于模型组。在造模前，各组大鼠的体重无差别(P＞0.05)；经过7天慢性轻度不可预见性应激造模后，模型组、药物组大鼠体重显着低于正常组，差别有统计学意义(P＜0.01)，且模型组、药物组间无显着差异；经过造模14天后，模型组、药物组大鼠体重显着低于正常组，差别有统计学意义(P＜0.01)，且模型组、药物组间有差异(P＜0.05)；经过造模21天后，模型组、药物组大鼠体重显着低于正常组，差别有统计学意义(P＜0.01)，且模型组、药物组间有显着差异(P＜0.01)。在造模前各组大鼠的糖水偏爱无差别，经过21天慢性轻度不可预见性应激造模后，模型组的糖水偏爱度明显低于正常组(P＜0.01)，表明CUMS能引起大鼠糖水偏爱度下降。而JWSNS能够逆转CUMS抑郁大鼠糖水偏爱度的下降。采用双瓶实验来衡量液体消耗实验中的各项指标，结果表明CUMS过程中1％的蔗糖水消耗量和1％糖水偏爱百分比从造模后的第二周起显着下降，并在整个造模过程中均处于较低水平，JWSNS治疗后1％的糖水偏爱度显着提高。表明JWSNS能够使CUMS大鼠的1％糖水偏爱度升高。因此，我们认为JWSNS具有抗应激性抑郁的效应。值得注意的是，第一周造模结束后，正常组，模型组与JWSNS组之间的糖水消耗值很接近，差异无统计学意义，分析其原因，可能是因为被移入另外房间，正常组大鼠在短时间内还不太适应；由于我们采用的CUMS模型是一种慢性的不可预见性的温和刺激，造模力度相对不是很剧烈，所以在造模开始的一周内，模型的效果还不是很明显；而JWSNS组大鼠，由于对灌胃给药的适应性问题及抗抑郁剂的起效时间延迟等因素，在造模开始的一周内还未见明显效果。模型组大鼠的体重下降可能是由于长期慢性应激引起的促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)释放增多，抑制了其摄食中枢，使其食欲下降，摄食减少。我们以往的研究也证实了JWSNS可以减少由慢性应激所导致的CRH过量释放，所以JWSNS组大鼠的体重与正常组无明显差异。体重是当机体处于应激状态下，衡量个体状态的非特异性指标。第叁节JWSNS对慢性轻度不可预见性应激模型大鼠中枢单胺神经递质含量的影响采用SPF级Wistar大鼠，雄性，体重180-220g，广州中医药大学实验动物中心提供。药物和给药方法基本与第二节相同。造模方法，同第二节；大鼠中枢单胺神经递质检测采用高效液相色谱方法。经过21天慢性应激后，模型组大鼠中枢5-HT、NE、DA含量与正常对照组相比显着减低，且差异具有统计学意义(P＜0.01)；JWSNS组中枢NE含量较模型组相比显着升高(P＜0.05)、DA含量与模型相比组显着升高(P＜0.01)，5-HT含量与模型组相比也有升高，但差异无统计学意义。本实验结果表明：CUMS可以引起大鼠中枢单胺递质(包括5-HT、DA、NE)含量的显着降低，(P＜0.01)：JWSNS能够升高CUMS模型大鼠5-HT、DA、NE含量。由此推断上调中枢部分单胺神经递质含量是调肝方药JWSNS抗应激性抑郁症的机制之一，但具体的作用途径与靶点还有待进一步研究。第四节JWSNS对慢性不可预见性应激模型大鼠海马神经元凋亡率的影响动物分组及药物和给药方法基本与第二节相同，造模方法与第二节相同。海马神经元凋亡率采用流氏细胞仪检测分析。模型组大鼠海马神经元大量海马神经元凋亡：正常组与JWSNS组含亚G_1期细胞百分比较小，表明有少量凋亡细胞存在：与正常组相比，模型组细胞凋亡率明显增加(P＜0.01)，与模型组相比，JWSNS组海马神经细胞凋亡率明显下降，提示21天的慢性轻度不可预见性应激模型可引起海马神经元的凋亡，而JWSNS有明显降低海马神经元凋亡率，保护海马神经元的作用。海马神经元损伤近年来被作为应激性抑郁症发病的新机制，本研究发现CUMS模型大鼠海马神经元凋亡率明显升高，这表明海马神经元凋亡是应激性抑郁症的病理基础之一，而JWSNS能明显降低海马神经元凋亡率，具有海马神经元保护作用。基于保护海马神经元的抗抑郁剂开发策略已成为抗抑郁及研发的热点，我们的实验研究结果证实中药复方JWSNS可通过此作用机制发挥抗抑郁效应，但其具体作用环节及作用靶点有待于进一步研究。第叁部分研究结论一、JWSNS能够显着提高大鼠因CUMS引起的糖水偏爱度的下降，表明JWSNS具有抗抑郁作用。二、JWSNS能显着提高CUMS模型大鼠中枢DA、NE的含量，5-HT的含量也有所提高，但与正常组相比，差异无统计学意义。因此，JWSNS可能通过上调部分中枢单胺神经递质含量发挥抗抑郁效应。叁、JWSNS能够降低CUMS引起的大鼠海马神经元凋亡率的升高，具有海马神经元保护作用，这也可能是其抗抑郁作用机制之一。
谢守付[3]2003年在《抑郁症模型鼠海马神经元细胞凋亡的初步研究》文中进行了进一步梳理前言 抑郁症发病率逐年增加，对人类的健康和生命已构成威胁，并引起人们的广泛的关注。既往对抑郁症发病机制的研究长期局限于突触受体水平神经递质含量的变化，目前研究资料证实抑郁症病人有海马结构和功能的变化，近来有研究表明神经元细胞的凋亡可能参与这种海马结构和功能的损害。目前有关神经元细胞凋亡的研究大多集中在脑缺血、脑缺氧等方面，有关精神应激后神经元凋亡的研究少有报导。因此深入研究应激与海马神经元细胞凋亡的关系，揭示应激损害海马的机制，找到有效地阻断或逆转措施，保护海马神经元，将具有很重要的意义和临床应用价值。 因此本实验以慢性应激制作抑郁症动物模型，初步探讨慢性应激、抑郁症、海马神经元细胞凋亡之间的关系。 实验材料 一、实验动物 成年Wistar雄性大鼠20只(由中国医科大学动物实验室提供)，平均体重200g。 二、仪器 YSD-4G型药理生理多用仪、Morph／Cool Snapfx／Ax70图像分析仪。 叁、主要试剂 TUNEL原位杂交试剂盒、即用型SABC免疫组化试剂盒、兔抗鼠Bcl-xl抗体，购于Boster公司。DAB显色剂由Sigma公司生产，Boster公司分装。实验方法一、动物分组 大鼠适应环境一周后采用旷场分析(Open一Field)法测定行为并称重。然后随机分为对照组(5只)，和实验组(15只)。二、动物抑郁症模型的制备 对照组每笼养5只，实验组每笼1只。实验组参照文献，共接受21天各种不同的刺激，包括:电击足底、冰水游泳、热应激、摇晃、夹尾、禁水、禁食、每天给予一种刺激，每种刺激至少给予2次。对照组不接受任何刺激，自由摄食饮水。 叁、标本制备 在实验第22天杀死实验组和对照组。各组大鼠在被处死前均采用Open一Field法测定大鼠的行为并称体重。测定后采用灌注固定，断头、取脑并修块。将脑修块置于4%多聚甲醛溶液中固定48小时以上，梯度酒精脱水，石蜡包埋。 四、海马神经元细胞凋亡的测定 1.用TuNEL原位标记染色，通过图像分析仪分析单个视野下阳性神经元的细胞个数和所占切面面积比。 2.凋亡调控因子的检测通过免疫组化染色，用图像分析仪分析单个视野下阳性神经元的细胞个数和所占切面面积比以及平均目标灰度值。 五、统计学分析: 以上试验结果均采用SPSS for杭ndows 10.0软件分析，组间采用t检验，P值取0.05。实验结果 一、动物行为观察 旷场分析中和对照组比较，实验组大鼠经过21天应激后，方格穿行次数、站立次数减少，差异有显着性，P<0 .01;修饰次数也有类似的变化，两组间差异有显着性，P<0.05;中央格停留时间明显增加，差异有显着性，P<0.01;粪便粒数明显增加，差异有显着性，P<0 .05。 二、体重变化 经过21天慢性应激后，实验组体重显着低于对照组，差异有显着性，P<0.01。 叁、海马中细胞凋亡的情况 1.TUNEL染色在实验组及对照组海马各区均可以观察到细胞核被染成棕黄色的凋亡细胞，但两者有显着差异。从凋亡细胞所占比例、凋亡细胞计数来看，实验组均显着高于对照组，P<0 .01。 2.免疫组化染色在实验组及对照组海马各区均可以观察到细胞质被染成棕黄色的阳性细胞，但两者有显着差异。从阳性细胞所占比例、阳性细胞计数来看，对照组均显着高于实验组，P<0 .01;从平均灰度值来看，较对照组比较，实验组明显增加，P<0 .01。讨论 评价一个抑郁症模型的制作是否成功，主要依据动物在行为上的变化，旷场行为分析就是用来检测大鼠在新异环境中行为的变化。旷场行为中中央格停留时间反映动物的认知能力，穿越格次数反映动物的兴奋性，直立次数和修饰次数反映动物对环境的适应程度和满意程度，粪便粒数反映动物的紧张程度。本模型中动物经21天慢性综合性应激后，其活动明显减少、紧张程度增加、兴趣丧失，这些表现与抑郁症患者所表现的精神运动性抑制、兴趣的改变有很大程度的相似性，表明本实验中大鼠抑郁症模型的制作是成功的。 慢性应激可以诱发抑郁症这在本实验中得到了很好的印证。但慢性应激诱发抑郁症的机制仍未完全阐明。研究发现，慢性应激时海马结构存在器质性改变。在对抑郁症病人的研究中，发现抑郁症患者海马存在与慢性应激大鼠相似的整体形态的改变。因此人们认为慢性应激引起海马结构和功能的紊乱，而导致抑郁症的发作。 目前的研究结果显示，应激可以导致海马神经元缺失、海马体积减少。神经元缺失一般有坏死和凋亡两种形式，到底是哪种形式参与应激对海马的损害，目前尚有争论。 本研究中TUNEL染色可见实验组大鼠和对照组相比较，整个海马以及各亚区在应激后凋亡细胞计数及所占切面面积的百分比增加。 本研究中采用的TUNEL染色法能快速检测出单个凋亡细胞，但其特异性差，容易受到细胞坏死的影响而成假阳性，但研究发现，细胞凋亡是受自身基因调控的。Bcl一过是目前备受关注的凋亡调控因子，它主要?
谢守付, 马慧, 刘伟, 彭淼, 丁宝坤[4]2004年在《抑郁症模型鼠海马神经元细胞凋亡的初步研究》文中研究表明目的 研究抑郁症模型鼠海马神经元细胞的凋亡,探讨海马损害的病理生理机制。方法 选择旷场行为相近的成年SD雄性大鼠30只,随机分为实验组(15只)和对照组(15只),应用分养和长期不可预见的刺激制作成抑郁症模型。采用TUNEL染色法分析细胞凋亡,用免疫组化法检测凋亡的调控因子Bcl-xl。试验结果均采用SPSS 10.0软件处理。结果 与对照组比较,实验组大鼠海马内TUNEL染色阳性细胞增加,表达Bcl-xl蛋白的阳性细胞减少,两组有显着性差异。结论 抑郁症模型鼠海马神经元细胞凋亡增加。
贺金奖[5]2014年在《维生素D抗小鼠抑郁作用的初步研究》文中研究表明目的：观察补充维生素D对抑郁症模型小鼠抑郁样表现是否具有治疗作用并探究其作用机制。方法：分为叁个部分，一、维生素D对小鼠抑郁样表现治疗作用研究；二、维生素D对小鼠抑郁样表现治疗的机制研究；叁、活性维生素D（1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3）对谷氨酸诱导的小鼠海马神经元凋亡抑制作用研究。（1）采用慢性不可预见性温和刺激应激动物模型（Chronic Unpredictable MildStress，CUMS）方法建立抑郁症小鼠模型，采用冰水游泳5min、45℃高温5min、夹尾1min、行为限制2h、禁食24h、禁水24h、潮湿垫料10h、鼠笼倾斜45°24h、昼夜颠倒24h、空瓶放置2h等10种刺激，将雄性ICR小鼠随机分为对照组与Stress组，Stress组每天随机不重复给以2-3种刺激，持续4周，结束后观察小鼠状态、悬尾实验（tail suspension test, TST）与强迫游泳实验（forced swimming test,FST）静止时间及小鼠体重和一般性状来判断小鼠是否出现抑郁样表现；对于Ahi1基因敲除（Ahi1knockout, Ahi1KO）鼠（详见附录一），直接检测其与野生型小鼠悬尾实验与强迫游泳实验静止时间来判断小鼠是否出现抑郁样表现。ELISA法检测小鼠海马匀浆中脑源性神经营养因子（brain derived neurophic factor，BDNF）表达量；（2）按照CUMS方法建立抑郁小鼠模型，模型组ICR小鼠分为：空白对照+Vehicle组、Stress+Vehicle组、Stress+维生素D3组、Stress+丙咪嗪（20mg/kg/d）组，将Ahi1KO鼠分为两组：Vehicle组与维生素D3组，给药治疗4周后检测各组小鼠行为学；眼球取血测量血清维生素D(25-hydroxyvitamin D3,25(OH)D3)水平，取脑后分离海马与脑干，Western Blot检测海马中BDNF的表达，高效液相色谱法检测脑组织中神经递质五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)与多巴胺（Dopamine,DA）的含量，RT-PCR检测海马中CYP24A1、CYP27B1、VDR、BDNF mRNA水平；（3）采用谷氨酸诱导神经细胞凋亡模型，细胞分为对照组、1,25(OH)2D3组、谷氨酸组与谷氨酸/1,25(OH)2D3联合作用组。CCK-8测定细胞存活率，流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡和细胞活性氧（reactive oxidative species，ROS）水平。结果：（1）4周建模后，Stress组小鼠悬尾实验与强迫游泳实验的静止时间显着长于对照组，体重增长明显小于对照组（P<0.05）；Ahi1KO鼠在悬尾实验与强迫游泳实验中的静止时间显着长于野生型小鼠，海马组织中BDNF表达量明显低于野生型小鼠（P<0.05）；给予维生素D3与抗抑郁药治疗后，CUMS模型小鼠与Ahi1KO鼠悬尾实验与强迫游泳实验的静止时间明显减少（P<0.05）,抑郁样表现得到改善，提示维生素D3对小鼠抑郁样表现具有治疗作用；（2）维生素D3治疗后，小鼠海马组织中BDNF表达量升高，5-HT与DA表达量降低，RT-PCR结果显示相对于野生型小鼠，Ahi1KO鼠CYP27B1、VDR mRNA水平升高，CYP24A1、BDNF mRNA水平降低，维生素D3治疗后CYP27B1、VDR、BDNF mRNA水平降低，CYP24A1mRNA表达水平升高，差异均有统计学意义，提示维生素D3可能通过调控Vitamin D-VDR通路来提高BDNF表达，对抑郁症起到治疗作用；（3）1,25(OH)2D3预处理HT-22细胞可以有效提高谷氨酸作用后的细胞存活率。细胞周期显示1,25(OH)2D3可以明显减小谷氨酸作用后HT-22细胞的G0/G1期细胞比例，增加S期与G2/M期细胞比例。相对于谷氨酸组，谷氨酸/1,25(OH)2D3联合作用组细胞晚期凋亡率均有降低，随1,25(OH)2D3浓度增加凋亡率逐步降低。相对于对照组，各处理组均可以使细胞ROS释放增多（P<0.05），而相对于单纯使用谷氨酸组，谷氨酸/1,25(OH)2D3联合应用组细胞ROS水平也有明显升高，但随着1,25(OH)2D3浓度增加细胞中ROS水平逐步降低（P<0.05）。结论：1.维生素D干预可以改善CUMS抑郁模型鼠和Ahi1基因敲除鼠抑郁样表现；2.维生素D可以抑制谷氨酸诱导的海马神经元凋亡；3.维生素D对抑郁症治疗作用的实现可能通过激活Vitamin D-VDR信号通路提高脑组织中脑源性神经营养因子BDNF表达水平和抑制海马神经元凋亡来共同发挥作用，这提示维生素D可能成为抑郁症的廉价预防措施和辅助治疗措施。
吴丽丽[6]2006年在《运用肝主疏泄理论防治应激性抑郁症的基础研究》文中进行了进一步梳理抑郁症是一种常见的精神疾病,其终生患病率高达15%～20%。抑郁症居高不下的发病率以及造成的危害,已经越来越引起医药卫生界的重视。抗抑郁药物有着潜在的市场需求,中药抗抑郁新药的研制开发才刚刚起步,研究的深度和广度都有待进一步提高,但市场开发的潜力是巨大的。 基于单胺策略开发的抗抑郁剂在临床上出现疗效滞后现象,并且大约有30%左右的重度抑郁症人群对目前的各型抗抑郁剂没有反应。由于抑郁症所涉及的病理因素复杂,存在着许多潜在的抗抑郁治疗靶点。大量的动物实验研究和临床研究证据都指引我们要超越单胺能突触策略去提高抗抑郁剂疗效。 另外,基于单胺策略的抗抑郁剂对特定脑区的NMDA受体适应性改变,即下调NMDA受体功能,产生类似NMDA受体拮抗剂的作用,可能是其抗抑郁效果的实质。大量动物实验与临床研究表明NMDA受体拮抗剂具有抗抑郁效果,拮抗NMDA受体功能可改善重症病人症状,而且比现有的抗抑郁药发挥作用更快。由此可见,调控NMDA受体的抗抑郁策略可能比传统的单胺策略更具优势。NMDA受体拮抗剂的最大问题就是出现精神病副作用,NMDA受体复合体上有多个调控位点以及NMDA受体本身的异质性能提供了一些选择性的药物作用靶点,针对它们的拮抗剂可以预防兴奋性毒性,又不阻断全部NMDA受体,避免毒副作用的产生。 综上所述,抗抑郁效果的一个重要特征就是能够使失常的谷氨酸功能正常化。而这种正常化可以通过直接作用于谷氨酸能突触靶点,或者间接地通过其他神经递质系统如5-HT,NE,GABA间接影响谷氨酸能系统。 本研究团队在1999年在国内首次提出的假说:中医肝主疏泄调畅情志的功能在实现对交感—肾上腺髓质以及下丘脑—垂体—肾上腺皮质系统的整体性调节上,还可能存在着一定的具体的中枢神经机制(包括相关不同脑区的定位、定量以及神经生理生化及病理改变等);在作用机理上体现出局部(中枢神经机制)与整体(NIM网络)的有机统一。并以加味四逆散(JWSNS)作为调肝方药的代表方,对其调控机体心理应激反应的机制进行了一系列的研究,初步证实了我们的研究假说。 在此基础上,本研究以心理应激性损伤所致的抑郁症为研究切入点,结合抑郁症最新的病理机制研究进展与我们的前期工作基础,我们进一步提出假说:肝主疏泄调畅情志抗抑郁的中枢神经机制可能是通过下调NMDA受体功能,抗兴奋性毒性,减轻应激性海马损伤,保护海马神经元,调控HPA轴有关。 本研究以心理应激损伤所致抑郁症为研究对象,结合调肝治法方药的作用机理,依据中医方—证一效—脏腑相关性理论,进一步揭示中医肝脏象功能的本质以及中医“肝主疏泄”理论的科学内涵;丰富和创新中医脏象和情志致病理论,为系统构建运用中医调肝治法方药防治心理应激性损伤疾病的理论体系提供科学的依据。同时也为今
姜会梨[7]2018年在《针刺对CRS大鼠海马TLR4信号通路/NLRP3炎性小体诱导免疫/炎性激活的抗炎效应机制》文中进行了进一步梳理背景和目的抑郁症(Depression)是一种临床常见的精神障碍疾患,具有高患病率、高致残率、高复发率和高社会疾病负担的特点。当今,抑郁症的病因及病理机制研究仍然缺乏重大突破,其治疗尚缺乏有效治疗手段。大量临床和实验研究提示,应激诱导的免疫/炎性反应激活参与了抑郁症的发病和病理过程。目前,众多来自临床和实验的研究证实了针刺抗抑郁的有效性和安全性,然而其具体作用机制尚不明确。本研究在本团队前期研究基础上,采用慢性束缚应激(Chronic restraint stress,CRS)模拟抑郁症模型,假设针刺是通过对模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫/炎性反应激活效应在上游产生调节作用,进而发挥抗抑郁效应。这是本研究的切入点和创新点。方法将44只雄性SD大鼠随机分为4组:正常组、模型组、艾司西酞普兰组和针刺组。除正常组外,其余各组大鼠均采用慢性束缚应激(CRS)结合孤养模拟抑郁症模型、持续接受21天慢性束缚应激刺激;艾司西酞普兰组大鼠每日在慢性束缚应激刺激前1h进行艾司西酞普兰(30mg/kg)灌胃给药;针刺组大鼠每日在慢性束缚应激刺激前1h进行针刺“百会”和“印堂”穴干预,进行以下研究:(1)针刺干预对CRS大鼠抑郁样行为的影响。各组大鼠分别于0 day、7 days、14 days和21days进行体重(Body weight)监测、糖水偏好实验(Sucrose preference test)和旷场实验(Open field test),观察不同组别大鼠在不同时间点体重变化、体重增加量、糖水消耗量、纯水消耗量、总液体消耗量、糖水偏好指数、水平运动评分和垂直运动评分,观察针刺对CRS大鼠自然生长和整体情况、快感缺乏程度、自发活动和探索行为的影响,探究针刺抗抑郁效应。(2)针刺对CRS大鼠海马小胶质细胞活化介导的免疫/炎性反应和细胞凋亡的影响。实验结束(第21天)后,采用免疫组化法观察海马小胶质细胞活化情况;应用TUNEL实验观察海马神经元凋亡情况;采用ELISA法检测各组大鼠血清炎性因子IL-1β、IL-10和TNF-α表达变化。探究针刺干预对CRS大鼠海马小胶质细胞活化介导的免疫/炎性反应和细胞凋亡的影响。(3)基于模式识别受体TLR4/NLRP3信号通路的针刺抗抑郁机制研究。实验结束后,采用Western blot技术观察不同组别大鼠海马TLR4信号通路关键蛋白(TLR4,MyD88,TRAF6,NF-κB p65,TNF-α)和 NLRP3 炎性小体关键蛋白(NLRP3,ASC,Caspase-1,IL-1β,IL-18)的表达变化;应用RT-PCR技术观察不同组别大鼠海马TLR4、NLRP3、MyD88和NF-κB p65 mRNA表达变化。以模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫/炎性反应激活为切入点,探究针刺抗抑郁效应机制。结果(1)针刺干预对CRS大鼠抑郁样行为的影响。行为学分析:①各组不同时间点体重和体重增加量变化结果显示:实验前(0 day),各组基线水平差异无统计学意义;与正常组比较,模型组大鼠体重变化在7 days、14 days和21 days均明显低于正常组(P<0.01;P<0.01;P<0.01),模型组大鼠体重增加量在7 days和14days均明显低于正常组(P<0.01;P<0.01);与模型组比较,针刺组体重和体重增加量均值在7 days、14 days和21 days 均明显高于模型组(P<0.01,P<0.01,P<0.01;P<0.01,P<0.01,P<0.05);值得注意的是,针刺组体重均值在7days和21 days明显高于艾司西酞普兰组(P<0.01;P<0.01)。可见,针刺对CRS诱导体重下降的逆转作用早于且在一定程度上优于艾司西酞普兰。②各组不同时间点糖水消耗量、纯水消耗量、总液体消耗量及糖水偏好指数数据分析显示,实验前(0 day),各组基线水平差异无统计学意义。随着时间推移应激负荷增加,CRS作为应激源可诱导大鼠糖水消耗量及总液体消耗量下降、糖水偏好指数显着降低(P<0.01;P<0.01;P<0.01),大鼠机体对糖水奖赏的敏感性降低、快感缺乏程度加重。然而,针刺干预有效逆转了 CRS诱导的大鼠糖水消耗和糖水偏好指数降低,增强大鼠机体对糖水奖赏的敏感性、减轻快感缺乏程度,针刺干预表现出明显的抗抑郁效应。③各组不同时间点水平运动评分和垂直运动评分数据分析显示:实验前(0 day),各组基线水平差异无统计学意义。与正常组比较,模型组水平运动评分均值在7 days、14 days和21 days均明显持续低于正常组(P<0.01;P<0.01;P<0.01),模型组垂直运动评分均值在14 days和21days均明显持续低于正常组(P<0.01;P<0.01),自发活动和探究行为明显受到抑制;与模型组比较,针刺组水平运动评分均值在7 days、14 days和21 days均明显高于模型组(P<0.01;P<0.01;P<0.01),针刺组垂直运动评分均值在14days和21days均明显高于模型组(P<0.01;P<0.01)。值得注意的是,针刺组水平运动评分均值在7days明显高于艾司西酞普兰组(P<0.01),针刺组垂直运动评分均值在14 days明显高于艾司西酞普兰组(P<0.01)。可见,针刺对CRS诱导自发活动和探究行为抑制的逆转作用在一定程度上早于艾司西酞普兰。(2)针刺对CRS大鼠海马小胶质细胞活化介导的免疫/炎性反应和细胞凋亡的影响。①各组大鼠海马小胶质细胞活化情况数据分析显示,正常组海马小胶质细胞处于“静息”态。与正常组比较,模型组海马CA1、CA2、CA3和DG区小胶质细胞显着活化,胞体体积增大、突起缩短增粗,活化细胞数量显着增加(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01),且IBA-1阳性细胞显着增加。与模型组比较,针刺组和艾司西酞普兰组活化小胶质细胞和IBA-1阳性细胞显着少于模型组(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01)。可见,针刺干预有效逆转了持续慢性束缚应激诱导海马小胶质细胞活化。②各组大鼠海马CA1、CA2、CA3和DG区观察及TUNEL阳性细胞数据分析显示,正常组海马CA1、CA2、CA3和DG区细胞核呈蓝色、呈均匀分布。与正常组比较,模型组海马CA1、CA2、CA3和DG区均可见较多细胞核呈棕黄色、固缩,细胞分布散乱,模型组海马TUNEL阳性细胞数目较正常组显着增多(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01)。可见,持续 CRS 诱导海马 CA1、CA2、CA3和DG区神经元凋亡。与模型组比较,针刺组和艾司西酞普兰组海马CA1、CA2、CA3和DG区TUNEL阳性细胞数目显着低于模型组(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01)。可见,针刺干预有效逆转了持续CRS诱导海马神经元凋亡。③各组大鼠血清炎性因子IL-1β、IL-10和TNF-α表达结果分析显示,CRS诱导了血清炎性因子IL-1β、TNF-α显著升高(P<0.01;P<0.01)和IL-10降低(P<0.01);与模型组相比,针刺组和艾司西酞普兰组血清中IL-1β显著低于模型组(P<0.01;P<0.01)、而血清IL-10显着高于模型组(P<0.01;P<0.01)。(3)基于TLR4/NLRP3信号通路介导的免疫/炎性反应激活途径的针刺抗抑郁机制。研究结果显示:①慢性束缚应激诱导了抑郁模型大鼠海马TLR4信号通路关键蛋白(TLR4,MyD88,TRAF6,NF-κB p65,TNF-α)和 NLRP3 炎性小体关键蛋白(NLRP3,ASC,Caspase-1,IL-1β,IL-18)的显着上调表达,并且 TLR4、MyD88、NF-κB 的 mRNA 也上调显着。值得注意的是,针刺和艾司西酞普兰干预对海马水平免疫炎性反应激活具有显着调节作用。与模型组比较,针刺干预显着逆转了慢性束缚应激诱导海马中TLR4、NLRP3、MyD88、NF-κB、Caspase-1、TNF-α蛋白上调表达水平,针刺组 TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、NLRP3、Caspase-1 蛋白表达水平显着低于模型组(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01,P<0.05),而艾司西酞普兰干预对TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平的调节作用差异无统计学意义。此外,与模型组比较,针刺干预对海马TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA也具有明显调节作用,针刺组海马TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表达明显低于模型组(P<0.05;P<0.05;P<0.05),而艾司西酞普兰对其调节作用差异无统计学意义。结论(1)应激诱导了 CRS大鼠海马和血清免疫/炎性反应激活,以模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫/炎性激活可能是连接应激和抑郁症的关键途径;(2)针刺干预对以模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫/炎性激活具有显着调节作用、减缓CRS诱导的海马小胶质细胞活化和神经元凋亡,发挥抗抑郁效应。可见,对以模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫/炎性激活进行广泛调节可能是针刺发挥抗抑郁效应的重要途径;(3)值得注意的是,除了同样对CRS诱导的信号通路下游海马水平Caspase-1及血清IL-1β、IL-10等炎性因子表达水平具有调节作用,针刺能对TLR4、MyD88、NF-κB蛋白和mRNA具有显着调节作用,在以模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫炎性激活效应上游产生调节作用,这可能是针刺抗抑郁效应优势机制所在。但其机制的特异性尚不明确,将是我们接下来的重要研究方向。
马广丽[8]2008年在《氧化应激与神经（精神性）疾病发病相关性的初步研究》文中研究说明神经退行性疾病是指神经系统的组织发生病变或机能发生障碍的疾病;精神性疾病主要是大脑功能紊乱及病变而发生的感觉、记忆、思维、感情、行为等方面表现异常的疾病。据世界卫生组织统计,神经退行性疾病(包括衰老和帕金森病)和精神性疾病(抑郁症)的发病率正逐年增加,对人类的健康和生命已构成威胁,并严重影响了人们的生活质量,也给整个社会经济带来严重的损失。目前,我国有数百万人患有帕金森病,并且患者逐年增加,有年轻化的趋势。据统计,在65岁以上的老人中,帕金森病发病率为1%;在80岁以上的老人中,帕金森病的发病率上升为2%。而来自美国加州大学的最新调查报告也显示:全球抑郁症的患病率已高达6%-11%,已经成为世界第4大疾病。随着社会老龄化趋势的逐步加快,衰老也成为国际社会普遍关注和重视的焦点。这些疾病给家庭和社会造成了极大的损失。如果不采取有效措施,损失还将继续加剧。因此,探讨疾病的发病机制,研究有效的治疗药物,提高患者的生活质量,减轻社会负担,已成为医学界重点关注的问题之一。目前,衰老、帕金森病及抑郁症的病因尚不完全清楚,一般认为环境因素、遗传突变、线粒体功能紊乱、兴奋性毒性损害、氧化应激、炎症反应等因素均可能参与了疾病的发病过程。近年来氧化应激在衰老、帕金森病及抑郁症发病过程中的作用日益受到重视。研究表明,它们可能具有相同的发病机制,其中氧化应激可能是其共有的特征。在神经退行性疾病和精神性疾病中,自由基产生增多、脂质过氧化反应、钙稳态失调以及细胞色素C释放,是氧化应激产生的主要原因。尽管氧化应激被认为与凋亡以及坏死性神经元细胞死亡有关,但导致细胞死亡过程的细胞外信号、受体及其下游信号传递通路却不十分清楚。因此探讨氧化应激与神经退行性疾病和精神性疾病发病的相关性,揭示氧化应激损伤作用的分子机制,对有效预防和治疗相关疾病并最终攻克它们有重要价值。本研究以D-半乳糖注射的小鼠衰老模型、6-羟基多巴胺纹状体损毁的大鼠帕金森病模型、慢性轻度不可预见性应激结合孤养建立的大鼠抑郁症模型为研究对象,利用免疫组织化学、免疫学及生物化学等技术手段系统地研究了衰老、帕金森病及抑郁症与氧化应激的关系,及相关分子在其中可能发挥的作用。研究发现,D-半乳糖腹腔注射后小鼠运动能力、脾指数、胸腺指数及脾细胞增殖活性下降;6-羟基多巴胺注入纹状体后大鼠黑质神经元数目减少;慢性应激刺激后大鼠活动减少、兴趣丧失、快感缺乏、海马神经元数目减少、海马中BDNF表达降低,这些结果表明成功建立了衰老、帕金森、抑郁模型。与此同时,通过观察SOD、MDA等氧化应激指标,发现模型动物体内氧化应激加剧,具体表现为SOD的活性降低,MDA的含量升高,这表明氧化应激参与了疾病的发生过程,可能是叁种疾病相同的发病机制。这些结果进一步说明,尽管叁种疾病各有其发病机制,但氧化应激与叁种疾病的发生发展具有极其密切的关系,可能是造成神经元损伤的主要因素。因此针对氧化应激开发相应的药物,可能在这叁种疾病的治疗中发挥良好的效果。
董晗[9]2017年在《miR-182/124-APLN对癫痫发作后神经元损伤调控机制研究》文中进行了进一步梳理控制癫痫发作始终是癫痫治疗的关键环节,但癫痫发作后神经元损伤、胶质细胞增生、苔藓纤维发芽(MFS)等加重兴奋性异常网络形成也不容忽视。神经元损伤既是癫痫发作的结果也是癫痫再发和难治性癫痫形成的原因。尽管国内外学者在癫痫频繁发作及癫痫持续状态后神经元损伤方面做了大量工作,对损伤机制有一定认识,但具体机制、如何应对尚无定论。故而如何减轻癫痫发作后神经元损伤,防治癫痫进展与控制癫痫发作同样重要。本研究以验证miR-182、miR-124和APLN之间的关系为前提,探讨APLN在癫痫发生以及对癫痫发作后神经元损伤的调控机制,从而为减轻癫痫发作后神经元损伤、防治癫痫进展奠定理论基础。第一部分miR-182和miR-124靶基因预测及初步鉴定目的:1、根据miRNAs靶基因生物信息数据库分析,预测miR-124和miR-182的靶基因。2、研究miRNA-182/124、APLN在癫痫患者和正常人血液中的差异表达;分析癫痫患者与正常患者中miR-182/124和APLN的相关性。方法:1、通过生物信息学软件可以对miRNAs的靶基因进行预测,经Target Scan、NCBI、miRbase、micrriorna.org等多个生物信息学软件预测后综合分析结果。2、随机选择癫痫患者30例,健康对照组30例,采集肘部静脉血5ml左右;实时荧光定量PCR(q-PCR)检测miRNA-182/124、APLN在癫痫患者和健康人血液中的表达差异。结果:1、根据miRNAs靶基因生物信息数据库分析结果,选择miR-124和miR-182的共有靶基因APLN为预测靶基因。2、通过q-PCR技术检测,我们发现miR-124在癫痫患者中表达量显着低于对照组(P<0.05);miR-182在癫痫组也体现同样的表达趋势,在癫痫患者中表达量低于对照组(P<0.05);然而APLN基因在癫痫患者中显着高于正常组,并且差异为倍数表现极为显着(p<0.01)。总体趋势,在癫痫组和对照组组均可见到mir-124、mir-182表达量同apln基因呈负相关表达趋势。结论:1、根据mirnas靶基因生物信息数据库分析,预测apln可能是mir-124和mir-182的靶基因之一。2、与健康人群相比,癫痫患者外周血中存在mir-182、mir-124和apln的差异表达,表明mir-182、mir-124和apln可能参与癫痫的发生和发展,为进一步研究mir-182/124-apln对癫痫的调控机制奠定基础。第二部分mir-182和mir-124与预测靶基因apln靶标关系验证目的:构建mir-182/124表达载体和双荧光素酶报告基因载体;应用各种实验验证mir182/124与apln之间的关系及mir182/124对细胞凋亡的影响。方法:1、通过mirbase数据库分别设计了mir-124-3p和mir-182-5p的过表达载体和干扰载体。再利用ucsc数据库和ncbi数据库设计双荧光素酶报告基因载体。2、应用双荧光素酶报告基因检测mir182/124-与靶基因apln荧光素酶活性。3、应用qpcr、westernblot技术验证mir182/124与apln在基因和蛋白水平的关系。4、应用流式细胞仪检测mir182/124对神经元细胞凋亡的影响,应用westernblot技术检测mir182/124过表达和干扰载体中凋亡相关基因bax、casepase-3和bcl-2蛋白表达变化。结果:1、成功构建mir-182/124mimics,inhibitor,mir-shnc表达载体及构建了双荧光素酶报告基因载体:mir-182-apln-wt(野生型识别序列为ttgccaa)、mir-182-apln-mut(突变型识别序列为catgtag)、mir-124-apln-wt(识别序列为gtgcctt)和mir-124-apln-mut(识别序列为catgtag)。2、通过双荧光素酶报告基因系统检测,我们发现mir-182和mir-124mimics分别与apln基因野生型、突变型、空载等叁种报告载体进行共转染后,荧光素酶活性检测结果显示,mir-124+apln-wt组的荧光素酶活性低于mir-124+apln-mut共转染组和mir-124+si组,但不显着;而mir-182+apln-wt组荧光素酶活性与它两组相比显着降低(p<0.05),mir-182+apln-mut组和mir-182+si组酶活性差异不明显。3、通过实施荧光定量检测发现,mir-182在mir-182mimics组表达量显着高于mir-182inhibitor组(p<0.01),说明mir-182成功的在大鼠神经元细胞中进行了过表达和干扰;而apln基因在mir-182mimics组显着低于mir-182inhibitor组(p<0.01),总体而言,mir-182在mrna水平上抑制apln基因的表达。与此同时,mir-124在mir-124mimics组表达量也显着高于mir-124inhibitor组(p<0.01),mir-124成功进行了过表达和干扰。但是apln基因和mir-124的表达量呈现相似的趋势,并无负相关。利用westernblot技术发现,mir-182过表达后apln蛋白表达量明显低于mir-182被沉默后的表达量。但是mir-124过表达后,apln蛋白表达量并无显着的下调趋势,而是呈现相对最高的表达量。4、流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,神经细胞转染mir-182mimics、mir-182inhibitor和mir-shnc细胞凋亡率分别为19.09%、14.01%和17.6%;转染mir-124mimics、mir-124inhibitor和mir-shnc的细胞凋亡率分别为18.77%、13.83%和17.44%。5、westernblot实验中:casepase-3、bax蛋白表达量在mir-182/124mimics、mir-182/124inhibitor、mir-shnc及control组中呈下降趋势;而bcl-2蛋白表达量在各组转染细胞中大致呈上升趋势。结论:1、mir-182与apln之间存在靶标关系。mir-124同样能与apelin有结合,但可能结合的并不牢固。2、mir-182可以在mrna和蛋白水平上抑制apln表达;但mir-124并不能直接调控apln基因的表达水平。3、mir-182/124均能够促进神经细胞的凋亡,还可抑制bcl-2的蛋白表达量,上调bax和caspase-3的蛋白表达量;但mir-124可能通过apln外的其他介质进行调控。第叁部分apln对癫痫发作后神经元保护作用体内、外机制研究目的:1、建立癫痫细胞模型、动物模型。2、研究apln在癫痫发生发展过程中的作用机理。3、进一步探讨mir-182-apln在癫痫发作后的调控机制。方法:1、无镁细胞外液建立海马神经元癫痫细胞模型并培养细胞;向癫痫细胞中分别转染pbi-cmv3-apln过表达载体、空载、mir-182mimics(mir-182模拟物)载体和aplnshrna(干扰apln)载体;应用流式细胞术检测上述各载体中海马神经元凋亡率。2、建立ptz诱发癫痫大鼠模型,向体内注入apln过表达质粒、apln沉默质粒、mir-182mimics质粒及对照质粒;通过q-pcr检测海马组织中mrna表达。3、在癫痫体内、外模型中,应用westernblot检测过表达和沉默apln对谷氨酸受体1(mglur1)及对细胞凋亡相关因子bax、caspase-3、bcl-2、p-akt的调控作用。结果:1、向大鼠海马神经元癫痫细胞模型中分别转染pbi-cmv3-apln过表达载体、空载、mir-182mimics和aplnshrna载体,各载体可以在大鼠神经元中高效表达,证明转载成功。转染后48h,流式细胞术检测大鼠海马神经元凋亡水平的变化。结果显示,转染pbi-cmv3-apln过表达载体、空载、mir-182mimics和aplnshrna细胞凋亡水平分别为4.00%、15.55%、17.90%、18.89%,结果表明apln可显着抑制细胞凋亡。2、观察癫痫大鼠模型行为学改变,成功建立点燃模型36只,随机分为4组注入上述不同质粒后,通过q-pcr检测apln基因在海马组织中的表达量发现,apln过表达组成功的在大鼠海马组织进行了人为干预的上调表达;而在apln沉默组和mir-182过表达组,apln的表达量低于未受干涉的癫痫大鼠海马组织,但apln沉默组与mir-182过表达组无明显差异。3、向癫痫细胞模型转染PBI-CMV3-APLN过表达载体、空载、miR-182 mimics和APLN shRNA载体48h后,Western blot检测结果显示:mGluR1蛋白在APLN过表达组<shNC<miR-182 mimics<APLN shRNA(p<0.05)(图10-A,10-B);p-AKT-PBI-CMV3-APLN过表达组>shNC>miR-182 mimics>APLN shRNA(p<0.05)(图10-A,10-C);Bax-PBI-CMV3-APLN过表达组<shNC<miR-182mimics<APLN shRNA(p<0.05)(图10-A,10-D);Caspase3-PBI-CMV3-APLN过表达组<shNC<miR-182 mimics<APLN shRNA(p<0.05)(图10-A,10-E);Bcl-2-PBI-CMV3-APLN过表达组>shNC>miR-182 mimics>APLN shRNA(p<0.05)(图10-A,10-F);4、对癫痫大鼠海马组织进行Western blot检测显示:细胞存活促进因子Bcl-2蛋白在APLN过表达组、shNC对照组、miR-182 mimics组、APLN shRNA组总体呈现下调表达趋势;而过表达miR-182 mimics组和APLN沉默组相比,Bcl-2蛋白表达量相差不明显。但是促进细胞凋亡基因Bax、细胞凋亡执行因子Caspase3、代谢型谷氨酸受体1(mGluR1)依上述载体顺序总体呈现上调表达趋势。结论:1、体内、外癫痫模型实验均证实,APLN抑制mGluR1,可减少神经细胞毒性造成的神经细胞损伤,并可降低神经兴奋性缓解癫痫发作。APLN可能通过PI3K/p-Akt途径发挥抗凋亡神经保护作用。APLN还下调Bax、Caspase-3促凋亡因子的表达,上调Bcl-2抑凋亡因子的表达减少细胞凋亡所引起的神经元损害,对癫痫发作后神经损伤起到保护作用。2、推测miR-182能通过下调靶基因APLN的表达,加重癫痫后神经细胞损伤,反之,抑制miR-182可上调APLN表达,从而对癫痫发作后神经元损伤起到保护作用,可能成为未来癫痫发作后神经元保护治疗途径。
董海影[10]2009年在《柴胡疏肝散对抑郁模型大鼠海马乙酰胆碱代谢的影响》文中进行了进一步梳理目的观察抑郁症模型大鼠海马ACh代谢的变化规律及柴胡疏肝散对其影响,进一步探讨胆碱能神经系统在抑郁症发生发展过程中所起的作用以及柴胡疏肝散的抗抑郁作用机制。方法4～5月龄的Sprague-Dawley雄性大鼠,通过行一次敞箱实验,剔除分数高于120或低于30的大鼠后,60只SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、西药对照组和中药治疗组,共4组,每组15只。对照组每笼饲养5只,常规饲养,不予任何刺激与治疗。模型对照组、西药对照组和中药治疗组大鼠每笼1只孤养。接受21d慢性轻度不可预见性应激刺激。西药组和中药组大鼠在造模的同时分别给予氟西汀及柴胡疏肝散干预,模型组给予等体积生理盐水。21d后,采用敞箱实验、糖水消耗量检测和体重检测等指标评定大鼠行为学改变,采用免疫组织化学染色法观察大鼠大脑组织海马区ChAT与AChE的蛋白表达变化,应用RT-PCR检测ChAT mRNA的表达,利用比色法检测大鼠大脑组织海马区的AChE活性,采用电镜观察大脑组织海马CA3区超微结构变化,同时利用流式细胞术检测大脑组织海马CA3区的细胞凋亡。结果1、柴胡疏肝散增加抑郁模型大鼠体重、糖水偏爱度、水平运动得分和垂直运动得分。造模7d后,与正常对照组相比,模型组水平运动得分与垂直运动得分明显降低(P<0.05),糖水偏爱度与体重增长都有降低趋势但无显着性差异(P>0.05),与模型组相比,西药组和中药组水平运动得分、垂直运动得分均升高(P<0.05),体重与糖水偏爱度均无显着性差异(P>0.05);造模14d后,与正常对照组相比,模型组的水平运动得分、垂直运动得分、体重与糖水偏爱度均明显降低(P<0.05-0.01),与模型组比较,西药组和中药组水平运动得分、垂直运动得分与糖水偏爱度均明显升高(P<0.05～0.01),体重也升高但无显着性差异(P>0.05);造模21d后,与正常对照组相比,模型组水平运动得分、垂直运动得分、体重和糖水偏爱度继续明显降低(P<0.01～0.001),与模型组比较,西药组和中药组水平运动得分、垂直运动得分、糖水偏爱度与体重均明显升高(P<0.05～0.001)。2、柴胡疏肝散具有下调抑郁模型大鼠海马组织ChAT的蛋白和mRNA表达的作用。RT-PCR结果显示,与正常对照组相比,模型组大鼠海马区ChAT mRNA表达明显上调(P<0.05),与模型组相比,西药组、中药组海马区ChAT mRNA明显下调(P<0.05);但西药组ChAT mRNA下调较中药组明显。免疫组化法结果显示,与正常对照组相比,模型组海马区ChAT的蛋白表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,西药组和中药组大鼠海马区ChAT的蛋白表达均明显降低(P<0.05)。3、柴胡疏肝散降低抑郁模型大鼠海马组织AChE活性和蛋白表达。比色法结果显示,与正常对照组相比,模型组海马区AChE活性明显升高(P<0.05);与模型组相比,西药组、中药组海马区AChE活性明显下降(P<0.05)。免疫组化法结果显示,与正常对照组相比,模型组海马区AChE的蛋白表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,西药组、中药组海马区AChE的蛋白表达均明显降低(P<0.05)。4、柴胡疏肝散抑制抑郁模型大鼠海马组织的细胞凋亡。流式细胞术检测结果显示,与正常对照组相比,模型组海马CA3区凋亡细胞平均数明显增加(P<0.05);与模型组相比,西药组、中药组海马CA3区凋亡细胞平均数明显减少(P<0.05)。同时,电镜观察结果也显示,海马凋亡细胞主要集中在模型组、西药组和中药组。结论1、CMUS结合孤养建立的大鼠模型,可较好地模拟抑郁症行为学表现,可作为抑郁症模型之一。2、柴胡疏肝散具有改善实验动物的抑郁症状作用。3、胆碱能神经系统与抑郁症发生发展有密切关系。4、柴胡疏肝散抗抑郁症的作用可能与其抑制大脑组织海马区ChAT蛋白和mRNA表达、降低大脑海马区AChE活性和蛋白表达,减少大脑海马区神经细胞凋亡有关。
参考文献：
[1]. 针剌调控抑郁模型大鼠海马活性氧—线粒体途径—凋亡机制研究[D]. 郭郁. 北京中医药大学. 2016
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[7]. 针刺对CRS大鼠海马TLR4信号通路/NLRP3炎性小体诱导免疫/炎性激活的抗炎效应机制[D]. 姜会梨. 北京中医药大学. 2018
[8]. 氧化应激与神经（精神性）疾病发病相关性的初步研究[D]. 马广丽. 吉林农业大学. 2008
[9]. miR-182/124-APLN对癫痫发作后神经元损伤调控机制研究[D]. 董晗. 吉林大学. 2017
[10]. 柴胡疏肝散对抑郁模型大鼠海马乙酰胆碱代谢的影响[D]. 董海影. 黑龙江中医药大学. 2009
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