李京涛[1]2012年在《HCV 1b亚型NS5A氨基酸变异对慢性丙型肝炎抗病毒治疗的影响》文中研究说明研究背景和目的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染可导致慢性肝病、肝硬化、肝细胞癌等,是肝脏疾病的主要原因之一。WHO评估目前全球约有1.8亿人口感染HCV(感染率：3%)。我国人群抗-HCV阳性率约为3.2%,全国约有4000万人感染HCV。聚乙二醇化干扰素(Pegylated interferon, PEG-IFN)联合利巴韦林(Ribavirin, RBV)治疗是目前慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C,以下简称为CHC或慢性丙肝)患者的标准方案。但此方案对HCV1b亚型的疗效欠佳,持续病毒学应答率(SVR)仅约为50%。在对HCV1b型基因序列的研究中,许多报道发现HCV NS5A蛋白多个区域的氨基酸(amino acid, aa)序列突变与IFN、IFN/RBV的疗效有关,这些区域包括ISDR (aa2209-2248)、PKRBD (aa2209-2274)、V3(aa2356-2379)、IRRDR (aa2334-2379)。ISDR:1995年日本学者研究发现HCV的非结构蛋白5A区(NS5A) C端2209-2248位氨基酸突变数目可作为HCV1b型干扰素疗效的独立预测因素,干扰素应答组患者的ISDR变异数目高于无应答组病人。遂把HCV NS5A2209-2248氨基酸序列命名为干扰素敏感性决定区(IFN sensitivity-determining region, ISDR)。其重要的研究结论为：HCV1b型患者ISDR区氨基酸序列与干扰素疗效密切相关,与HCV-J相比,突变型(氨基酸变异≥4个)对干扰素敏感,中间型(氨基酸变异1-3个)和野生型(未变异)不敏感。此结论被日本的诸多后续研究证实,但是来自欧洲和美国的多项研究结果与这一结论存在矛盾之处。PKRBD:1997、1998年Gale等通过体外实验证实,HCV抵抗IFN a主要是通过NS5A和PKR蛋白的相互作用,PKR蛋白是主要的宿主抗病毒蛋白之一。这种相互作用需要ISDR以及其后的26个氨基酸残基,该区域位于aa2209-2274,被称为PKR-binding domain (PKRBD). HCV1b型PKRBD变异与IFN a或IFNa/PEG-IFN a联合RBV的持续病毒学应答明显相关已有报道。V3和IRRDR:近些时候,Veillon和El-Shamy等研究发现HCV NS5A的V3区(aa2356-2379),以及V3加上其N端侧翼区,被称为Interferon/ribavirin resistance determining region (IRRDR; aa2334-2379)存在高度变异现象,V3和IRRDR的氨基酸变异与IFNa和RBV治疗的应答有关。更有2009年Bouzgarrou等报道NS5A从ISDR至V3(aa2209-2379)的氨基酸变异能够影响抗病毒治疗的应答。IFN a的经典信号通路是通过JAK/STAT途径。Ⅰ型IFN与相应的受体结合,激活信号级联反应,从而调节一系列干扰素刺激基因(ISGs)的转录翻译,而翻译的一些蛋白因子具有抗病毒活性,如PKR、MxA、ISG15等。蛋白激酶PKR在RNA病毒基因复制时可与dsRNA结合而激活,激活后能够磷酸化翻译启始因子eIF-2a亚单位的51位丝氨酸残基,使磷酸化的eIF-2a无法参与蛋白多肽链的翻译过程,从而抑制病毒或细胞蛋白的合成,达到抗病毒的效果。而Gale等通过体外实验证明NS5A蛋白通过PKRBD,能够结合IFN a诱导产生的PKR。HCV NS5A蛋白与宿主细胞内蛋白激酶PKR的相互作用对细胞内干扰素刺激基因(ISGs)的翻译起着重要抑制作用。综上所述,HCV1b型NS5A关键区域发生氨基酸突变的数目不同,则干扰NS5A-PKR蛋白相互作用的程度不同,进而不同程度地影响干扰素发挥其疗效。除过日本,来自亚洲其他国家和地区的相关研究报道极少,尤其是中国大陆的研究报道。所以,本研究的目的是首先确定是否治疗前HCV1b亚型感染患者的NS5A的氨基酸变异与PEG-IFN联合RBV治疗疗效有关。分析聚焦于NS5A区的ISDR、PKRBD、IRRDR和V3四个功能区域。同时筛选NS5A关键区域变异数目不同的合适的临床毒株构建HCV重组replicon,建立HCV复制子细胞培养系统,对HCV NS5A不同氨基酸变异数目与以IFN为基础抗病毒治疗应答的机理进行初步探讨。第一部分HCV1b型NS5A全长基因的扩增和克隆构建研究方法采用RT-PCR技术从53例临床丙型肝炎患者血标本中扩增HCV1b型NS5A全长基因,测序分析,MEGA4软件比对其与HCV J株(GenBank注册号：D90208)病毒NS5A蛋白PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区的氨基酸突变数目和位点,了解广东HCV1b亚型NS5A氨基酸突变情况。同时根据NS5A测序结果,挑选合适的NS5A基因片段与pMD18-T载体连接,构建pMD18-NS5A克隆。统计分析软件应用SPSS17.0,统计描述采用频数表示,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用两独立样本t检验,进行Levene方差齐性分析,方差齐同条件下采用t检验,方差不齐条件下采用Satterthwaite近似t检验。P<0.05有统计学意义。结果1. HCV1b亚型NS5A基因成功扩增,全长1477bp, pMD18-NS5A克隆成功构建。2.广东地区HCV1b亚型NS5A的ISDR区氨基酸突变率为73.6%(39/53),ISDR突变数目超过4个以上的仅占1.9%(1/53),其余均为为野生型和中间型。PKRBD氨基酸残基突变数目5.7±1.4,V3氨基酸残基突变数目4.9±1.1,IRRDR氨基酸残基突变数目5.7±1.5。3. HCV lb型NS5A氨基酸突变数目与性别、年龄和传播途径的统计结果显示：年龄分组(≥50岁/<50岁)与V3区氨基酸变异数目有显着统计学差异(t=0.555,P=0.033),年龄分组(≥50岁/<50岁)与IRRDR区氨基酸变异数目有显着统计学差异(t=0.288,P=0.041),说明感染HCV年纪较大的患者IRRDR和V3区氨基酸变异较多,而ISDR和PKRBD区无显着差异(P=0.222和P=0.081)。NS5A氨基酸突变数目与性别和传播途径无关(P>0.05)。第二部分HCV NS5A变异对Peg-IFN/RBV治疗1b亚型CHC疗效的影响研究方法对广东地区53例HCV1b亚型感染的慢性丙型肝炎患者,经PEG-IFN/RBV标准方案(40例经180μg/次或135μg/次pegylated IFN-a-2a联合RBV800-1200mg/日方案,13例经80μg/次pegylated IFN-a-2b联合RBV800-1200mg/日方案)治疗48周随访24周,进行回顾性研究。分析HCV NS5A aa变异及其影响抗病毒治疗应答的特点。分析主要聚焦于NS5A区的ISDR、PKRBD、IRRDR和V3功能区域。统计分析软件应用SPSS17.0,统计描述采用频数表示,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用两独立样本t检验；分类变量比较采用X2检验；二分类Logistic回归用于分析与SVR有关的各种因素。P<0.05有统计学意义。结果1.53例慢性丙型肝炎患者采用PEG-IFN联合RBV治疗48周并随访24周,EVR、ETVR和SVR分别是69.8%(37/53)、73.6%(39/53)和50.9%(27/53)。治疗前基线特征中年龄与SVR有显着统计学差异(t=3.499,P=0.001),PLT与SVR有显着统计学差异(t=-2.611,P=0.0120),EVR与SVR有显着统计学差异(χ2=6.173,P=0.013), ETVR与SVR有显着统计学差异(X2=19.757,P=0.000)。EVR和ETVR作为IFN的预测因素已被广泛接受。本研究显示PLT与SVR相关(P=0.012),分析原因是由于患者基线特征的差异所致,因为获得SVR的27例患者中有6例为肝硬化(22.2%),而26例未获得SVR的患者中有10例为肝硬化(38.5%)。进一步年龄分组比对,≥50岁组的CHC患者SVR率比<50岁组的SVR率低(P=0.008),但是两组都可以获得较高的EVR和ETVR。提示对于获得了ETVR的≥50岁的CHC患者,延长疗程至72周或更长,可能提高SVR。2. ISDR aa突变数目与SVR有显着统计学差异(1.3±1.1对0.6±0.5；t=-3.095,P=0.003)。进一步分析发现ISDR aa突变数目≥2组与<2组之间SVR率存在显着统计学差异(X2=7.767,P=0.005)。研究结果显示采用PEG-IFN/RBV抗病毒治疗,ISDR氨基酸突变数目不仅能够预测SVR,更为重要的是,ISDR aa变异数目由既往Enomoto报道的4个降为2个即可对SVR进行有效预测。经与Meta分析结果对比发现,采用PEG-IFN/RBV联合方案,主要提高了既往HCV1b亚型感染患者ISDR aa突变中间型的SVR。3. PKRBD aa突变数目与SVR有显着统计学差异(6.1±1.7对5.3±0.7；t=-2.315,P=0.027)。进一步分析发现PKRBD aa突变≥6组与<6组之间的SVR率存在显着统计学差异(X2=4.259,P=0.039)。研究结果说明PKRBD aa序列的变异数与PEG-IFN/RBV疗效明显正相关,变异数≥6的病例所获得的SVR显着高于其他病例,从临床的角度支持Gale等的研究结果。4.对于V3、IRRDR以及整个NS5A (ISDR-V3)区,统计分析未发现其氨基酸突变与病毒学应答有显着统计学差异(P=0.819、P=0.949和P=0.244)。5.广东HCV1b亚型NS5A区单个氨基酸突变的常见位点为2218、2257、2259、2260、2262、2265、2268、2270、2271、2336、2351、2356、2360、2367、2368、2372、2373、2375和2378。统计分析未发现上述单个氨基酸位点的突变与PEG-IFN/RBV治疗疗效有统计学差异(P>0.05),有必要增加病例数进行深入研究。6. Logistic回归分析结果显示：影响SVR的最主要因素是ISDR aa突变数目(OR=9.2,P=0.006),其次为年龄(OR=0.9,P=0.006)。第叁部分HCV1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建研究方法以能够高效复制的HCV1b replicon质粒为骨架,构成带有MIu Ⅰ和Bel Ⅰ双酶切位点的拉链质粒,前期采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从不同CHC患者血清中扩增获得HCV1b亚型NS5A全长片段,克隆到pMD-18载体中,测序分析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区域的变异情况,挑选重要区域aa突变数目不同的NS5A片段,插入到此HCV replicon拉链质粒中。扩增产物中无MIu Ⅰ和Bel Ⅰ酶切序列的,在引物中引入相关酶切序列后再扩增,双酶切后将NS5A区段置换入HCV1b replicon骨架中,构建包含中国NS5A区段的插入式复制子重组质粒。结果分析Dr. Z. Huang惠赠的HCV1b replicon质粒,发现其NS5A区具有MIuⅠ和Bcl Ⅰ的单一酶切位点,双酶切移去质粒中原有的NS5A后(此时暂称为HCV replicon拉链质粒),可以方便地插入从具有不同临床抗病毒治疗结局的CHC患者血清标本中克隆出的HCV NS5A,进而在细胞培养中深入分析不同来源的NS5A的生物学特点,阐明其与抗病毒药物疗效之间的关系。本研究从克隆的NS5A全长片段中挑选重要区域aa突变数目不同的3个片段,插入到HCVreplicon拉链质粒中,成功构建了包含中国NS5A区段的插入式复制子重组质粒,为研究中国HCV1b亚型NS5A蛋白的生物学功能、难治性CHC干扰素抵抗的机制以及个体化抗病毒治疗相关因素的分析奠定了的基础。第四部分HCV NS5A变异与以IFN为基础抗病毒治疗应答机理的初步探讨研究方法通过将各个HCV1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒进行Sca Ⅰ单酶切线性化,体外转录成RNA,转染Huh7.5.1细胞,利用荧光素酶检测鉴定不同时间点HCV RNA的瞬时表达,经G418筛选得到含有HCV RNA稳定复制的Huh7.5.1细胞,利用RT-PCR法和免疫荧光检测鉴定细胞中HCV NS5A的基因和蛋白表达,验证各重组replicon质粒是否能够正常工作。用干扰素α-2b0IU/ml、25IU/ml、50IU/ml、100IU/ml、200IU/ml和400IU/ml; RBV0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml; IFN/RBV不同方案：IFN25IU/ml+RBV10μg/ml、IFN50IU/ml+RBV10μg/ml和IFN100IU/ml+RBV10μg/ml,分别干预负载有重组replicon的Huh7.5.1细胞48h后,收集细胞裂解液,测定荧光素酶活性,从而通过体外实验验证临床研究的结果,对其机理做初步探讨。统计分析软件用SPSS17.0,实验数据均采用均数±标准差(x±s)表示,不同浓度和方案的药物干预Huh7.5.1,叁组间采用析因设计资料的方差分析进行显着性检验统计分析,同时对每个浓度药物、每个方案干预Huh7.5.1的结果采用one-way ANOVA方法进行显着性检验统计分析,方差齐同条件下,采用LSD法对各组数据进行多重比较,方差不齐条件下,采用Dunnett'T3方法对各组数据进行多重比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.经检测不同时间点各重组replicon转染Huh7.5.1的瞬时表达效率,通过G418筛选得到含有HCV RNA稳定复制的Huh7.5.1细胞,利用RT-PCR法和免疫荧光检测鉴定细胞中HCV NS5A的基因和蛋白表达,证明重组的HCV replicon能够正常工作,可用于进一步的实验研究。2.用不同浓度的IFN和RBV分别干预负载有重组replicon的Huh7.5.1细胞,发现叁组的荧光素酶活性均呈现剂量依赖性的下降,说明IFN和RBV对HCV RNA复制的抑制作用呈剂量依赖性增加。以不同浓度的IFN处理HCV复制子细胞后,析因设计资料的方差分析结果显示：不同组间有显着差异(F=5.432,P=0.009)。不同药物浓度间有显着差异(F=583.930,P=0.000)。对每个浓度干预结果统计分析时,叁组的one-way ANOVA分析显示：在100IU/ml浓度时,叁组有显着性差异(F=6.588,P=0.031),在200IU/ml浓度时,叁组有显着性差异(F=34.220,P=0.010)。多重比较发现经过这2个药物浓度干预后,NS5A-3组的荧光素酶活性都是最低水平。说明HCV NS5A关键区域PKRBD/ISDR区发生氨基酸突变较多毒株,对IFN治疗的反应敏感。3.用不同方案的IFN联合RBV进行了干预实验,采用不同方案干预Huh7.5.1,析因设计资料的方差分析结果显示：不同组间有显着差异(F=10.579,P=0.001)。对每个浓度干预时,叁组的one-way ANOVA分析显示：IFN50IU/ml+RBV10μg/ml方案下,叁组比较有显着性差异(F=8.565,P=0.017),多重比较发现NS5A-1组病毒量显着高于NS5A-2组和NS5A-3组,说明HCV NS5A关键区域PKRBD/ISDR区发生氨基酸突变的replicon,对联合用药反应敏感。而而IFN100IU/ml+RBV10μg/ml方案下,叁组比较有显着性差异(F=14.317,P=0.005),多重比较显示组间两两比较有统计学差异,而NS5A-3组的病毒量最低,NS5A-2组居中。说明联合用药方案情况下,HCV对以IFN为基础的联合抗病毒治疗的反应敏感,并且HCV NS5A关键区域PKRBD/ISDR区变异数目越多,对药物的反应越好,这些发现与我们前期的研究结果相符合。结论1.本研究表明：HCV lb亚型NS5A氨基酸变异与以干扰素为基础的抗病毒治疗应答密切相关,关键区域集中在NS5A的ISDR和PKRBD区。并且采用PEG-IFN联合RBV标准方案治疗,ISDR氨基酸突变对治疗应答的预测可由4个降为2个。而实验部分也证明：对于HCV1b型NS5A区PKRBD/ISDR变异数目较多的病毒株,采用IFN联合RBV用药干预较单用IFN干预,治疗反应会更加敏感,并且HCV NS5A关键区域PKRBD/ISDR区变异数目越多,对联合治疗的反应越好。2.本研究提示：对于HCV1b型NS5A蛋白与抗病毒治疗的研究应给予足够重视,在基础实验研究中,利用本实验构建的重组replicon细胞培养系统,针对NS5A区不同区域氨基酸突变如何影响IFN信号转导通路的实验研究值得深入探索。
李磊[2]2013年在《慢性丙型肝炎血脂水平及与抗病毒疗效的临床研究》文中提出目的：观察慢性丙型病毒性肝炎(CHC)患者血脂水平及对抗病毒疗效的影响,为预测疗效、及时调整治疗方案提供依据。方法：选择纳入74例CHC患者对其血脂水平进行检测；包括甘油叁酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A (apoA)、载脂蛋白B (apoB)、同时检测空腹血糖(GLU)、白蛋白(ALB)及肝脏生化指标与80例健康志愿者和71例慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者的数据进行比较分析。在对74例CHC患者给予标准抗病毒治疗,检测HCV-RNA定量和血脂水平并对检测数据进行比较分析。结果：74例CHC患者血脂水平与对照组相比均明显偏低,均有统计学差异(P<0.05)。与71例CHB患者相比HDL-C、apoA水平明显偏低,有统计学差异；而TG、apoB水平略高于CHB患者组,LDL-C水平低于CHB组,相比无统计学差异。对74例CHC患者进行抗病毒治疗后获得持续病毒学应答(SVR)者43例(58%),非持续病毒学应答(No-SVR)者31例(42%)。治疗前SVR组血清apoA、apoB水平均明显高于No-SVR组,相比有统计学差异；血清TG、TC、HDL-C水平均低于No-SVR组,LDL-C高于No-SVR组,相比均无统计学差异。治疗期间两组的TG、TC、HDL-C、LDL-C、apoA、apoB水平的变化趋势各有不同,两组TG升高趋势基本相同；SVR组比No-SVR组治疗前有较低的HDL-C水平,治疗期间降低的程度明显增加,但无统计学差异；治疗初期两组患者LDL-C水平降低趋势基本相同,治疗至12周后No-SVR组患者LDL-C出现回升,HCV-RNA检测值仍在检测线以上,而SVR组LDL-C持续低水平直至治疗结束,并伴有HCV-RNA阴转；SVR组TC在治疗12、24、48周均处于低下水平,与No-SVR组相应截点指标比较,均有统计学差异；两组患者血清apoA水平在治疗程中逐渐下降,在SVR组降低的幅度明显大于No-SVR组,在时间截点24、48周均低于No-SVR组水平,相比有统计学差异；血清apoB水平在治疗过程中的变化趋势与LDL-C相似,在SVR组逐渐下降,No-SVR组在12周后逐渐回升,在24周左右高于No-SVR组,在时间截点12、24、48周两组相比均无统计学差异。对其基线纳入指标进行单因素分析,发现纤维化程度及apoA水平明显影响抗病毒疗效,对其进行二分类logistic回归分析进行验证发现肝脏纤维化水平及基线血清apoA水平均是影响抗病毒疗效的独立危险因素；肝脏纤维化0～2级及血清较高的apoA水平均有利于获得SVR,肝脏纤维化3～4级的患者,血清apoA水平对SVR未见明显影响。结论：CHC患者血脂水平均较正常偏低,与CHB组相比较提示CHC患者的血脂表现明显的低TC、低HDL、低apoA脂蛋白血症,提示HCV是扰乱机体脂代谢的重要因素。CHC者抗病毒治疗疗效与机体血脂水平密切相关,但相关程度不尽相同,抗病毒治疗初血清apoA水平较高的患者临床较容易获得SVR,TC在抗病毒治疗前、后持续低水平,是获的SVR的明确信号。LDL-C在抗病毒治疗前处低水平,治疗期间出现回升,预示着HCV清除效果不佳。基线血清apoA水平明显影响抗病毒疗效,血清apoA水平较高的患者临床治疗易获得SVR。
郝兰虎, 李艳萍, 李卓荣[3]2011年在《抗丙型肝炎药物研究进展》文中研究表明近些年来,丙型肝炎病毒(HCV)生物学的快速进展使人们对HCV的感染和复制有了突破性认识,对抗HCV药物的研究与开发产生了重要影响。HCV NS3/4蛋白抑制剂telaprevir和boceprevir的开发进入临床Ⅲ期试验,一些NS5B抑制剂也进入临床研究,在很好降低感染病人病毒载量的同时显示出较好的耐受性。另外,通过干预与HCV复制有关的宿主细胞蛋白进行抗HCV的研究也受到普遍关注,并取得众多突破。本文将着重介绍一些近年来以病毒蛋白为靶点及以细胞因子为靶点的抗HCV药物的研究进展。
武文斌[4]2006年在《丙型肝炎患者抗-F流行率及F蛋白对细胞（抑）癌基因的调节作用》文中提出丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)属于黄病毒科丙型肝炎病毒属(Flayiviridae hepacivirus),为颗粒状单正链RNA病毒。HCVHCV可以导致急性、慢性肝炎和肝纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。HCV基因组全长约9600个核苷酸,结构为:5′非编码区(5′UTR)—结构蛋白(核心蛋白C—包膜蛋白E1、E2)—非结构蛋白(P7—NS2—NS3—NS4—NS5)—3′非编码区(3′ UTR)。HCV基因组仅含有一个开放读码框(open reading frame,ORF),编码大约3010个氨基酸的多蛋白前体,前体蛋白在翻译同时或翻译后被宿主细胞及病毒自身编码的蛋白酶水解为C～NS5b的10种结构和非结构蛋白。HCV F蛋白是C基因+1移位后所形成新读框(alternative reading frame,ARF,C基因密码子第2位碱基为新读框密码子第1位碱基)编码的基因产物,作为新近鉴定出的HCV基因组编码产物,目前对F蛋白的生物学性状研究尚处在起步阶段。本研究利用大肠杆菌表达的重组HCV F蛋白为捕获抗原,ELISA检测HCV感染者血清中抗体情况,了解F蛋白是否可以在感染者体内天然表达。结合HCV感染者临床资料,初步评价F蛋白与丙型肝炎的疾病相关性,以及在HCV感染的实验室检测及诱导保护性中和抗体中的作用。另一方面,利用Western blot和实时定量PCR技术检测表达F蛋白的HepG_2细胞中3种(抑)癌基因变化,借以判断F蛋白在HCV相关的HCC发生中的作用。 一、丙型肝炎患者中抗-F的血清抗体流行率 以HCV 1b亚型序列为模板,扩增氨基端部分缺失的HCV F基因读框(codon 75～codon 134)至原核表达载体pET32a,含F基因质粒转化大肠杆菌,表达产物用Ni-NTA树脂纯化。以纯化蛋白作为捕获抗原,包被酶标平板,间接酶联免疫吸附实验(EIA)检测35份HCV感染者、8份非HCV感染肝病患者及10份健康人血清标本。以健康者血清OD_(450nm)均值+0.1作为阳性判定值,分析HCV感染者血清抗—F阳性率,结合患者临床资料,统计学分析F蛋白与HCV感染的疾病指标相关性。结果显示,在35份HCV感染者血清标本中,抗—F的阳性率为43%(15/35),对照组(8份非HCV肝病患者及10份健康人)血清中抗—F无一例阳性,两组之间OD_(450nm)均值和抗—
陈立冬[5]2007年在《丙肝病毒非结构基因NS5A的克隆表达及其缺失突变体的基因表达谱芯片分析》文中研究指明背景和目的丙型肝炎病毒(HCV)属黄病毒科，主要经血传播的肝炎病毒。可引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌，对人类健康危害极大。目前世界上有1.7亿人感染。病毒主要感染肝细胞，然而有研究表明丙型肝炎病毒也可能感染其他类型的细胞，比如B细胞，单核巨噬细胞，和树突状细胞，从而导致免疫功能异常。了解HCV作用于肝细胞和肝外细胞的分子生物学基础对揭示丙肝的发病和慢性化机制非常关键。HCV基因组转录翻译为一条多肽前体，在信号肽酶和蛋白酶的作用下裂解为10个蛋白，包括Core、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS5A是非结构蛋白的一种(HCV-1b型有447个氨基酸残基)，C-末端丝氨酸被磷酸化后形成基础磷酸化的NS5A蛋白。在NS4A蛋白依赖的模式下，NS5A蛋白中央的丝氨酸被磷酸化，形成高度磷酸化的NS5A蛋白。NS4A蛋白结合并支配NS5A蛋白的高度磷酸化。尽管NS5A在病毒复制中的作用还未搞清，然而却发现NS5A上的一段区域(氨基酸2209到2248)与干扰素治疗的敏感性有关。此区已命名为干扰素(IFN，interferon)敏感决定区(ISDR)。对判断干扰素的疗效很有帮助。另一方面，NS5A蛋白可和PKR催化结构域直接相互作用，抑制其活性。在体内，NS5A蛋白可破坏双链RNA激活的蛋白激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase PKR)的二级结构。抑制PKR介导的eIFalpha磷酸化。但NS5A蛋白是否参与了感染细胞抵抗IFN的抗病毒效应仍未明了。研究表明，缺失N-末段129-146氨基酸残基的NS5A蛋白有较强的反式激活作用。NSSA的转录激活区域包括两个酸性氨基酸区(2 143-2 184 2 220-2 273氨基酸残基)和一个脯氨酸富集区(2 282-2 327氨基酸残基)，这些区域被认为是NS5A的转录活性区域。对NS5A进行研究，找出NS5A在肝细胞中的表达对肝细胞基因表达谱产生的影响，并进一步弄清具体作用机制、作用效应及连带影响，对明确HCV的致病机制，寻找有效防治方法具有重要意义。方法1．根据文献[6]及NCBI的Genbank上公布的HCV-1b型基因序列，设计PCR产物片段包含NS5A的特异性引物，以从病人血清中提取的以HCV-1b型RNA为模板，，利用RT-PCR方法扩增出1632bp片段，连接至pGEM-T载体并送测序，根据测序结果设计PCR产物为NS5A的特异性引物，以上述连接至pGEM-T载体1632bp片段为模板扩增出1341bp片段，连接至pGEM-T载体并送测序。2．将上述引入酶切位点EcoRV和HindⅢ的pGEM-T-NS5A和pET32a(+)空质粒经EcoRV和HindⅢ双酶切，酶切片段回收后连接，测序正确后转化BL21宿主菌，0.5mM／ml IPTG、30℃诱导5hr，3．根据1的测序结果设计NS5A缺失突变型1特异性引物，引入酶切位点KpnⅠ和HindⅢ，以pGEM-T-NS5A质粒为模板，PCR扩增出591bp片段，插入至真核表达载体pcDNA3。1(-)／myc中，测序完全正确，表明NS5A缺失突变型1真核表达载体的构建成功。4．用3构建的pcDNA3。1／myc-His(-)A-NS5ADM1真核表达重组质粒，与空质粒分别转染HepG2细胞并获得表达，两者互为平行对照，提取转染后的细胞总RNA，应用基因表达谱芯片技术检测HepG2在NS5A缺失突变体转染后差异表达的基因谱的变化。结果1．NS5A测序结果和NCBI上NS5A序列比对后，有91.4％的同源性，表明NS5A已克隆成功。2．Western blotting检测结果显示我们获得了带有组氨酸标签的重组融合蛋白的优化表达。3．NS5A缺失突变型测序结果表明NS5A已克隆成功。4．筛选获得了3条已知的反式上调基因，10条已知的反式下调基因。结论1．成功克隆了NS5A基因，NS5A成功表达为今后单抗和多抗的制备奠定了基础。2．NS5A缺失突变体上调基因为①．细胞质膜钙离子转运ATP酶2；②．引发酶多肽；③．环指蛋白185。下调基因包括①Hbrm基因；②SCL／TAL1阻断基因座；③核糖核苷二磷酸还原酶M2链相似蛋白；④锌指蛋白253；⑤白介素2增强结合因子(ILF2)；⑥U2相关SR40蛋白；⑦神经母细胞瘤扩增蛋白；⑧酸性钙通道；⑨大电导钙激活钾通道；⑩ralA结合蛋白1(RALBP1)等。结果提示NS5Adm1与DNA和RNA复制合成过程、离子通道蛋白，肿瘤细胞的形成和细胞凋亡有关。3．上述研究为进一步开展NS5A的生物学活性研究奠定了物质基础，以及为研究其在体内存在的调控机制提供了线索和依据。
参考文献：
[1]. HCV 1b亚型NS5A氨基酸变异对慢性丙型肝炎抗病毒治疗的影响[D]. 李京涛. 南方医科大学. 2012
[2]. 慢性丙型肝炎血脂水平及与抗病毒疗效的临床研究[D]. 李磊. 天津医科大学. 2013
[3]. 抗丙型肝炎药物研究进展[J]. 郝兰虎, 李艳萍, 李卓荣. 中国抗生素杂志. 2011
[4]. 丙型肝炎患者抗-F流行率及F蛋白对细胞（抑）癌基因的调节作用[D]. 武文斌. 第二军医大学. 2006
[5]. 丙肝病毒非结构基因NS5A的克隆表达及其缺失突变体的基因表达谱芯片分析[D]. 陈立冬. 郑州大学. 2007