（2陕西省食品药品监督检验研究院 712000）
（3陕西铎耀中药饮片有限公司 712000）
【摘要】目的：对骨碎补薄层色谱鉴别样品制备和展开系统进行改进。方法：甲醇超声提取制备样品,新北美圣草苷和柚皮苷为对照品,甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸(4:6:6:1:0.5)下层液为展开剂，10%三氯化铝乙醇溶液喷雾，105℃加热，紫外光(365nm)下检视。结果：供试品色谱中新北美圣草苷和柚皮苷斑点清晰，骨碎补药材主成份分离度好。结论：该法操作简便，而且专属性强，能更客观、准确地反映骨碎补的质量。因此对进一步完善骨碎补的质量评价具有重要意义。
【关键词】骨碎补；薄层色谱；鉴别
【中图分类号】R28 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）01-0136-02
骨碎补为水龙骨科植物槲蕨 Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm.的干燥根茎。全年均可采挖，除去泥沙，干燥或再燎去茸毛（鳞片）[1]。具有活血续伤，补肾强骨功效。用于跌打损伤或创伤，筋骨损伤，瘀滞肿痛，肾虚腰痛脚弱，耳鸣耳聋，牙痛，久泻[2]。
目前，骨碎补总黄酮中被证明具有抗骨质疏松症作用的活性单体成分包括柚皮苷、柚皮素及新北美圣草苷。实验表明，新北美圣草苷比柚皮苷在促进成骨样细胞MC3T3-E1的增殖和分化方面有更强的作用，且能够更有效的增加碱性磷酸酶的活性。通过RT-PCR发现柚皮苷和新北美圣草苷都可以上调成骨分化过程中Runx2、COLI和BGP这3个标志性基因的表达，但在新北美圣草苷作用下Runx2、COLI和BGP 的表达量分别比在柚皮苷作用下的表达量上调了56%、37%和14%。此外新北圣草苷可以一定程度上逆转PD98059对细胞分化的抑制作用，可见新北圣草苷可能是骨碎补中另一个更有效的抗OP治疗的活性成分[3]。现行2015年版《中国药典》中骨碎补的薄层色谱鉴别是以柚皮苷为对照品进行鉴别，专属性较差。本研究在骨碎补化学成分分离、结构鉴定的基础上，以主要黄酮类成分新北美圣草苷和柚皮苷[4-5]为对照品，建立骨碎补的专属性薄层色谱鉴别方法，并对其色谱条件进行考察。本研究为快速、准确鉴别骨碎补提供了较好的鉴别方法。
1.仪器与试药
1.1 仪器
超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ-500DE 型）。紫外灯（上海精科实业有限公司，WFH-201B紫外透射反射仪）。
1.2 试药
新北美圣草苷对照品为自制（纯度以98%计）；柚皮苷对照品（110722-201312；含量以94.7%计）；其它试剂均为分析纯；骨碎补7个样品，以上5批样品经陕西省食品药品监督检验研究院郭耀武主任药师鉴定为水龙骨科植物槲蕨Dr.ynaria fortunei（Kunze）J.Sm，有2批样品是伪品。
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2.方法与结果
2.1 改进方法
2.1.1供试品溶液的制备：取本品粉末0.5g置具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，超声处理30min，滤过，水浴挥去甲醇，残渣加水20mL溶解，放冷，水饱和正丁醇萃取4次（25mL，20mL，20mL，15mL），合并正丁醇液，水浴蒸干，加甲醇1mL溶解，作为供试品溶液。
2.1.2对照品溶液的制备：取新北美圣草苷对照品和柚皮苷对照品，分别加甲醇制成1mg·mL-1的对照品溶液。
2.2 原方法
2.2.1供试品溶液的制备：取本品粉末0.5g，加甲醇30ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
2.2.2对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
3.结果
3.1 照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述对照品溶液及供试品溶液各5uL，点于同一硅胶G薄层板上，以甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸（4:6:6:1:0.5）下层液为展开剂，预饱和薄层板30min，上行展开，展距15cm，取出，晾干，以10%三氯化铝乙醇溶液喷雾显色后，105℃加热至斑点显色清晰，在366nm紫外灯下检视。
3.2 照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（1:12:2.5:3）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
4.讨论
4.1 提取溶剂考察
对甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇四种提取溶剂进行比较，结果以甲醇为提取溶剂时，主要斑点数目较多及荧光强度清晰，考虑甲醇作提取溶媒溶解性能好，回收比较容易，所以确定甲醇为提取溶媒。
4.2 提取方法和时间考察
分别对超声处理30min，60min和120min与回流30min，60min、120min提取效果进行比较，结果显示，超声法提取成分种类与回流法基本一致，无明显差别，且不同提取时间在斑点数目及荧光强度上无明显差异，考虑简单、方便故选取提取方法为超声提取，提取时间为30min。
4.3 纯化方法考察
分别选用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇作萃取溶剂，结果显示，用水饱和正丁醇萃取即可达到除去杂质的母液，且分离到的新北美圣草苷和柚皮苷较为适宜。
4.4 水饱和正丁醇萃取次数考察
正丁醇萃取6次（25，20，15，10，5和5ml），分别吸取各萃取液5ul进行点样、展开、显色、观察。结果显示，水饱和正丁醇萃取4次可将主要成分萃取出来。
4.5 显色条件考察
显色后在日光、254和365nm荧光灯下都可观察到相应的斑点，但365nm下观察斑点更为清晰，具有可行性，因此，检视条件确定为10%三氯化铝乙醇溶液喷雾，加热至斑点清晰，于365nm紫外光下观察。
4.6 展开条件
4.6.1展开系统考察 分别选用①甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸（4:6:6:1:0.5）下层液；②以苯-丁酮-甲醇（3:1:1）下层液展开；③甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（1:12:2.5:3）的上层液；④氯仿：醋酸乙酯：甲醇：水（15:40:22:10）；⑤醋酸乙酯：丁酮：甲醇：水（10:6:3:1）；⑥氯仿：醋酸乙酯：甲醇：水（15:40:22:10）作为展开剂进行展开，结果甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸（4:6:6:1:0.5）下层液为展开剂展开效果较好，与《中国药典》2015年版相比，此展开剂不含甲苯，毒性较小。
4.6.2展开温度和湿度影响因素的考察 本试验对展开环境的温度进行考察，结果在15～25℃，供试品色谱中主要斑点的分离度较好；同时对展开环境的相对湿度进行考察，分别考察了相对湿度为20%、30%、60%、75%，结果在20%～60%，供试品色谱中主要斑点的分离度较好。其中展开最佳条件为：温度12℃，湿度76%。
4.7 显色剂考察
本研究选取三氯化铝试液、5%三氯化铝乙醇溶液、10%三氯化铝乙醇溶液、1%FeCl3乙醇溶液作显色剂进行比较，5%三氯化铝乙醇溶液显色清晰，斑点较好。
该方法与《中国药典》2015年版一部骨碎补项下的薄层鉴别方法相比较，不仅操作简便，而且专属性强，能更客观、准确地反映骨碎补的质量。因此对进一步完善骨碎补的质量评价具有重要意义。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中国药典[M].北京:中国医药科技出版社，2015:256.
[2]高学敏.中药学[M].北京:中国中医药出版社，2007:335.
[3]招文华,沈耿杨,任辉,等.骨碎补活性单体成分调控骨质疏松症相关信号通路的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2017,23(01):122-129+140.
[4]王跃生,李计萍.骨碎补中柚皮甙的薄层定性定量方法的研究[J].中国中药杂志，1998,23（11）：685-686.
[5]邓莹,李宁,郭兴杰,等.骨疏丹胶囊的薄层鉴别和含量测定[J].沈阳药科大学学报,2013,30（3）:186-191.
论文作者:马云娜1,郭耀武1,2（通讯作者）,刘越2,折慧1,
论文发表刊物:《心理医生》2018年1期
论文发表时间:2018/1/24
标签：甲醇论文; 溶液论文; 薄层论文; 氯化铝论文; 北美论文; 斑点论文; 色谱论文; 《心理医生》2018年1期论文;