湖南省人民医院 湖南长沙 410005
【摘 要】目的：观察人脐血间充质干细胞对肝硬化大鼠的疗效及其归巢特性。方法：采用四氯化碳法制备肝硬化大鼠模型。实验随机分为三组，A组（n=20）：肝硬化大鼠经门静脉注射人脐血间充质干细胞1ml （5×106个）；B组（n=20）：肝硬化大鼠经门静脉注射等体积的PBS；C组（n=10），正常大鼠经门静脉注射人脐血间充质干细胞1ml。细胞移植后4周，取各大鼠静脉血及肝脏组织进行检测。结果：A组与B组比较，细胞移植后4周后大鼠的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素降低，白蛋白显著升高（P<0.01）；透明质酸、层粘连蛋白、前胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白Ⅳ水平降低（P<0.01）；肝细胞炎性坏死、脂肪变及肝纤维化有不同程度改善（P<0.05或P<0.01）。免疫组化染色显示：A、C组大鼠肝组织均有人脐血间充质干细胞的定植，但A组定植细胞数明显多于C组（P<0.01）。C组大鼠脾、肺、肾等组织均有少量人脐血间充质干细胞定植。结论：人脐血间充质干细胞移植可部分改善肝硬化大鼠的肝功能及病理损伤，肝损伤情况下人脐血干细胞具有归巢特性。
【关键词】肝硬化；脐血间充质干细胞；肝功能；肝纤维化；归巢；定植
【Abstract】Objective：To observe the curative efficacy of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells transplantation on liver cirrhosis rats and observe the homing characteristics. Methods A cirrhotic rat model was established by CCL4。The experiments were randomly divided into three groups：group A（n=20），Portal vein injection of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells 1ml （5x106）in cirrhotic rats，group B（n=20）cirrhotic rats was injected with the same volume of PBS through portal vein，group C（n=10）was normal rats，through portal vein was injected human umbilical cord blood mesenchymal stem cells 1ml. After 4 weeks of transplantation，vein blood and liver tissue of each rats were obtained for testing. Results At 4 weeks after cell transplantation，group A compared with the group B，levels of serum alanine aminotransferase，aspartate aminotransferase and total bilirubin were significantly decreased，while the albumin level was increased significantly （P< 0.01），hyaluronic acid，laminin，collagen III and collagen IV levels were significantly reduced （P<0.01），the liver cell inflammatory necrosis，steatosis and liverfibrosis were varying degrees of improvement （P <0.05 or P <0.01）. Immunohistochemistry staining showed that human umbilical cord blood mesenchymal stem cell colonization could be seen in the rat liver tissues of the A and C group，but the number of group A was significantly more than that of group C （P<0.01）. In the group C，the spleen，lung and kidney of the rats had a small amount of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells colonization. Conclusions Human umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation can improve the liver function and pathological damage of liver cirrhosis rats in a certain extent.In the case of liver injury，human umbilical cord blood stem cell has homing characteristics.
【Keywords】liver cirrhosis；umbilical cord blood mesenchymal stem cells；liver function；liver fibrosis；homing；colonization；
0.引言
肝硬化是临床的常见多发病，进展至失代偿期患者多病情重，预后差。临床治疗手段现仍以针对病因及并发症的内科综合治疗为主，难以逆转已发生的肝硬化[1]。细胞移植技术等治疗手段日益丰富，但仍处在临床摸索阶段，有待更多的基础研究及临床循证证据支持。已有报道指出人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCB-MSCs）治疗肝硬化潜力巨大[2-4]。本实验将制备好的hUCB-MSCs移植入肝硬化大鼠，观察hUCB-MSCs在肝硬化大鼠中对于肝损伤特别是肝组织学的影响，了解其归巢特性，为临床研究或治疗提供数据参考。
1材料和方法
1.1主要实验材料：SPF级雄性SD大鼠68只，均6-8周龄，体重240-260g，由长沙市东创实验动物中心提供SCXK（湘）2009-0012；脐带血采自健康产妇（产妇及家属知情同意）；Masson三色染色试剂盒（福州迈新），食用花生油（山东鲁花），四氯化碳分析纯（天津鑫大宇），荧光素标记的抗人CD34、CD45、CD29、CD105抗体（BD公司），低糖DMEM培养基（Solarbio），胎牛血清、Brdu溶液（Gibco）抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒（DAKO公司）；流式细胞仪（BD公司）。
1.2实验方法
1.2.1 hUCB-MSCs的制备、检测及标记：无菌条件下采集的脐带血，采用密度梯度离心法获取单个核细胞。然后将单个核细胞用贴壁培养法行培养、传代，依次传至第3代。选取生长良好的第3代培养细胞制备成细胞悬液，细胞悬液中加入荧光素标记的抗人CD34、CD45、CD29、CD105抗体，然后进行流式细胞仪检测。选生长良好P3代细胞避光加入Brdu 溶液进行标记。
1.2.2肝硬化建模：58只健康雄性SD大鼠建模，用40%CCL4花生油混合液按0.3ml/100g剂量每周一、五腹部皮下注射，20%的酒精为唯一饮用水，造模8周后处死10只利用Masson染色来检测肝硬化建模是否成功。
1.2.3实验的分组与干预：将已经成功建模的40只肝硬化大鼠随机分为A、B两组，每组20只，A组肝硬化大鼠经门静脉注射hUCB-MSCs 1ml，B组门静脉注射等体积的PBS对照。剩余10只正常喂养大鼠设为C组，经门静脉注射hUCB-MSCs 1ml。实验分组后干预的操作方法如下：将麻醉后的实验大鼠进行消毒，打开腹腔，然后选用1ml注射器抽取Brdu标记的细胞悬液1ml（细胞数约5x106个）或1ml PBS，找到门静脉主干后针头斜面向上刺入，将细胞悬液或PBS缓慢的注入门静脉后拔针，湿棉签轻轻压迫止血，然后缝合关腹。给予每只实验大鼠肌肉注射青霉素20万单位。术后三组大鼠普食普水喂养。4周后处死各组大鼠。
1.2.4术后疗效观察：A、B组大鼠术后1周及4周静脉采血测定肝功能相关指标变化；术后4周门静脉采血测定透明质酸、层粘连蛋白、前胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白IV水平。4周末处死所有大鼠，取肝组织行HE染色和Masson染色。采用慢性肝病的半定量分级评分法评估肝细胞脂肪变性及炎性坏死[5-7]。评分标准：脂肪变性、坏死：没有，0分；轻度，1分；中度，2分；严重，3分。肝纤维化评定标准：正常，0级；胶原增多，无纤维间隔，1级；不完全纤维间隔形成（间隔彼此不相连），2级；较细完全间隔形成，3级；较厚完全纤维间隔形成（完全硬化），4级。
1.2.5 hUCB-MSCs的肝内示踪：三组大鼠采用EnVision两步法抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒，通过免疫组化学技术检测Brdu标记的hUCB-MSCs在三组大鼠肝内的定植情况及在C组大鼠脾、肺、肾等组织的定植情况。
1.3统计学处理：实验数据符合正态分布，采用SPSS18.0软件进行统计分析，计量资料数据用均数±标准差（±S）表示，组间比较先行方差齐性分析，采用两样本t检验，以P<0.05为差异有显著性意义。
2结果
2.1 hUCB-MSCs的培养及鉴定：从人脐血中分离的单个核细胞经培养、纯化、传代后，第3代细胞表现为相对均一的长梭形，平行排列或漩涡状生长，见图1。第3代细胞高表达CD29 、CD105；CD34、CD45表达微弱，与间充质干细胞的表型表达相符[8]。
2.2肝硬化大鼠模型的建立：建模过程中死亡8只大鼠。建模8周后，处死10大鼠取肝组织行Msaaon 染色示：模型组汇管区纤维结缔组织大量沉积，着蓝色，纤维间隔较厚，部分纤维间隔连接破坏肝小叶，形成典型的假小叶，见图2。
2.3 hUCB-MSCs移植后大鼠肝功能及肝纤维化相关指标改变：A组大鼠与B组相比：在hUCB-MSCs移植后4周，A组大鼠总胆红素、血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶均明显下降，白蛋白升高，差异有显著性意义（P < 0.01），见表1。细胞移植后4周，A组大鼠血清透明质酸、层粘连蛋白、前胶原蛋白Ⅲ、胶原蛋白IV均有不同程度改善，与B组比较差异有显著性意义（P < 0.01），见表2。
2.5 hUCB-MSCs移植后肝脏组织病理学改变：hUCB-MSCs移植治疗4周末，A组大鼠与B组相比，经半定量分级评分后结果显示：A组大鼠的肝细胞脂肪变性和肝细胞的坏死程度均有减轻（P<0.05）；肝纤维化程度改善（P<0.01），见表3，图3。
2.6 hUCB-MSCs的肝内定植：A组大鼠肝脏中均可见Brdu标记的hUCB-MSCs分布，细胞核棕黄，多定植于肝小叶周围门管区附近，呈颗粒样或弥漫性分布；B组大鼠各肝组织中未见阳性细胞出现。C组正常大鼠肝内可见少量hUCB-MSCs分布，见图4。通过细胞计数显示，A组肝硬化大鼠肝组织内的hUCB-MSCs定植数量要显著多于C组（38.7± 9.81 VS 12.7± 4.78），两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。C组大鼠在脾、肺、肾等组织均发现Brdu标记的hUCB-MSCs少量定植，见图5。
3讨论：
干细胞治疗是目前终末期肝病的一个新的研究方向[9-11]。间充质干细胞是一种多能干细胞，在机体内它存在增殖和多向分化的能力[12-13]。相比其他来源的间充质干细胞，脐血间充质干细胞的增殖、分化能力较强，此外脐血间充质干细胞具有采集方便，对供者没有痛苦，取材广泛，在进行细胞移植治疗后的产生的免疫排斥反应微弱等优势[14]。在体外培养、扩增后可获得细胞移植治疗所需的大量细胞[15]。实验中所制备的第三代细胞生长状态良好，细胞表面标志物CD29、CD105表达率高，CD34、CD45表达微弱，证实所培养细胞以间充质干细胞为主，可满足本实验的移植需求。
本实验初步证明人脐血间充质干细胞移植可部分改善肝硬化大鼠的肝功能及病理损伤。肝脏受损后，其修复的主要过程包括肝细胞的再生和纤维组织的增生。肝细胞外基质在损伤等刺激因素的作用下逐渐增多是肝纤维化形成的主要原因[16-18]。肝硬化的合理治疗手段应是促进肝细胞的再生同时，尽量减少肝细胞外基质而减轻纤维组织增生。实验中采用体积分数为40%四氯化碳花生油混合液联合20%的乙醇造模，8周末随机取大鼠肝组织行Masson染色，均可见广泛典型假小叶形成，证实此法可诱导稳定的肝硬化动物模型。实验中A组与B组相比，在脐血间充质肝细胞移植术后1周和4周末，大鼠的肝酶学及黄疸等情况改善，而白蛋白的显著改善情况延迟到了4周末，提示脐血间充质干细胞对于受损的肝细胞起到了修复作用，且与时间相关。此外A组大鼠的相关血清肝纤维化指标在移植后4周末与B组比较也有改善，肝脏病理学变化提示较前明显好转，这提示在组织学层面上人脐血间充质干细胞对于肝硬化大鼠也具备一定的修复能力。
有研究指出间充质干细胞具有自动归巢于损伤及炎症区域的生物学特性[19]，移植途径对于定植数目存在一定影响，在肝硬化大鼠中门静脉移植要优于周围静脉。部分骨髓间充质肝细胞的研究已证实其特性[20]。那么脐血间充质干细胞的表现如何？实验发现经过门静脉移植的脐血间充质干细胞在正常大鼠肝、脾、肺、肾等组织中均可见散在定植，而在存在严重肝损的肝硬化大鼠肝内定植数目要明显多于正常大鼠组，这支持了在肝损伤情况下人脐血干细胞的归巢特性。
目前干细胞对于肝硬化治疗的具体机制尚不明确，有待进一步探索。安全性等问题的研究意义重大。为使干细胞治疗发挥其魅力更好的帮助临床肝硬化患者，还需不断探索。
4.附表：
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基金资助：湖南省科技厅重点项目（2015SF2048-1）
作者简介：廖金卯（1985-）男（汉族）410006 长沙，湖南常德，主治医师，湖南省人民医院肝病内科。
论文作者:廖金卯,胡小宣,罗建红
论文发表刊物:《中国蒙医药》2016年7月第7期
论文发表时间:2016/11/28
标签：大鼠论文; 干细胞论文; 肝硬化论文; 细胞论文; 门静脉论文; 组织论文; 肝功能论文; 《中国蒙医药》2016年7月第7期论文;