PTEN在白藜芦醇对体外胶质瘤细胞生长和凋亡的影响研究论文_马丽丽,,,梁辉, 王磊升通讯作者：

马丽丽 梁辉 王磊升通讯作者：（山东省烟台市烟台山医院神经内科；山东烟台264001）摘要:目的：研究白藜芦醇对体外胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:选取胶质瘤细胞株U-87MG和LN-18,用45μM浓度的白藜芦醇处理,MTT检测细胞增殖,qRT-PCR检测PTEN基因的表达,western blot分析PTEN、细胞周期蛋白D1、Bcl-2和Bax的表达。结果:与对照组相比白藜芦醇显著抑制胶质瘤细胞增殖,抑制Cyclin D1和Bcl-2的表达,促进PTEN和Bax的表达。结论:白藜芦醇通过上调PTEN的表达影响胶质瘤细胞的增殖和凋亡。关键词:白藜芦醇;PTEN;胶质瘤;细胞凋亡引言:胶质细胞瘤是全世界恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一,治疗方法主要是手术切除后进行化疗或者放射疗法,由于很多患者长时间使用一种药物化疗会产生耐药性 [1]。因此,天然化合物的使用受到越来越广泛的关注。白藜芦醇是天然的多酚类化合物,可抑制多种肿瘤细胞增殖促进凋亡,其机制为上调肿瘤细胞中PTEN的表达[2]。本研究探讨PTEN在白藜芦醇对胶质瘤细胞生长和凋亡的作用。1.方法1.1细胞培养采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养人胶质瘤细胞U87和LN18,置于37°C,5%CO2培养箱培养。每2天更换细胞培养基,每4天进行细胞传代。1.2 MTT法检测细胞增殖取对数生长期细胞0.25%胰酶消化计数按1×105/ml接种于96孔板中,然后加入45μM浓度的白藜芦醇,每孔10μL,对照组加入培养基,置于37°C,5% CO2培养箱培养,分别在24h, 48h, 72h, 96h, 加入10μL MTT试剂（5mg/ml）,继续培养4h, 去除培养基加入150μL DMSO振荡摇匀,用酶标仪在490nm处测量光密度值。1.3QRT-PCR检测基因表达收集细胞,使用TRIzol 试剂盒提取细胞总RNA。采用SuperScript III Reverse Transcriptase将RNA反转录成cDNA。使用Mastercycler ep realplex2进行PCR反应。1.4Western Blot检测蛋白的表达提取30ug蛋白质样品加入到50 ul laemmli 样本缓冲液煮沸 5min，上样于10-20% Ready Gels,在电压 20V 的条件下电泳3h,用电转移仪20v,50min的半干燥条件下将蛋白样品转移到 PVDF 膜上,洗膜,5% 脱脂牛奶封闭,分别加入一抗4℃过夜，洗膜3次,孵育二抗,浓度按说明书稀释,4℃过夜,洗膜3次,化学发光法进行检测。GAPDH为内参。1.5统计分析采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析。所有数据均表示为平均值±标准差。组间比较采用Student’ t检验和单因素方差分析。P<0.05为有显著差异。2.结果2.1白藜芦醇对细胞增殖的影响与对照组相比,白藜芦醇可显著抑制细胞增殖（图1，P<0.05）。随着时间增加,白藜芦醇对细胞的抑制作用越强。图1.白藜芦醇对细胞增殖的影响与对照组相比,*P<0.052.2白藜芦醇对PTEN mRNA和蛋白水平表达的影响与对照组相比,白藜芦醇处理后,PTEN mRNA和蛋白表达水平明显增加(图 2A, P<0.05)。图2 白藜芦醇对细胞中PTEN mRNA和蛋白表达水平的影响A．PTEN mRNA表达；B. PTEN蛋白表达。与对照组相比,*P<0.052.3白藜芦醇对细胞周期和凋亡蛋白表达的影响与对照组相比,白藜芦醇显著抑制Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表达,促进Bax蛋白的表达（图3, P<0.05）。图3 白藜芦醇对细胞周期和凋亡相关蛋白表达水平的影响与对照组相比,*P<0.053. 小结白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡的机制包括p53途径、影响Bcl-2家族、线粒体介质、Fas途径、细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶等。本研究探讨了白藜芦醇对胶质瘤U87和LN18细胞凋亡作用,MTT检测结果表明,白藜芦醇可显著抑制U87和LN18细胞增殖。通过Western blot检测证实细胞周期蛋白D1和Bcl-2蛋白的表达水平显著被抑制,促凋亡蛋白Bax蛋白表达水平明显增加,这些结果表明白藜芦醇通过影响Bcl-2和细胞周期蛋白D1的表达抑制胶质瘤细胞的增殖,促进其凋亡。此外PTEN基因和蛋白在胶质瘤U87和LN18细胞中低表达,这与先前的研究结果一致。采用白藜芦醇处理细胞48h 后PTEN基因和蛋白的表达水平明显增强。我们的研究为白藜芦醇应用于临床治疗胶质瘤提供了理论依据。参考文献[1] 黄河. 贝伐单抗通过激活自噬对脑胶质瘤细胞化疗耐药的影响[D].南方医科大学,2018. [2] 劳玲娟,宋新江,徐佳.PTEN在白藜芦醇对体外直肠癌细胞生长和凋亡的影响[J].中国中药杂志,2017,42(09):1730-1735.

论文作者:马丽丽,,,梁辉, 王磊升通讯作者：

论文发表刊物:《医师在线》2020年1月1期

论文发表时间:2020/4/28

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