（1浙江大学医学院附属儿童医院 浙江 杭州 310006）（2浙江工业大学药学院 浙江 杭州 310014）
【摘要】目的：阐明土曲霉3.04072 (Aspergillus terreus 3.04072)次生代谢产物对α-糖苷酶活性的抑制作用。方法：利用多种柱层析技术从土曲霉A. terreus 3.04072的固体发酵产物中得到6个次生代谢产物，并以Acarbose为阳性对照药，对所得单体化合物测定α-糖苷酶抑制活性。结果：体外酶活性结果显示化合物1、2、5和6均具有较强的α-糖苷酶抑制活性，其IC50分别是0.542, 0.409, 0.282和1.086 mM。结论：本论文首次发现化合物5和6具有很强的α-糖苷酶抑制活性。
【关键词】土曲霉；次生代谢产物；α-糖苷酶抑制活性；丁内酯；阿卡波糖
【中图分类号】R587.1 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）15-0207-02
糖尿病是当今世界上最常见的内分泌代谢性疾病，据统计，2013年全球患糖尿病的人数是3.82亿，预计到2035年这个数值会上升至5.92亿[1]。α-糖苷酶抑制剂(α-GI)是一种作用效果较好的口服降糖药物[2]，代表药物如阿卡波糖临床上主要用于经饮食控制和运动疗效不满意的Ⅱ型糖尿病的治疗。
本文主要对土曲霉(Aspergillus.terreus 3.04072)的次生代谢产物进行α-糖苷酶抑制活性研究。土曲霉是一种常见的致病真菌，被广泛应用于化学和制药工业[3]。近年来，从土曲霉次生代谢产物中分离并报道的化合物结构类型丰富且具有较好的生物活性，如抗流感活性的木脂素类化合物[4]，抗乙酰胆碱酯酶活性的倍半萜类化合物Territrem B[5]，抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的聚酮类化合物洛伐他汀[6]等。本研究从A.terreus 3.04072分离得到6个次生代谢产物，经核磁共振波谱和质谱鉴定分别为Butyrolactone I(1),6-COOH-Butyrolactone I (2), Butyrolactone VI (3),Territrem B (4),4-Hydroxy-3-prenylbenzoic acid (5),Asterrelenin (6)[7-11]。其中化合物2和5为首次从土曲霉次生代谢物中分离。
1.仪器与试剂
1.1 仪器
液相色谱系统（Agilent 1200），质谱（Agilent 6210 TOF LC-MS），核磁共振波谱仪（Bruker Avance-500），酶标仪 (TECAN Sunrise)，96孔培养板 (Corning Incorporated)。薄层层析硅胶400目、柱层析硅胶200300目(青岛海洋化工厂)，薄层层析GF254硅胶板(青岛海洋化工厂)，ODS-C18硅胶柱(50μm，YMC ODS-A)，Toyopearl HW-40C凝胶(50～100μm，Tosoh Corporation)
1.2 试药
α-糖苷酶 (阿拉丁工业公司)，阿卡波糖 (阿拉丁工业公司)，4-硝基酚--葡萄糖苷 (PNPG)，葡萄糖 (分析纯) (广东光华化学厂有限公司)，实验过程采用的有机试剂均为国产分析纯。A.erreus 3.04072购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
2.方法与结果
2.1 提取与分离
A.erreus 3.04072经马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)斜面活化，接种至马铃薯葡萄糖培养基(PD)中制备种子液，置于震荡式摇床，28℃，180r·min1培养4d。取15mL种子液接至小麦固体培养基中，共计80瓶，于28℃静置培养30d，获得菌株发酵产物。
发酵产物置于95%的乙醇中浸泡24小时，渗滤法提取三次，得100L提取液。浓缩提取液，加水溶解，用乙酸乙酯萃取5次，得浸膏120g。经MCI层析柱，以50%100%的甲醇梯度洗脱，经石油醚：乙酸乙酯=5:11:1硅胶柱，得化合物1(5201mg)、2(10 mg)、3(20mg)、4(2157mg)，5(926mg)、6(1063mg)。以上化合物经核磁共振波谱与质谱进行结构鉴定均与文献报道一致。
2.2 葡萄糖苷酶抑制活性测定
设空白对照组(缓冲液+底物+酶)、阳性对照组(阿卡波糖+底物+酶)和样品测定组(样品+底物+酶)。基本操作流程为：首先向磷酸钾缓冲液的酶活力测定系统中加入-葡萄糖苷酶30μL(0.2U·mL-1，37℃保温复活10min，加入4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)20μL(5.0mM) 后，37℃反应30min，加入Na2CO3 100μL(1.0M)终止反应，同时将反应体系的pH调整至碱性条件，使对硝基苯酚显色。在405nm处测对硝基酚的吸光度，此为空白对照组。阳性对照组和样品测定组则是在此基础上分别加入120μL阿卡波糖和120μL待测样品。除阳性对照空白和待测样品空白，其他每个样品做3个平行。最后利用酶活性抑制率公式计算出样品的抑制率。
酶活性抑制率%=1(OD样品OD背景)/OD空白
OD样品：加入待测样品反应后的吸光度，OD背景：只加样品，OD空白：不加样品反应后的吸光度。
由阿卡波糖的抑制率计算其IC50为1.489mM，以阿卡波糖为阳性对照，对A.terreus 3.04072的次生代谢产物进行α-糖苷酶抑制活性进行筛选，从阿卡波糖的10倍IC50值开始，逐渐稀释为阿卡波糖IC50值的5倍、2.5倍、1.25倍、0625倍、0.313倍、0.165倍，各浓度分别用10A0.165A来表示。A.terreus 3.04072的次生代谢产物中，糖苷酶抑制活性的结果如下：
3.结果与讨论
本实验以阿卡波糖为阳性对照，对A. terreus 3.04072的次生代谢产物进行α-糖苷酶抑制活性进行筛选。结果表明， Butyrolactone VI(3)和Territrem B(4)有很微弱的α-糖苷酶抑制活性。与阳性对照物Acarbose相比，化合物1-2、5-6均抑制率随浓度增加而增加，呈剂量依赖性，IC50只有阿卡波糖的1-1/5，活性较好，具有潜在的利用前景。其中化合物1-2属于木质素Butyrolactone类，化合物6属于生物碱类，化合物5结构简单，分子量小，容易合成，有待进一步研究与开发。通过对所有的化合物进行α-糖苷酶抑制活性测试，完善了此类化合物的α-糖苷酶抑制活性研究，为其作为糖尿病先导化合物的可能性提供价值参考。
【参考文献】
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论文作者:温彦涛1,高再林2
论文发表刊物:《医药前沿》2017年5月第15期
论文发表时间:2017/5/28
标签：糖苷酶论文; 活性论文; 抑制论文; 化合物论文; 曲霉论文; 产物论文; 层析论文; 《医药前沿》2017年5月第15期论文;