黄志敏
湖南省汨罗市中医院 湖南汨罗 414400
摘要：目的：分析应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清丙肝抗体（HCV-Ab）出现假阳性结果的原因，并探讨预防方法，以提高检测结果的准确性。方法：选取来院检查的80例HCV感染高危者，分别对其行逆转录PCR法（RT-PCR）检测和ELISA法检测，以RT-PCR检测结果为对照，对ELISA法检测结果进行分析，探讨影响ELISA法检测HCV-Ab假阳性的原因及预防方法。结果：RT-PCR检测80例HCV感染高危者有70例为HCV-Ab阳性，10例阴性，经ELISA法检测70例HCV-Ab阳性者中有68例阳性，2例阴性，10例HCV-Ab阴性受试者有4例为阳性，6例为阴性，ELISA法对丙肝诊断的灵敏度、特异度、准确度、约登指数、阳性和阴性预测值分别为97.1%、60.0%、92.5%、57.1%、94.4%、75.0%。结论：ELISA对丙肝的诊断具有较高的价值，但在实际检测HCV-Ab过程中受到各种因素影响可能会出现假阳性的结果，因此操作人员要严格执行操作流程，尽量减少人为失误，并结合实际情况决定是否复查，以提高检测准确率。
关键词：酶联免疫吸附法；血清丙肝抗体；假阳性
酶联免疫吸附法（ELISA）是目前全国各血站系统及医院进行血液检测感染性疾病抗体/抗原最常用的方法之一，具有简单、方便、快速的特点。但是在检测过程中存在许多不确定因素，可导致不同实验室的同一批次或同一实验室的不同批次检测结果不一致，出现假阳性结果，影响病情的筛查[1]。血清丙肝抗体（HCV-Ab）在使用ELISA法检测时常出现假阳性，导致其检测结果的不准确，本次的研究中将对使用ELISA检测HCV-Ab导致假阳性结果的原因进行分析，以提高对HCV-Ab的检测准确性，报道如下：
1 资料与方法
1.1 临床资料
从2016年1月-2016年12月在我院收治的HCV感染高危者80例，其中男性43例，女性37例，使用进行RT-PCR、ELISA法对80例HCV感染高危者进行HCV-Ab检测。
1.2 方法
仪器与试剂：ELx800 光吸收酶标仪由北京伯乐生命科学发展有限公司提供，AT-828自动洗板机由上海益联医学仪器发展有限公司提供，PE480 DNA扩增仪由北京领宇科技有限公司提供，HCV-Ab酶联免疫试剂由江苏酶标生物科技有限公司提供，HCV-RNA、HBV、PCR测定试剂公司由上海恒远生物科技有限公司提供。
所有患者均采集清晨空腹静脉血5mL，加入抗凝试管后经离心分析血清，在4h内使用ELISA法检测HCV-Ab3次，之后使用 RT-PCR法检测：加裂解液裂解处理，提取HCV-RNA，原试管内加入逆转录反应混合物10μL，逆转cDNA，逆转录产物（原管）10μL加入第一次PCR反应缓冲液20μL、Taq-plu，94℃1’，60℃1.5’，扩增30cycle，取PCR第一次产物3μL加入第二次PCR反应液，相同条件下再次扩增30cycle，取PCR扩增产物10μL，与2μL载样缓冲液混匀，经2.5%含有0.5μg/uL的溴化乙锭琼脂糖电泳，紫外灯下观察，若145bp处出现1条cDNA扩增带，与阳性模板平行，则为阳性标本。所有标本均严格按照仪器操作说明及试剂盒说明书操作。
1.3 统计学分析
研究中所得数据均使用SPSS19.0软件系统检验，计数资料以（%）表示，使用X2检验，P＜0.05是差异有统计学意义的前提。
2.结果
经RT-PCR检测本组的80例HCV感染高危者中有70例为HCV-Ab阳性，10例为阴性，在70例HCV-Ab阳性患者中ELISA检测发现68例阳性，2例阴性，在HCV-Ab阴性受试者中ELISA检测发现4例阳性，6例阴性，四表格检测结果见表1；ELISA检测对丙肝诊断价值统计结果见表2，可知灵敏度、特异度、准确度、约登指数、阳性和阴性预测值分别为97.1%、60.0%、92.5%、57.1%、94.4%、75.0%。
3 讨论
丙型病毒肝炎我国的感染率仅次于乙肝，该病的发生主要是由丙肝病毒（HCV）引起，可经血液、性及母婴等方式传播，多数的急性肝炎可转变为慢性肝炎，并可形成肝硬化和肝癌，对我国居民的健康造成了严重的影响。急性的丙肝病毒感染部分患者可自愈，而慢性的丙型肝炎较难治愈，且目前对于丙肝病毒尚缺乏特效的治疗方法，也未研究出有效的疫苗，因此对于急性丙型肝炎，一经发现立即采取有效的手段治疗，以改善患者的预后[2]。目前丙型肝炎主要是通过实验室血液检验确诊，最常用的诊断指标为HCV-Ab，临床检测HCV-Ab的常用方法为胶体金试纸法（GICA）和ELISA法，GICA以胶体金为跟踪标志物，对抗原/抗体进行免疫标记，有操作简单、快速的特点，但是该检验方法的灵敏度低，可重复性差，多用于血液疾病的初步筛查中，而ELISA是一种特殊的试剂分析法，通过让抗体与酶复合物结合，以显色来检测，具有高度的灵敏性和强特异性，可进行定量与半定量检测，因此在临床的应用更为广泛[3]。
本次的研究中所选择的80例HCV感染高危者经RT-PCR检测HCV-Ab阳性为70例，阴性10例，70例经RT-PCR检测阳性患者中68例HCV-Ab阳性，2例阴性，10例RT-PCR检测阴性患者中，4例为阳性，6例为阴性，ELISA检测对丙肝诊断的灵敏度、特异度、准确度、约登指数、阳性和阴性预测值分别为97.1%、60.0%、92.5%、57.1%、94.4%、75.0%，提示ELISA法检测对于丙肝的诊断具有较高的价值。ELISA法的作用原理为使抗原/抗体与某种固相载体表面结合，并使其保持免疫活性，在进行检测时将受检标本与酶标抗原/抗体按照不同的步骤和固相载体表面的抗原/抗体起反应，并通过洗涤分开固相载体上形成的抗原/抗体复合物和其他物质，让标本中受检物质的量与结合在固相载体上的酶量形成一定的比例，之后加入酶反应底物，使底物被催化为有色的产物，从而根据所出现的颜色深浅进行定性、定量分析。但是在实际的检测过程中，有很多影响酶联免疫的因素，本次结果发现有4例假阳性，分析干扰因素包括：标本的质量，类风湿因子、超氧化物歧化酶的干扰，试剂盒的质量，操作技术等。采集标本后发生溶血或贮存时间过长，导致标本被细菌污染或者标本凝固不全，吸收到红细胞，可导致标本质量受影响出现假阳性结果；若受检者血清中含有类风湿因子、超氧化物歧化酶等物质，可与固相载体物结合，使检测结果出现假阳性；试剂盒抗原不纯、与酶的结合度低也会使结果出现假阳性；在操作过程中加样的时间过长、恒温箱孵育时间延长以及试剂贱出孔外，或在洗板过程中，孔与孔之间的液体交叉污染、洗板堵塞、洗液量不足以及洗板的次数少，以上这些因素均是导致检测结果出现假阳性的原因[4]。
检测标本时出现假阳性结果不仅会影响疾病的筛查，也会影响疾病的诊断，因此如何避免影响ELISA检测结果的因素，提高检测的准确性具有重要意义。减少对ELISA检测结果的影响，提高检测准确率，需要从标本采集、运输到检验时严格按照操作规程进。在标本采集前了解患者的疾病史，若有影响检测结果的疾病应在检验申请单标注，以帮助实验室操作人员准确判断。在标本运输时保持平稳，避免剧烈晃荡，采集标本后尽快送检，避免长时间的储存干扰检验结果。抗凝标本在采血后要立即颠倒5次以上，注意保持动作的轻柔，避免发生溶血，若标本为凝固血，应先将标本自然放置1h后再进行离心分离操作。离心后的血清标本要及时加样，谨慎操作，避免酶试剂滴到孔外，若不慎滴入孔外，应及时使用吸水纸吸干。洗板要彻底清洗，保证洗板针的通畅，在检测时要严格按照检测程序及试剂盒操作说明进行，以保证结果的准确性[5]。若有怀疑存在假阳性的血清标本可进行HCV-RNA检测，确保检验结果的准确性。
综上所述，ELISA法检测血清HCV-Ab出现假阳性的结果除与试剂盒质量和检测仪器有关，与标本采集与处理等因素也有一定的关系，在检验过程中操作者应规范操作，尽量减少人为的影响因素，对于可疑的阳性结果，应复查检验，以提高检验结果的准确性。
参考文献：
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论文作者:黄志敏
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年6月18期
论文发表时间:2018/8/22
标签：阳性论文; 标本论文; 阴性论文; 抗体论文; 丙肝论文; 血清论文; 免疫论文; 《中国误诊学杂志》2018年6月18期论文;