杨鹏飞[1]2000年在《Caspase-1、caspase-3在脑损伤中的作用和相互影响的实验研究》文中指出Caspase-1、caspase-3是迄今已发现16位成员的天门冬氨酸（Asp）特异性半胱氨酸蛋白酶caspase超家族的较为活跃的两个成员，前者与炎症反应和细胞凋亡有关，后者与细胞凋亡关系密切。两者在中枢神经系统中均有广泛表达，caspase-3在中枢神经系统的生长发育中起重要作用，caspase-1、caspase-3还参与脑缺血、缺氧，脑创伤等急性损害以及早老性痴呆、亨廷顿病、帕金森病等慢性退行性神经病变等多种病理过程。 为研究caspase-1、caspase-3在脑损伤中的作用及相互之间的影响，本实验采用自由落体脑损伤模型，伤后经脑室分别注射caspase-1、caspase-3选择性抑用剂z-YVAD-fmk，z-DEVD-fmk，分别于脑外伤后不同时相点用ABC法检测caspase-1、caspase-3活性片断P20的表达；用干湿重法检测脑含水量；TUNEL法检测细胞死亡的形式；并在24h和1周对大鼠进行神经功能评分。 结果显示： 1．脑外伤后存在脑水肿、神经细胞凋亡和较高水平的caspase-1、caspase-3活性片断的表达及神经功能损害。 2．Caspase-1抑制剂z-YVAD-fmk可抑制caspase-1表达，并明显减轻脑水肿，减少神经细胞凋亡和减轻神经功能损害。 3．Caspase-3抑制剂z-DEVD-fmk可抑制caspase-3表达，并显著减少神经细胞凋亡和减轻神经功能损害。 4．抑制caspase-1活性片断表达后caspase-3活性片断表达亦被部分抑制，即前者对后者有上调作用。 结果表明，caspase-1和caspase-3在脑外伤继发性损害中起重要作 第一军医大学97级硕士研究生论文 用，前者可能通过介导炎症增加脑水肿并参与细胞凋亡，后者通过介导 细胞凋亡而起作用，适当抑制caspase活性可望为脑损伤治疗提供一种 新的途径。
张雨平[2]2003年在《Caspase-3抑制剂抗新生鼠缺氧缺血脑损伤实验研究》文中研究表明目的：观察缺氧缺血脑损伤(HIBD)新生鼠脑组织Caspase-3活性、Caspase-3蛋白表达量变化，了解Caspase-3特异性肽类抑制剂AC-DEVD-CHO对新生鼠HIBD的治疗效果、最佳治疗剂量、以及对鼠的远期学习记忆能力和运动能力影响。旨在为临床治疗新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)探索新的途径。方法：采用改良Levine法建立新生鼠HIBD模型后进行以下研究：(1)应用四肽荧光底物法检测HIBD后1h、12h、24h、48h新生鼠脑Caspase-3活性，应用免疫组化法、TUNEL法半定量检测上述各时间点新生鼠脑组织的活性Caspase-3蛋白表达量和细胞凋亡数。(2)分组给予HIBD后1h新生鼠不同剂量Ac-DEVD-CHO(50ng、100ng、200ng、300ng、400ng)脑室注射, 24h后检测各组新生鼠患侧脑组织Caspase-3活性的变化，选出最佳治疗剂量；(3)采用选出的最佳治疗剂量300ng脑室注射, 24h后处死动物作病理学观察、TUNEL法检测原位细胞凋亡，喂养鼠至1月龄时测试鼠学习记忆和运动能力。结果:(1)HIBD后1h患侧(左侧)脑组织Caspase-3活性已升高，HIBD后24h达高峰，48h后明显下降。其显著性检验如下：a、HIBD后各时间点之间比较左侧脑组织Caspase-3活性有显著性差异( p<0.01)；b、HIBD后各时间点与假手术组比较左侧脑组织Caspase-3活性有显著性差异(p<0.05)；c、HIBD后各时间点左侧和右侧比较Caspase-3活性有显著性差异(p<0.05)；d、HIBD后各时间点与假手术组比较右侧脑组织Caspase-3活性稍有增加，但差异无显著性。(2)HIBD新生鼠患侧脑组织活性Caspase-3阳性细胞数明显增多。假手术组左侧脑组织阳性细胞占细胞总数的百分率为0.65±0.67％；HIBD24h组左侧脑组织阳性细胞百分率为52.94±7.9％；HIBD48h组为41.5±5.7％。HIBD24、48h组较假手术组阳性细胞百分率均有显著差异(p<0.01)。(3)HE染色见HIBD组新生鼠患侧皮质海马凋亡细胞呈弥散或小灶性分布，细胞体积缩小、核固缩、核碎裂。HIBD24、48h组凋亡细胞明显增多。(4)HIBD组新生鼠患侧脑组织TUNEL染色阳性细胞数随时间增多，假手术组新生鼠左脑TUNEL阳性细胞数占细胞总数0.6±0.77％，HIBD1h组左侧脑组织阳性细胞占细胞总数5.2±1.93 ％，HIBD12h组占18.5±6.23％；HIBD24h组占44.13±8.41％；HIBD48h组占30.8±9.58％；HIBD1W组占14.0±7.1％。HIBD各组的细胞凋亡百分率较对照组均有显著差异<WP=7>(p<0.01)，各组之间比较也均有显著差异(p<0.01)；(5)HIBD后1h分别予脑室注射Ac-DEVD-CHO50ng、100ng、200ng、300ng、400ng，24h 后检测，患侧脑组织Caspase-3活性随注射Ac-DEVD-CHO剂量增加而递减；(6)HIBD后24h检测，Ac-DEVD-CHO300ng治疗组新生鼠患侧脑组织TUNEL阳性细胞百分率为30.2±11.2％，N.S.对照组为44.6±12.4％，差异显著(P<0.01)；(7)Ac-DEVD-CHO治疗组新生鼠较N.S.对照组在穿梭箱实验中受电击时间显著缩短(p<0.05)；电击次数亦减少，但差异不显著；Ac-DEVD-CHO治疗组较N.S.对照组自主活动次数、疲劳仪实验潜伏期均无显著差异。结论：1、HIBD新生鼠患侧脑组织中Caspase-3明显被激活，提示Caspase-3在HIBD神经细胞凋亡中起重要作用。2、HIBD新生鼠脑皮质和海马的神经细胞凋亡随时间先呈依从性增多，48h后逐渐下降。3、Ac-DEVD-CHO侧脑室注射可显著减少HIBD新生鼠脑细胞凋亡，提示其对HIBD有治疗作用。4、Ac-DEVD-CHO能改善HIBD新生鼠的远期学习记忆能力，但对其远期运动能力无影响。
李克玲[3]2004年在《救脑宁注射液治疗实验性脑血肿家兔的作用及其机制研究》文中研究表明出血性中风多发生在中、老年高血压病人,是一种常见、多发病,由于其高病死率、高致残率,严重危害人类健康。近年来,大量文献显示,人们对缺血再灌注损伤所致的缺血性中风研究较多,而对出血性中风研究相对较少。本研究是在我们已往多年的工作基础上,以活血化瘀、清热解毒、化痰开窍法方药—救脑宁注射液为基础,以脑血肿周围损伤组织的神经细胞凋亡变化为切入点,从整体、细胞、分子、基因水平深入探讨中医药对实验性脑血肿以及原代神经细胞拟缺血再灌注损伤的保护作用,这将对指导中医临床及深入研究中医药有效方剂的作用机制提供实验依据。 本论文包括三部分:(1)救脑宁注射液对实验性脑血肿家兔治疗作用的研究:复制家兔实验性脑血肿模型,观察脑组织病理学变化的演变规律,以及救脑宁注射液的治疗效应;(2)救脑宁注射液对缺血再灌注诱导原代神经细胞损伤的影响:在体外培养神经细胞拟缺血再灌注损伤模型上,观察救脑宁注射液抗损伤作用的细胞代谢、形态学与凋亡变化;(3)救脑宁注射液改善缺血再灌注所致原代神经细胞凋亡及其调控机制的研究:从细胞、分子、基因水平,在原代神经细胞拟缺血再灌注损伤模型基础上,试图从凋亡发生的两条主要途径:线粒体途径和死亡受体途径、Caspase-3 蛋白酶级联反应以及相关的上游调控基因等方面阐明救脑宁注射液抗神经细胞凋亡的作用环节与机制。 家兔脑血肿整体动物实验分为六组:正常对照组(Control),模型组(Model),救脑宁高剂量组(JNN-H),中剂量组(JNN-M),低剂量组(JNN-L)和清开灵注射液组(QKL)。实验各组分别在造模后 3、7、15 天(d)取材,观察动物一般情况、脑系数、脑组织含水量、脑组织 HE、Nissl’s、Mallory 染色、投射电镜形态学变化以及 TUNEL 染色显示凋亡细胞等指标变化,并采用计算机图像分析系统对相关形态学指标进行定量分析。 体外培养神经细胞拟缺血再灌注损伤实验也同样分为上述六组即:Control,Model,JNN-H,JNN-M,JNN-L,QKL。实验各组分别于单纯缺血 2 小时(h)及缺血 2h+再灌注 4h取材,检测细胞代谢率(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞凋亡率(流式细胞技术)、形态学、细胞 DNA 和 RNA 变化(AO 染色)、线粒体膜电位(流式细胞技术)、细胞内 pH 值(流式细胞技术)、细胞内 bcl-2/bax、Fas/FasL、Caspase-3 蛋白的表达以及RT-PCR 检测 bcl-2/bax mRNA 表达等指标变化,用计算机图像分析系统对相关指标进行定量分析。 主要实验结果如下: 1. 救脑宁注射液可改善实验性脑血肿家兔一般状态,减轻脑水肿及病理组织学变化,抑制凋亡发生 实验动物造模后,健侧(左侧)肌力下降,尤以前肢为重,行走病侧(右侧)偏转步态,以术后 7-9 天内明显;造模后 3、7、15 天,分别出现不同程度的脑水肿、脑组织含水量增加,以 3、7 天为重;脑组织病理形态学观察可见:(1)造模 3 天时,脑组织以广泛的细胞与间质水肿和出血为重,神经细胞不同程度的变性、坏死;(2)造模 7 天时,脑组织水肿仍较明显,出血现象有不同程度的改善,血肿周围脑组织出现明显的炎细胞反应与胶质增生现象,可见少量格子细胞;(3)造模 15 天时,从脑组织形态学变化上看,<WP=4>-2- 救脑宁注射液治疗实验性脑血肿家兔的作用及其机制研究脑组织水肿已不十分明显,出血现象也有减轻,血肿周围脑组织的胶质反应性增生及炎细胞浸润现象更加明显,并可见较多的格子细胞,血肿有明显的吸收表现。脑组织 TUNEL 染色,造模后皆有明显的阳性深染细胞出现,但以 7 天时凋亡表现最重。 救脑宁注射液高、中、低剂量组,在各取材时间点表现出不同程度地减小血肿面积,减轻脑组织含水量及血肿周围组织出血、水肿现象;TUNEL 染色显示,神经细胞凋亡阳性细胞数明显少于相同时间点的模型组;从三种用药剂量对各指标的作用效果来看,以中剂量作用更好一些,其与清开灵的药效作用相比,要么相似要么更佳。 2. 救脑宁注射液有不同程度地提高神经细胞代谢率及 DNA、RNA 含量,降低 LDH 漏出率与凋亡率,改善缺血再灌注致形态学异常变化 神经细胞造模后,细胞代谢率 MTT 明显下降,LDH 漏出率、凋亡率明显升高,与正常对照组比较 p<0.05;形态学表现为:(1)倒置相差显微镜:可见有的细胞体积变大,轮廓不清,光晕不明显,突起肿胀、断裂或短缩。而有的细胞则体积缩小,颜色加深,光晕消失;(2)普通光学显微镜:HE 染色,神经元的数目较正常对照组明显减少,神经元突起形成的网络明显稀疏。神经元发生不同程度的肿胀,轮廓不清,突起有断裂、短缩;部分神经元体积变小,深染,出现核固缩现象等;Nissl’s 染色,可见细胞内尼氏体明显减少,模糊不清。(3)荧光显微镜:细胞内染色质稀疏,DNA、RNA 含量均减少,荧光强度明显减弱;部分神经细胞核明显固缩,核内染色质凝集呈块状分布,核膜完整。上述损伤性变化以缺血 2h+再灌注 4h 时为重。 救脑宁注射液高、中、低剂量组,在各时间点表现出不同程度地提高细胞代谢率、降低 LDH 漏出率和凋亡率的作用,与模型组比较 p<0.05;同时也显示出改善细胞形态学异常变化、增加细胞内 DNA、RNA 含量,保护神经细胞功能与结构免遭?
费霏[4]2015年在《缺血缺氧性视神经视网膜损伤的分子机制研究》文中研究说明第一部分Homer1a在眼部缺血缺氧损伤中的作用1研究背景眼部缺血缺氧后视网膜神经节细胞发生病理改变,可引起视神经不可逆的损伤,导致视力损失甚至失明。目前研究发现,眼部缺血缺氧损伤主要发生在视网膜动静脉阻塞、未成熟的视网膜病变、糖尿病性的视网膜病变、青光眼等视网膜血管阻塞所致的缺血性疾病中,表现为组织细胞缺血及缺氧损伤后,细胞正常结构消失、功能破坏等。因此,保护视神经、减少视网膜神经节细胞缺血缺氧后损伤等研究具有重要的意义和作用。前期文献报道提示,Homer1a作为一种重要的突触后致密物质,在创伤性脑损伤中具有重要作用,可通过调节Erk信号通路发挥神经保护作用。也有研究发现Homer1和眼部疾病密切相关,但在眼部缺血缺氧损伤后Homer1a的改变与作用尚不明确,仍需进一步研究。本研究的目的是:(1)明确眼部缺血缺氧后Homer1a的表达变化;(2)探讨在眼部缺血缺氧后Homer1a对视网膜神经节细胞的作用及其机制。2方法(1)细胞模型:原代培养小鼠视网膜神经节细胞,采用氧糖剥夺模型;(2)动物模型:生理盐水诱导小鼠眼部缺血缺氧模型;(3)蛋白表达:采用Western blot检测视网膜神经节细胞或视网膜中Homer1a、Erk、磷酸化Erk(p-Erk)、剪切的Caspase3(cleaved-Caspase3)、Caspase3等蛋白在缺血缺氧后的表达变化;(4)细胞损伤:TUNEL染色及Caspase3剪切水平检测视网膜神经节细胞凋亡情况,β-III-微管蛋白染色检测视网膜缺血缺氧后的视网膜神经节细胞存活情况;(5)药物干预:应用Erk抑制剂(PD98059)抑制Erk激活;(6)基因干涉/过表达:采用慢病毒介导的基因干涉/过表达手段调节Homer1a表达;(7)基因敲除动物:采用Homer1a基因敲除动物验证Homer1a神经保护作用。3结果和结论本实验分别使用细胞及动物缺血缺氧模型,通过Western blot、基因干涉/过表达、TUNEL染色、基因敲除等方法,研究Homer1a在眼部缺血缺氧损伤中的表达改变、作用及其机制。我们的研究发现,体外视网膜神经节细胞氧糖剥夺或体内眼部缺血缺氧损伤后,Homer1a及p-Erk表达水平均显著升高。在体外实验中,上调Homer1a后,p-Erk表达水平显著下降,视网膜神经节细胞的凋亡率明显降低;而下调Homer1a蛋白,p-Erk表达水平升高,视网膜神经节细胞凋亡率也增高。此外,抑制Erk活性,Home1a表达明显增加,视网膜神经节细胞凋亡率明显下降。以上实验表明,氧糖剥夺损伤后,Homer1a可保护视网膜神经节细胞;在相同损伤条件下,p-Erk表达水平和细胞凋亡率有相关关系,高表达p-Erk视网膜神经节细胞凋亡率升高,而低表达p-Erk视网膜神经节细胞凋亡率降低;Homer1a与Erk信号通路相互作用,发挥神经保护作用。进一步的体内实验表明:小鼠眼部缺血缺氧造模后,Homer1a基因敲除小鼠(KO,Homer1a-/-)视网膜神经节细胞存活率及突起连接较野生型小鼠(WT,Homer1a+/+)显著降低,进一步证实视网膜缺血缺氧损伤后Homer1a可能有神经保护作用。综上,在眼部缺血缺氧损伤中Homer1a可能通过调节Erk信号通路发挥神经保护作用。第二部分NLRP3炎性体在眼部缺血缺氧损伤中的作用1研究背景眼部缺血缺氧可导致眼底部神经组织不可逆损伤,该种损伤存在于多种眼部疾病的发生与发展过程中。近期研究表明,眼部的缺血缺氧损伤最早发生在视乳头区,众所周知,视乳头区是视神经出眼入颅的部位,该部位视神经可直接和小胶质细胞接触,当小胶质细胞受刺激被激活后,可迅速释放炎性因子等,引发炎症级联反应,最终引起细胞组织损伤。我们的前期实验发现,在小鼠和人的视网膜乳头区NLRP3炎性体高表达。NLRP3炎性体作为Caspase1激活的平台,在炎症级联反应中具有重要作用。但NLRP3炎性体激活并导致神经节细胞损伤的具体机制尚不明确,仍需进一步研究。本研究的目的是:(1)明确NLRP3炎性体在眼部缺血缺氧损伤中的改变与作用;(2)探讨NLRP3炎性体在眼部缺血缺氧损伤后的确切作用机制。2方法(1)动物模型:聚苯乙烯微球前房注射诱导小鼠眼部缺血缺氧模型;(2)免疫荧光染色:β-Ⅲ-微管蛋白标记视网膜神经节细胞及Iba1染色标记小胶质细胞;(3)分子表达:采用荧光实时定量的方法检测动物视网膜乳头区组织中炎性体相关蛋白在缺血缺氧后的表达变化。3结果和结论本实验使用聚苯乙烯微球前房注射诱导小鼠眼部缺血缺氧模型,通过免疫荧光染色、荧光实时定量等方法,研究NLRP3炎性体在眼部缺血缺氧损伤中的作用及机制。本研究发现,NLRP3炎性体在正常人及小鼠视网膜乳头区均高表达。小鼠眼部缺血缺氧损伤后,NLRP3敲除小鼠(KO,NLRP3-/-)及ASC敲除小鼠(KO,ASC-/-)视网膜神经节细胞存活率及突起连接较野生型小鼠(C57/BL6J)显著增加,证实视网膜缺血缺氧损伤后NLRP3炎性体可能在视网膜神经节细胞损伤中起重要作用。进一步荧光实时定量方法发现,眼部缺血缺氧损伤后,野生型小鼠(C57/BL6J)视网膜乳头区NLRP3炎性体相关分子Caspase1、IL-1β和IL-18表达显著升高。以上结果证明,NLRP3炎性体在小鼠眼部缺血缺氧损伤中,活化小鼠视乳头区Caspase1、IL-1β和IL-18等炎性因子。此外,IL-1R敲除小鼠(KO,IL-1R-/-)及IL-18敲除小鼠(IL-18-/-)眼部缺血缺氧损伤后,较野生型小鼠(C57/BL6J),其视网膜神经节细胞存活率及突起连接明显增加,提示IL-1β和IL-18等炎性因子可招募下游分子,引发炎症级联反应,导致视网膜神经节细胞损伤。以上结果证明,NLRP3炎性体在眼部缺血缺氧损伤中可通过激活Caspase1活化并释放IL-1β和IL-18,引发视网膜神经节细胞损伤,破坏其突起连接,发挥神经损伤作用。
史志勤[5]2009年在《实验性癫痫大鼠凋亡机制的探讨及重组人促红细胞生成素的影响》文中研究指明癫痫是由于脑部兴奋性过高的某些神经元突然异常放电引起的脑功能的异常。癫痫是中枢神经系统最常见的症状和疾病之一。癫痫持续状态是神经科的急症,常常伴发10%–12%的死亡率,严重影响了病人的生活质量。在颞叶癫痫的病人及各种各样的试验性癫痫模型、癫痫持续状态模型上用形态学和生物化学等办法均证实损伤的神经元具有典型的凋亡特征。虽然对凋亡启动的具体的信号传导通路还不是很清楚,但凋亡在癫痫持续状态中的影响却引来了许多的关注。凋亡的发生激活了包括线粒体、线粒体相关调控因子及Caspsae家族等许多的信号途径,是细胞死亡的主要过程,最终导致细胞核染色质的凝聚、DNA的断裂、凋亡小体的形成。凋亡的发生通过三条主要的途径:线粒体依赖途径、死亡受体依赖途径、内质网依赖途径。线粒体凋亡途径是主要的凋亡途径,它诱导细胞色素C从线粒体释放并激活了死亡信号。细胞色素C从线粒体释放出来,与凋亡活化因子-1 (apoptosis activated factor-1,Apaf-1)及Caspase-9结合形成复合体。Caspase-9的激活将引起其下游胱天蛋白酶的级联反应,导致该细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白、凋亡抑制蛋白(IAPs)家族都是重要的线粒体依赖凋亡途径的相关调控因子。Bcl-2家族蛋白通过调控线粒体膜的通透性和细胞色素C的释放来介导凋亡,Bcl-2蛋白家族包括促凋亡成员Bax、Bad等,和抗凋亡成员Bcl-2、Bcl-xl等。尽管Bax和Bad大多数时候存在于细胞质,但它们可以易位到线粒体和Bcl-2形成促凋亡的复合物,然后释放细胞色素C。与促凋亡蛋白相对应的是抗凋亡蛋白,抗凋亡蛋白Bcl-2存在于线粒体膜的外部,通过多种机制阻断促凋亡分子释放到线粒体,这些机制包括维持线粒体膜的完整性和联合Bcl-2家族中的促凋亡蛋白。Bcl-2/Bax的比率也是决定细胞生存与死亡的关键。在仅含BH3区蛋白的成员中,Bad是最早被鉴别出来,最具有特征性的蛋白。Bad通过在线粒体膜的外部与Bcl-2和Bcl-xl结合引起细胞色素C释放到细胞质来诱导凋亡的发生。Bad的促凋亡功能主要是通过与Bcl-2和Bcl-xl结合来阻断他们的抗凋亡作用。例如:Bad可以阻断Bcl-2和Bcl-xl在线粒体外膜上形成通道的能力,或者是阻断他们结合和稳定电压依从性阴离子通道的能力。Bad是一个可以被磷酸化调节的典型的促凋亡蛋白,激活的Akt使Bad中的Ser136磷酸化,导致14-3-3蛋白与Bad的结合,稳定与细胞之中,使它不能在线粒体外膜上与Bcl-2和Bcl-xl相互作用,抑制了Bad所诱导的细胞凋亡。Caspase-9,就像其他的Caspase成员一样,以一种没有活性的酶原形式存在并通过蛋白酶解加工激活。细胞色素C一旦释放到细胞质就会与Apaf-1相互作用,导致Caspase-9酶原的激活,激活的Caspase-9进而激活Caspase-3,随后引起其他的Caspase的级联反应,导致该细胞凋亡。IAPs家族是细胞内抗凋亡蛋白家族,在杆状病毒中首先被鉴定出来,在一个后线粒体水平通过调节死亡信号途径发挥着重要的促细胞存活作用。IAPs家族包括XIAP、Hiap-1、Survivin、Livin等等。XIAP是首先被克隆出来的哺乳动物IAPs家族成员之一,是该家族中最具有抗凋亡能力的成员之一。XIAP可以直接阻断Caspase-3 and Caspase-9,通过对Caspase-9的阻断来调节Bax/细胞色素C介导的线粒体凋亡途径。PI3K是促进细胞存活的信号传导途径中的重要激酶,起到十分关键的作用。在各种细胞中发挥着调整细胞分裂周期、生长、新陈代谢、抑制凋亡的作用。众所周知,激活的Akt通过调整一些重要的调节因子介导细胞的存活,包括Bad、Bax、Bcl-2、Caspase-9和XIAP等等,这些调节因子同时也是线粒体依赖凋亡途径的相关调控因子。第一个被鉴定出来的Akt的下游分子是促凋亡蛋白Bad,Akt可以磷酸化Bad的Ser136位点,导致Bad的钝化。磷酸化的Bad具有抗凋亡的作用,因为非磷酸化的Bad可以和Bcl-2和Bcl-xl形成异二聚体,阻断他们的抗凋亡作用。另外,研究显示在Akt依赖的情况下BaxSer184可以被Akt磷酸化,阻断了Bax和Bcl-2家族中抗凋亡蛋白在线粒体膜形成异二聚体的能力,Akt也磷酸化CREB的Ser133位点,增加Bcl-2等抗凋亡因子的转录水平。Akt也可以磷酸化IKK的Thr-23位点,释放NF-кB,然后NF-кB可以上调Bcl-2的表达。最近,有研究显在体内、体外的实验中Akt在生理条件下也可以磷酸化XIAP的Ser87位点。这些研究显示了Akt和它的下游靶分子构成了主要的细胞存活途径。EPO最初被了解是因为它通过保护红系祖细胞对抗凋亡来增多红细胞的作用。现在EPO和它的受体在人类和啮齿类动物的中枢神经系统中的各种类型的细胞中被发现,例如星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞。在中枢和外周神经系统损伤如:创伤、缺血和炎症等体内、体外的各种模型中均证实外源性的EPO系统性给药具有神经保护的作用。另外,还有研究显示在啮齿类动物颞叶癫痫的模型中,rHuEPO已经显示出明显的对抗癫痫持续状态发生发展的作用,但在癫痫持续状态中不能确定rHuEPO是否具有神经保护作用。系统性给予rHuEPO使其发挥神经保护作用要求rHuEPO能够穿过血脑屏障,现在已有研究显示rHuEPO系统性给药可以通过受体介导的方式穿过血脑屏障。而且,预处理或者后处理rHuEPO在一些研究中也被证实在癫痫持续状态损伤中均具有神经保护作用。EPO和EPO受体结合后激活JAK2,引起下游包括转录激活因子-5 (STAT-5)、PI3K/Akt和Ras/丝裂素激活的蛋白激酶(MA PK)等信号通路的激活,来发挥抗凋亡的作用。PI3K通过激活Akt来实现其促存活的作用,Akt又称为蛋白激酶B,是PI3K最具有特征性的下游靶分子,PI3K的抑制剂可以阻断Akt的激活。许多实验通过观察磷酸化Akt的表达来确定PI3K/Akt信号通路的激活情况,在许多研究中rHuEPO已被证实具有神经保护作用。然而,研究也显示EPO还可以通过JAK/ STAT、ERK 1/2、NF-κB等信号途径发挥抗凋亡的神经保护作用。因此,我们在rHuEPO治疗前给予PI3K抑制剂LY294002进行阻断,去观察在体内试验模型中,rHuEPO是否经PI3K/Akt信号途径发挥神经保护作用。有鉴于此,我们的研究目的是观察后处理的外源性rHuEPO对PTZ诱导的癫痫持续状态大鼠的抗凋亡的神经保护作用,探讨rHuEPO是否通过PI3K/Akt信号途径对线粒体依赖凋亡途径的相关调控因子进行调节借以发挥抗凋亡的神经保护作用。第一部分癫痫持续状态大鼠海马神经元凋亡和p-Akt表达的变化及重组人红细胞生成素的影响目的:建立戊四氮点燃癫痫持续状态大鼠模型,观察大鼠海马区神经元的凋亡及p-Akt表达的变化及重组人红细胞生成素(rHuEPO)的影响。方法:选用健康雄性SD大鼠,建立动物模型:戊四氮(PTZ)20 mg·kg-1大鼠腹腔注射,然后每10min注射10 mg·kg-1,直至达到足够强度和SE持续发作,Ⅳ、Ⅴ级发作即为全身性惊厥大发作,持续30 min及以上者为SE。筛选合格后随机分为五组:PTZ组:腹腔注射PTZ点燃SE发作后30分钟腹腔注射生理盐水; rHuEPO组:腹腔注射PTZ点燃SE发作后30分钟腹腔注射rHuEPO 5000U. kg-1;LY294002组:腹腔注射PTZ点燃SE发作后10分钟脑室注射给予5μl LY294002,SE发作后30分钟腹腔注射rHuEPO 5000 U.kg-1;DMSO对照组:腹腔注射PTZ点燃SE发作后10分钟脑室注射给予5μlDMSO, SE发作后30分钟腹腔注射rHuEPO 5000U.kg-1;Control组:腹腔注射相同体积、次数的生理盐水。造模成功后描记脑电图(electroencephalogram, EEG)变化。每组大鼠各取10只,10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取含海马脑段,石蜡包埋,冠状切片,采用TUNEL方法观察神经元的凋亡和免疫组化染色SP法测定p-Akt免疫反应阳性细胞的数目。每组大鼠各取10只,迅速分离海马,Western blot方法检测海马Akt、p-Akt蛋白表达的变化。结果:EEG表现:Control组大鼠脑电图以α、β波,背景正常,无异常放电现象;PTZ组大鼠在基础波的背景上阵发出现大量高幅尖波、棘波、棘慢复合波、尖慢复合波,持续1-2S;rHuEPO组、LY294002组和DMSO组大鼠痫性放电明显受到抑制,在基础波的背景下,可现散在少量尖波、棘波,波幅降低。Tunel染色结果:与Control组相比,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组和DMSO组海马区凋亡细胞数目明显增多,差异均有统计学意义(P<0.05);与rHuEPO组、LY294002组和DMSO组相比,PTZ组凋亡细胞数目明显增多,差异均有统计学意义(P <0.05);然而,与LY294002组比较,rHuEPO组、DMSO组凋亡细胞数目明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05);DMSO组凋亡细胞数目虽多于rHuEPO组,但与rHuEPO组相比无显著性差异(P>0.05)。免疫组化染色结果:与Control相比,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组p-Akt的阳性细胞数均显著增多,差异具有统计学意义(P<0.05);rHuEPO组、LY294002组、DMSO组p-Akt的阳性细胞数均较PTZ组明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与rHuEPO组、DMSO组比较,LY294002组p-Akt阳性细胞数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05);rHuEPO组p-Akt的阳性细胞数虽多于DMSO组,但差异不具有统计学意义(P﹥0.05)。Western blot结果:Akt、p-Akt蛋白在各组大鼠海马表达水平分别以Akt/β-actin和p-Akt/β-actin表示,与Control组相比,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组p-Akt蛋白的表达水平明显增多(P<0.05);与PTZ组比较,rHuEPO组、LY294002组、DMSO组p-Akt蛋白的表达水平明显增多(P<0.05);与rHuEPO组、DMSO组相比,LY294002组p-Akt蛋白的表达水平明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05);rHuEPO组p-Akt蛋白的表达水平虽多于DMSO组,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。PTZ、rHuEPO、LY294002对Akt没有明显的影响,各实验组Akt的表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论:本实验建立的戊四氮点燃癫痫持续状态大鼠模型诱导了神经元的凋亡,是研究癫痫后神经元损伤比较理想的动物模型。rHuEPO对癫痫持续状态大鼠具有抗凋亡的神经保护作用,PI3K/Akt途径可能是rHuEPO发挥神经保护的作用通路之一,与提高Akt的活性有关,借以发挥抗凋亡的神经保护作用。第二部分癫痫持续状态大鼠海马Bcl-2家族蛋白的变化及重组人促红细胞生成素的影响目的:观察戊四氮点燃癫痫持续状态大鼠海马Bcl-2、Bax、Bad表达的变化及rHuEPO的影响,探讨rHuEPO是否通过PI3K/Akt途径对线粒体相关调控因子Bcl-2、Bax、Bad进行调节,借以发挥抗凋亡的神经保护作用。方法:每组大鼠各取10只,10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取含海马脑段,石蜡包埋,冠状切片,采用SP法行Bcl-2、Bax、Bad免疫组化染色,测定Bcl-2、Bax、Bad免疫反应阳性细胞的数目。每组大鼠各取10只,迅速分离海马,Trizol提取总RNA,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测定大鼠海马Bcl-2mRNA、BaxmRNA、BadmRNA表达的变化。每组大鼠各取10只,迅速分离海马,Western blot方法检测海马Bcl-2、Bax、Bad蛋白表达的变化。结果:免疫组化染色结果:与Control相比,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组Bcl-2阳性细胞数均显著增多,差异具有统计学意义(P < 0.05);rHuEPO组、LY294002组、DMSO组Bcl-2阳性细胞数均较PTZ组明显增多,差异具有统计学意义(P < 0.05);与rHuEPO组、DMSO组比较,LY294002组Bcl-2阳性细胞数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05);rHuEPO组Bcl-2的阳性细胞数虽多于DMSO组,但差异不具有统计学意义(P﹥0.05)。PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组Bax、Bad的阳性细胞数均较Control组显著增多,差异具有统计学意义(P <0.05);与rHuEPO组、LY294002组、DMSO组相比,PTZ组Bax、Bad的阳性细胞数均明显增多,差异具有统计学意义(P <0.05);而rHuEPO组、DMSO组Bax、Bad的阳性细胞数也均少于LY294002组,差异具有统计学意义(P <0.05);rHuEPO组Bax、Bad的阳性细胞数虽少于DMSO组,但差异不具有统计学意义(P﹥0.05)。RT-PCR结果:各组大鼠海马Bcl-2mRNA、BaxmRNA、BadmRNA的表达水平以Bcl-2mRNA/β-actinmRNA、BaxmRNA/β-actinmRNA、BadmRNA/β-actin mRNA表示。与Control组比较,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组Bcl-2mRNA表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与PTZ组比较,HuEPO组、LY294002组、DMSO组Bcl-2mRNA表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与HuEPO组、DMSO组比较,LY294002组Bcl-2mRNA表达水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与DMSO组相比,HuEPO组Bcl-2mRNA表达水平虽然增多,但无明显统计学差异(P>0.05)。与Control组比较,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组BaxmRNA、BadmRNA表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与HuEPO组、LY294002组、DMSO组比较,PTZ组BaxmRNA、BadmRNA表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与LY294002组比较,HuEPO组、DMSO组BaxmRNA、BadmRNA表达水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与DMSO组相比,HuEPO组BaxmRNA、BadmRNA表达水平虽然减少,但无明显统计学差异(P>0.05)。Western blot结果:Bcl-2、Bax、Bad蛋白在各组大鼠海马表达水平以Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin、Bad/β-actin表示,与Control组相比,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组Bcl-2蛋白的表达水平明显增多(P<0.05);与PTZ组比较,rHuEPO组、LY294002组、DMSO组Bcl-2蛋白的表达水平明显增多(P<0.05);与rHuEPO组、DMSO组相比,LY294002组p-Akt蛋白的表达水平明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05);rHuEPO组p-Akt蛋白的表达水平虽多于DMSO组,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。与Control组比较,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组Bax、Bad蛋白表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与HuEPO组、LY294002组、DMSO组比较,PTZ组Bax、Bad蛋白表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与LY294002组比较,HuEPO组、DMSO组Bax、Bad蛋白表达水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与DMSO组相比,HuEPO组Bax、Bad蛋白表达水平虽然减少,但无明显统计学差异(P>0.05)。结论:PTZ点燃癫痫持续状态后大鼠海马组织Bcl-2、Bad、Bax蛋白及其mRNA水平均升高,提示线粒体凋亡途经相关调控因子Bad、Bcl-2、Bax可能参与了癫痫持续状态后海马神经元凋亡的损伤机制。rHuEPO后处理可以提高癫痫持续状态大鼠海马组织Bcl-2蛋白及其mRNA水平,降低Bad、Bax蛋白及其mRNA表达水平,进而改善癫痫持续状态后大鼠海马神经元的凋亡损伤。rHuEPO后处理改善癫痫持续状态后大鼠海马神经元的凋亡损伤可能通过PI3K/Akt信号传导途径对线粒体凋亡途经相关调控因子Bad、Bcl-2、Bax进行调控,进而介导线粒体凋亡途经,发挥抗凋亡神经保护作用。第三部分癫痫持续状态大鼠海马Caspase-9的变化及重组人促红细胞生成素的影响目的:观察戊四氮点燃癫痫持续状态大鼠海马Caspase-9表达的变化及rHuEPO的影响,探讨rHuEPO是否通过PI3K/Akt途径对线粒体相关调控因子Caspase-9进行调节,借以发挥抗凋亡的神经保护作用。方法:每组大鼠各取10只,10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取含海马脑段,石蜡包埋,冠状切片,采用SP法行Caspase-9免疫组化染色,测定Caspase-9免疫反应阳性细胞的数目。每组大鼠各取10只,迅速分离海马,Trizol提取总RNA,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测定大鼠海马Caspase-9mRNA表达的变化。每组大鼠各取10只,迅速分离海马,Western blot方法检测海马Caspase-9蛋白表达的变化。结果:Caspase-9免疫组化染色结果:PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组Caspase-9的阳性细胞数均较Control组显著增多,差异具有统计学意义(P <0.05);与rHuEPO组、LY294002组、DMSO组相比,PTZ组Caspase-9的阳性细胞数均明显增多,差异具有统计学意义(P <0.05);而rHuEPO组、DMSO组Caspase-9的阳性细胞数也均少于LY294002组,差异具有统计学意义(P <0.05);rHuEPO组Caspase-9的阳性细胞数虽少于DMSO组,但差异不具有统计学意义(P﹥0.05)。RT-PCR结果:各组大鼠海马Caspase-9mRNA的表达水平以Caspase-9mRNA/β-actinmRNA表示。结果显示:与Control组比较,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组Caspase-9mRNA表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与HuEPO组、LY294002组、DMSO组比较,PTZ组Caspase-9mRNA表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与LY294002组比较,HuEPO组、DMSO组Caspase-9mRNA表达水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与DMSO组相比,HuEPO组Caspase-9mRNA表达水平虽然减少,但无明显统计学差异(P>0.05)。Western blot结果:Caspase-9蛋白在各组大鼠海马表达水平以Caspase-9/β-actin表示,结果显示:与Control组比较,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组Caspase-9蛋白表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与HuEPO组、LY294002组、DMSO组比较,PTZ组Caspase-9蛋白表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与LY294002组比较,HuEPO组、DMSO组Caspase-9表达水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与DMSO组相比,HuEPO组Caspase-9蛋白表达水平虽然减少,但无明显统计学差异(P>0.05)。结论:PTZ点燃癫痫持续状态后大鼠海马组织Caspase-9蛋白及其mRNA水平均升高,提示线粒体凋亡途经相关调控因子Caspase-9可能参与了癫痫持续状态后海马神经元凋亡的损伤机制。rHuEPO后处理可以降低癫痫持续状态大鼠海马组织Caspase-9蛋白及其mRNA表达水平,进而改善癫痫持续状态后大鼠海马神经元的凋亡损伤。rHuEPO后处理改善癫痫持续状态后大鼠海马神经元的凋亡损伤可能通过PI3K/Akt信号传导途径对线粒体凋亡途经相关调控因子Caspase-9进行调控,进而介导线粒体凋亡途经,发挥抗凋亡神经保护作用。第四部分癫痫持续状态大鼠海马XIAP的变化及重组人促红细胞生成素的影响目的:观察戊四氮点燃癫痫持续状态大鼠海马XIAP表达的变化及rHuEPO的影响,探讨rHuEPO是否通过PI3K/Akt途径对线粒体相关调控因子XIAP进行调节,发挥抗凋亡的神经保护作用。方法:每组大鼠各取10只,10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取含海马脑段,石蜡包埋,冠状切片,采用SP法行XIAP免疫组化染色,测定XIAP免疫反应阳性细胞的数目。每组大鼠各取10只,迅速分离海马,Trizol提取总RNA,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测定大鼠海马XIAPmRNA表达的变化。每组大鼠各取10只,迅速分离海马,Western blot方法检测海马XIAP蛋白表达的变化。结果:XIAP免疫组化染色结果:与Control相比,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组XIAP阳性细胞数均显著增多,差异具有统计学意义(P < 0.05);rHuEPO组、LY294002组、DMSO组XIAP阳性细胞数均较PTZ组明显增多,差异具有统计学意义(P < 0.05);与rHuEPO组、DMSO组比较,LY294002组XIAP阳性细胞数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05);rHuEPO组XIAP的阳性细胞数虽多于DMSO组,但差异不具有统计学意义(P﹥0.05)。RT-PCR结果:各组大鼠海马XIAPmRNA的表达水平以XIAPmRNA/β-actinmRNA表示。结果显示:与Control组比较,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组XIAPmRNA表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与PTZ组比较,HuEPO组、LY294002组、DMSO组XIAPmRNA表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与HuEPO组、DMSO组比较,LY294002组XIAPmRNA表达水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与DMSO组相比,HuEPO组XIAPmRNA表达水平虽然增多,但无明显统计学差异(P>0.05)。Western blot结果:XIAP蛋白在各组大鼠海马表达水平以XIAP/β-actin表示,结果显示:与Control组相比,PTZ组、rHuEPO组、LY294002组、DMSO组XIAP蛋白的表达水平明显增多(P<0.05);与PTZ组比较,rHuEPO组、LY294002组、DMSO组XIAP蛋白的表达水平明显增多(P<0.05);与rHuEPO组、DMSO组相比,LY294002组XIAP蛋白的表达水平明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05);rHuEPO组XIAP蛋白的表达水平虽多于DMSO组,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论:PTZ点燃的癫痫持续状态后大鼠海马组织XIAP蛋白及其mRNA水平均升高,提示线粒体凋亡途经相关调控因子XIAP可能参与了癫痫持续状态后海马神经元凋亡的损伤机制。rHuEPO后处理可以降低癫痫持续状态大鼠海马组织XIAP蛋白及其mRNA表达水平,进而改善癫痫持续状态后大鼠海马神经元的凋亡损伤,其抗凋亡的机制可能通过PI3K/Akt信号传导途径对线粒体凋亡途经相关调控因子XIAP进行调控,进而介导线粒体凋亡途经,发挥抗凋亡神经保护作用。
潘金玉[6]2018年在《黑色素瘤缺如因子2对动脉粥样硬化发生及其机制的实验研究》文中认为研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一个多因素导致的病变,能够导致血管损伤和心血管疾病,是临床上导致急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)的主要病因,是世界范围内主要的死亡原因。传统观念认为,动脉粥样硬化是一个复杂的炎症过程,是炎症导致的动脉粥样硬化的发生发展。然而,医学界越来越多的证据表明,动脉粥样硬化的最初病变不仅仅是内皮下低密度脂蛋白的被动沉浸,不仅仅是一个炎症过程,而是一个更复杂的过程,它还涉及细胞和体液中的天然免疫和适应性免疫。心血管事件的增加和AS斑块的形成与发展密切相关。因此,探讨AS斑块发生的机制,寻找促进AS斑块形成的可能因子,从而抑制这种基因,能够预防AS斑块形成。黑色素瘤缺如因子2(absent in melanoma 2,AIM2)是2009年发现的调控细胞死亡与炎症的炎症小体,属于扰素诱导的HIN-200家族蛋白;AIM2的命名源自此蛋白在黑色素瘤中表达缺失。作为炎症小体的成员,AIM2是动物体内普遍存在的参与生理和病理过程的细胞因子之一,调节细胞的炎症、迁移、增殖和死亡。AIM2是细胞质中的双链DNA(dsDNA)感受器,在机体抵抗细菌和病毒(如弗朗西斯菌和牛痘病毒)的免疫过程中起到十分重要的作用。既往研究发现,当感染弗朗西斯菌后,免疫细胞能够激活转录因子干扰素调节因子1(interferon regulator factor,IRF1),而IRF1能够进一步产生干扰素诱导的GTP激酶鸟苷酸结合蛋白。鸟苷酸结合蛋白能够在细胞质中杀死细菌,从而导致细菌释放DNA并与AIM2结合。识别dsDNA后,AIM2能够招募受体蛋白apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD(ASC)从而形成炎症复合体,炎症小体能够活化caspasel蛋白,分裂为有活性的Caspasel p10和Caspase 1 p20。Caspasel是一种半胱氨酸蛋白酶,而活化的Caspasel能够诱导细胞死亡以及细胞质中IL-1β、IL-18的释放和激活。从结构分析,AIM2的HIN200结构域能够识别dsDNA,而prin结构域能够招募ASC。在牛皮癣患者中发现,DNA在角化细胞的累积能够激活AIM2炎症小体,从而导致IL-1β释放,因此,AIM2能够识别细胞释放的损伤相关分子,并且AIM2的活化能够协助清除病原体从而维持机体自身免疫的平衡和稳态。近期的研究发现,AIM2不仅在固有免疫中发挥着重要作用,还能接受多种PAMPs和DAMPS的刺激,在很多非免疫系统同样发挥着重要作用。另有研究发现AIM2在系统性红斑狼疮、心肌炎、牛皮癣、肝脏缺血再灌注损伤等多种疾病中表达升高。最新研究发现,取人的颈动脉斑块做组化后,可以看到AIM2表达增加,体外使用TNF-α刺激人颈动脉血管平滑肌细胞后,可使AIM2表达显著升高,并可诱导细胞中炎症小体的激活,进而增加caspasel的表达。基于上述研究,我们推测AIM2可能影响了 AS形成的炎症反应,进而影响冠状动脉粥样硬化的发生发展。研究目的(1)在动脉粥样硬化小鼠模型中,探究AIM2对动脉粥样硬化形成的影响;(2)在动脉粥样硬化小鼠模型中,探究AIM2对平滑肌细胞迁移和平滑肌焦亡的作用;(3)在动脉粥样硬化小鼠模型中,研究AIM2对炎性介质的作用。研究方法动脉粥样硬化斑块形成模型将 100 只 8 周龄雄性 Apolipoprotein E-Deficient Mice(ApoE-/-)小鼠随机分为5组(每组20只):对照组(control组)、高脂饮食组(HFD组)、高脂饮食+AIM2过表达慢病毒组(1vAIM2组)、高脂饮食+AIM2干扰慢病毒组(shAIM2组)及高脂饮食+空载体慢病毒组(NC组)。使用不添加胆固醇的基础饮食喂养Control组。其余4组使用含有0.25%胆固醇和16脂肪的高脂饮食喂养。适应性喂养一周后,尾静脉注射慢病毒,慢病毒的浓度为2x107TU/只。继续高脂喂养12周。慢病毒干预:ApoE-/-小鼠适应性喂养一周后,分别给1vAIM2组,shAIM2组及NC组AIM2过表达慢病毒组(1vAIM2)、AIM2-miRNA慢病毒组(shAIM2)及慢病毒空载体组(NC)干预8周。病毒干预2周后,随机抽取1vAIM2,shAIM2,NC组小鼠实施安乐死,立即行冰冻切片检测病毒转染效率。病毒干预12周后,所有小鼠实施安乐死,取材。血清学检测:待实验结束时,小鼠禁食12小时后,从心尖部抽取血液,分别检测血清中低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、TG(triglyceride,甘油三酯)及TC(total cholesterol,总胆固醇)的含量。组织学检测:ApoE-/-小鼠安乐死后,立即取腹主动脉和主动脉根部。腹主动脉行大体油红O染色,主动脉根部行冰冻切片后,行主动脉根部的H&E(hematoxylin-eosinstaining,苏木素-伊红)染色和油红O染色后留取图像。兔疫组织化学利用免疫组织化学的方法,观察IL-1β及AIM2在主动脉根部中的分布。实时定量RT-PCR将冻存的腹主动脉取出后,利用实时定量RT-PCR的方法检测小鼠主动脉中AIM2 mRNA表达水平。Western blot将冻存的腹主动脉取出后,提取总蛋白,利用Western blot方法检测血管中AIM2、ASC、pro-caspase-1、caspase-l 及 GSDMD-N、MMP2、ICAM-1 的表达。TUNEL检测利用TUNEL检测斑块组织中,斑块中出现DNA损伤的情况。免疫荧光利用免疫荧光技术观察AIM2,α-SMA在斑块中的分布。数据分析利用SPSS v20.0处理数据,连续变量以均数±标准误来表示。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey-Kramer post hoc检验比较多组间的连续变量。利用独立样本t检验比较两组间的连续变量。当p<0.05时认为有统计学意义。研究结果小鼠动脉硬化斑块在髙脂饮食 12周可诱导出现大体油红O染色、油红O染色和HE染色显示,高脂喂养后,ApoE-/-小鼠出现斑块形成(p<0.05)。AIM2炎症小体及GSDMD-N在动脉粥样硬化斑块中表达增高与对照组相比,高脂喂养后的ApoE-/-小鼠出现AIM2、ASC、caspase-1及GSDMD-N表达升高(p<0.05)。此外,AIM2 mRNA水平也同样升高(p<0.01)。与 control 组相比,AIM2、ASC、pro-caspase-1、活化的 caspase-1(caspase-1 p10)及GSDMD-N在AS组中表达升高(p<0.05)。AIM2基因过表达沉默不能改善高脂弓引起的代谢异常在高脂喂养组,LDL-C,TC,TG的水平显著高于对照组(p<0.05)。但是AIM2过表达和干扰干预后,血脂水平没有显著改变。基因干预能有效抑制斑块AIM2表达而AIM2过表达慢病毒能有效导致AIM2表达增加与NC干预组相比,shAIM2慢病毒干预后,斑块组织中AIM2的mRNA及蛋白水平明显降低(p<0.05)。此外,血管中ASC,caspase-1 p10和GSDMD-N的表达也明显降低(p<0.05)。NC干预组相比,1vAIM2慢病毒干预后,斑块组织中AIM2的mRNA及蛋白水平明显增加(p<0.05)。同时血管中ASC,caspase-1 p10和GSDMD-N的表达也明显升高(p<0.05)。而免疫组化结果显示,在动脉粥样硬化斑块中,AIM2和IL-1β的表达受到显著影响(p<0.05)。AIM2表达水平的改变能够显著影响动脉粥样硬化斑块的形成与control组比较,HFD组的大体斑块体积,主动脉根部斑块体积均升高(p<0.05),平滑肌和巨噬细胞的含量也显著增加(p<0.05)。将AIM2基因过表达后,斑块体积、平滑肌和巨噬细胞含量显著增加(p<0.05),而将AIM2基因沉默后,斑块体积、平滑肌和巨噬细胞含量显著减少(p<0.05)AIM2表达水平的改变能够显著影响血管平滑肌细胞的死亡与control组相比,高脂喂养能够显著导致血管平滑肌细胞的死亡(p<0.05)。将AIM2基因过表达后,血管平滑肌细胞死亡数目显著增加(p<0.05),而将AIM2基因沉默后,血管平滑肌细胞死亡数目显著减少(p<0.05)AIM2表达水平的改变能够显著影响ICAM-1和MMP2的表达与control组相比,高脂喂养能够显著增加ICAM-1、MMP-2的表达(p<0.05)。AIM2表达增加后,ICMA-1、MMP-2的表达显著增加(p<0.05),而AIM2沉默后,ICAM-1和MMP-2的表达显著减少(p<0.05)。研究结论(1)在实验性动脉粥样硬化斑块形中AIM2表达增加;;(2)AIM2促进了动脉粥样硬化斑块的发生;(3)AIM2增加了血管平滑肌细胞和巨噬细胞的聚集;(4)AIM2促进了血管平滑肌细胞死亡;(5)AIM2 促进了 MMP-2 和 ICAM-1 的表达。动脉粥样硬化过程中的细胞死亡和炎症发生已被广泛研究。很多研究小组已经证明了动脉粥样硬化过程中细胞死亡和炎症之间的联系,其他研究小组则假定凋亡和胞吐受损(凋亡细胞的有效清除)是导致病变细胞炎症和死亡的主要原因。然而,最近有研究发现,人动脉硬化斑块中的细胞死亡是经历了细胞溶解,而不是细胞凋亡。在病变组织中,凋亡的信号前体caspase-3很少表达。值得注意的是,斑块破裂与caspase-1的强免疫反应有关,而caspase-1在动物和人类动脉粥样硬化斑块中大量表达,而且与动脉粥样硬化斑块的不稳定性密切相关[19,22-24]。焦亡仅依赖于caspasel的活化。最近的研究表明,细胞焦亡过程中可以通过端脱氧核苷酸转移酶(Tdt)介导的dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)染色来进行检测,而这一技术在传统意义上是细胞凋亡的标志。因此,越来越多的证据表明细胞焦亡,一种caspasel依赖的细胞死亡,在动脉粥样硬化斑块发生和不稳定性中发挥着重要作用。AIM2是细胞质中的双链DNA(dsDNA)感受器,在机体抵抗细菌和病毒(如弗朗西斯菌和牛痘病毒)的免疫过程中起到十分重要的作用[29-32]。既往研宂发现,当感染弗朗西斯菌后,免疫细胞能够激活转录因子IRF1,而IRF1能够进一步产生干扰素诱导的GTP激酶鸟苷酸结合蛋白[33]。鸟苷酸结合蛋白能够在细胞质中杀死细菌,从而导致细菌释放DNA并与AIM2结合[34,35]。识别dsDNA后,AIM2能够招募apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD(受体蛋白ASC)从而形成炎症复合体,炎症小体能够激活caspasel并使之分裂为有活性的Caspasel plO和p20。Caspasel是一种半胱氨酸蛋白酶,活化的CaspaselplO和p20能够诱导细胞死亡以及细胞质中丨L-lp、IL-18的释放和激活。从结构分析,AIM2的HIN200结构域能够识别dsDNA,而prin结构域能够招募ASC。在牛皮癣患者中发现,DNA在角化细胞的累积能够激活AIM2炎症小体,从而导致IL-1P释放,因此,AIM2能够识别细胞释放的损伤相关分子,并且AIM2的活化能够协助清除病原体从而维持机体自身免疫的平衡和稳。血管平滑肌细胞(VSMC)早期的积累导致内膜增厚早于泡沫细胞形成,可能由于活化的内皮细胞产生的血小板源性生长因子(PDGF)所致[38]。事实上,VSMC导致动脉粥样硬化的多级反应以往并未得到正确评价。其他危险因素能够导致内皮细胞进一步激活。一旦内皮细胞活化,早期的过程本质上可以描述成早期的免疫反应。活化的内皮细胞能够产生粘附分子,比如E-选择素,P-选择素,和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和趋化因子MCP-1。单核细胞和可能的中性粒细胞这类炎性细胞能够早期宽松集合内皮细胞,并进入到内皮下空间。单核细胞转变为巨噬细胞,并能够和病原体相关分子模型(PAMPs),损伤相关分子模型(DAMP)和包括肿瘤坏死因子(TNF-a),白介素(IL)-1和IL-6在内的多种细胞因子相互反应并进一步活化。T-辅助l(Thl)细胞分泌干扰素-y(IFN-?y)和其他能够促进内源性免疫反应的细胞因子。同时,释放从粘附血小板和活化内皮细胞来源的PDGF(主要是人体A和B亚型的二聚体)。通常,PDGF被认为能够和己分化、能收缩的VSMC反应导致从可收缩向综合表型转换,并向内膜转移[39]。最新研究表明,可能是位于动脉区域的多种血管干细胞一旦和血小板接触能够转换并呈现出VSMC表型[39]。出人意料的,在动物模型中研宂的包括VSMC-样细胞核各种免疫细胞在内的动脉粥样硬化进展已在人斑块中获得证实[40],展现出基因的相似性。但是,ox-LDL是否能够导致血管平滑肌细胞焦亡,而AIM2是否介导了血管平滑肌细胞的焦亡,国内外尚未见报道。研究目的:1、Ox-LDL能否导致血管平滑肌细胞焦亡;2、Ox-LDL促进AIM2表达的可能机制;3、AIM2能否介导ox-LDL导致的血管平滑肌细胞焦亡。研究方法基因沉默技术根据siRNA原则,经公司设计3条干扰序列,转入细胞后观察对AIM2的干扰效果,选出干扰效果最强的干扰序列,最终构建pLenti6.3—EmGFP-AIM2-miRNA慢病毒载体,构建出AIM2干扰慢病毒。细胞培养血管平滑肌细胞(VSMC)在高糖的含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。在37°C恒温恒湿孵育箱中培养。慢病毒干预血管平滑肌细胞在6孔板种板后,分别给lvAIM2组,shAIM2组及NC组AIM2过表达慢病毒,AIM2-miRNA慢病毒及慢病毒空载体(NC)干预72小时。Western blot提取细胞蛋白,利用Western blot方法检测血管中AIM2、ASC、pro-caspase-1、caspase-1及GSDMD-N的表达。TUNEL检测利用TUNEL检测血管平滑肌细胞中出现DNA损伤的情况。免疫荧光利用免疫荧光技术观察AIM2,Caspase 1在斑块中的分布。数据分析利用SPSS 20.0处理数据,连续变量以均数土标准差来表示。利用单因素方差分析比较多组间连续变量,利用独立样本t检验比较两组间连续变量。以p<0.05时认为有统计学差异研究结果氧化低密度脂蛋白能够导致AIM2炎症小体及GSDMD-N表达升高与对照组相比,ox-LDL刺激后的血管平滑肌细胞AIM2、ASC、caspase-1及GSDMD-N表达升尚(p<0.05)。与control组相比,AIM2、ASC、pro-caspase-1、活化的caspase-1(caspase-l plO)及GSDMD-N表达升高(p<0.05)。Ox-LDL能够导致血管平滑肌细胞发生焦亡与对照组相比,ox-LDL刺激后的血管平滑肌细胞TUNEL和EthD-III结果升高。(p<0.05)Ox-LDL能够通过NF-kB信号通路影响AIM2的表达当不同浓度刺激VSMCs后,U B a磷酸化和NF-k B(p65)细胞核表达增加(p<0.05)。当使用NF-k B的抑制剂BAY11-7082和SC-514后,AIM2的表达被抑制(p<0.05)。基因干预能有效抑制血管平滑肌细胞A1M2表达而AIM2过表达慢病毒能有效导致AIM2表达增加与NC干预组相比,AIM2-miRNA干预后,血管平滑肌细胞AIM2的表达也明显降低(p<0.05)。而W-AIM2干预后,血管平滑肌细胞中的AIM2显著升高(p<0.05)。A1M2能够影响炎症小体和GSDMD-N的表达与NC干预组相比,AIM2-miRNA干预后,血管平滑肌细胞ASC、procaspasel,GSDMD-N的表达也明显降低(p<0.05)。而lv-AIM2干预后,血管平滑肌细胞种的ASC、pro-caspasel,GSDMD-N显著升高(p<0.05)。AIM2表达水平的改变能够显著影响平滑肌细胞的死亡与control组相比,氧化低密度能够显著导致血管平滑肌细胞的死亡(p<0.05)。将AIM2基因过表达后,血管平滑肌细胞死亡数目显著增加(p<0.05),而将AIM2基因沉默后,血管平滑肌细胞死亡数目显著减少(p<0.05)研究结论(1)ox-LDL能够导致血管平滑肌细胞焦亡;(2)ox-LDL能够通过NF-k B导致血管平滑肌细胞中AIM2表达升高;(3)AIM2介导了氧化低密度导致的血管平滑肌焦亡;动脉粥样硬化(AS)能够导致患者面临致命性和非致命性的冠状动脉血管(cardiovascular,CV)事件的发生。AS除了能增加脑血管意外的风险外,也能够导致CAD患者心肌梗死(myocardial infarction,MI)和冠状动脉死亡事件增力口。在对包含11391名患者在内的17个研究进行分析后发现,超过50%的患者有无症状性颈动脉狭窄,63%的后期死亡事件是心脏事件,平均心脏性死亡风险每年增加2.9%。许多研究表明,即使在常规危险因素调整后,有症状或无症状的患者的死亡率、心血管病死亡率和发病率也有增加的风险。踝肱指数(anklebrachial index,ABI)彡0.9能够导致冠状动脉事件、CV的十年风险和全因死亡率增加2倍以上。5年后,20%的患者将患有间歇性跛行,而心梗或卒中的死亡率将达到10-15%。所有这些研究结果均表明探宄动脉粥样硬化的发生,从而寻找有效的防治靶点,对预防心血管疾病十分重要。既往研究表明,在晚期动脉粥样硬化斑块中,血管平滑肌细胞(VSMC)的存在是有益的和保护性的,因为它在纤维帽的形成和维持中起着关键作用,富含VSMC的纤维斑块能够保护晚期斑块免受斑块破裂和血栓形成。与此相反的,动脉硬化斑块的形成和VSMC的存在密切相关。动脉粥样硬化斑块形成于动脉血管内许多特殊的部位,这些部位被称为“动脉粥样硬化易感区”,这些部位在动物和人的动脉粥样硬化是共有的。当内皮细胞暴露于这些血流动力学改变时,其功能发生紊乱,并以内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达受损为特征。一氧化氮(NO)生物利用度的降低促进了多种促动脉粥样硬化的作用,包括血小板粘附和聚集增加,单核细胞粘附/浸润,聚集的脂蛋白的氧化修饰和血管收缩。此外,NO水平的降低可导致基质金属蛋白酶(MMPs)的表达增加,并发挥对VSMCs促进迁移的作用。在小鼠模型中,单核/巨噬细胞聚集是动脉粥样硬化形成的第一个可见征象,而在人类中,新生动脉粥样硬化形成的先发征象是适应性内膜增厚。这是一个正常的发生过程,其特征是嵌入在富含蛋白质的细胞外基质中的VSMCs在斑块中积聚,这通常是在血流动力学改变的部位。动脉粥样硬化病变形成的早期形态,称为病变内膜增厚,与VSMCs及其细胞外基质的形态学和生化改变有关。这种改变包括脂质蛋白沉积后的保留和修饰,VSMC提取修饰的脂蛋白,平滑肌凋亡,巨噬细胞浸润,微钙化的存在以及脂质核心的形成。虽然确切的机制尚未清楚,但这些初始的病理过程能够更好地解释脂质/坏死核是如何形成和扩展到晚期不稳定斑块的。我们还是可以从动脉粥硬化模型中获得一定的认知,以阐明VSMC对斑块进展的贡献。因此研究血管平滑肌细胞的病理过程,成为现在研究的热点。血管平滑肌的迁移有助于动脉粥样硬化早期病变的发展,但是同样重要的是通过维持一个保护性的纤维帽覆盖在高级病变的血栓脂质核上,从而维持斑块的稳定性。因此了解动脉粥样硬化不同阶段血管平滑肌细胞生长的关键调控因子,有助于未来调节疾病进程的策略。基质金属蛋白(MMPs)与血管平滑肌细胞的生长和动脉粥样硬化病变过程有着不可忽视的联系。特别是,MMP-2己经被证明起着重要作用,它可以促进早期病变的发展,同时防止晚期斑块的形成。MMPs调节VSMCs的行为一种公认的机制是调节细胞-细胞和细胞-基质的相互作用,从而影响血管平滑肌细胞的迁移。AIM2是细胞质中的双链DNA(dsDNA)感受器,在机体抵抗细菌和病毒(如弗朗西斯菌和牛痘病毒)的免疫过程中起到十分重要的作用。既往研究发现,当感染弗朗西斯菌后,免疫细胞能够激活转录因子IRF1,而IRF1能够进一步产生干扰素诱导的GTP激酶鸟苷酸结合蛋白。鸟苷酸结合蛋白能够在细胞质中杀死细菌,从而导致细菌释放DNA并与AIM2结合。识别dsDNA后,AIM2能够招募受体蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)从而形成炎症复合体并激活caspasel。Caspasel是一种半胱氨酸蛋白酶,能够诱导细胞死亡以及细胞质中IL-lp、IL-18的释放和激活。从结构分析,AIM2的HIN200结构域能够识别dsDNA,而prin结构域能够招募ASC。在牛皮癣患者中发现,DNA在角化细胞的累积能够激活AIM2炎症小体,从而导致IL-lp释放,因此:AIM2能够识别细胞释放的损伤相关分子,并且AIM2的活化能够协助清除病原体从而维持机体自身免疫的平衡和稳态。近期的研究热点集中在AIM2的炎症小体外作用,而AIM2对平滑肌的炎症小体外作用尚未见报道但是,而AIM2是否介导了血管平滑肌细胞的迁移,国内外尚未见报道。研究目的:1、ox-LDL导致AIM2升高的机制;2、AIM2能否介导ox-LDL导致的MMP-2水平的升高,进而促进平滑肌迁移;3、AIM2炎症小体外作用的可能机制.研究方法细胞培养血管平滑肌细胞(VSMC)在高糖的含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。在37°C恒温恒湿孵育箱中培养。慢病毒干预血管平滑肌细胞在6孔板种板后,分别给lvAIM2组,shAIM2组及NC组AIM2过表达慢病毒,AIM2-miRNA慢病毒(AIM2_miRNA)及慢病毒空载体(vehicle)干预72小时。Western blot提取细胞蛋白,利用Western blot方法检测血管中AIM2、MMP2、TGF、SMAD2,p-SMAD2,SMAD3,p-SMAD3的表达。Transwell检测利用Transwell检测血管平滑肌细胞迁移情况。免疫荧光利用免疫荧光技术观察AIM2在血管平滑肌细胞中的表达。数据分析利用SPSS V20.0处理数据,连续变量以均数土标准误来表示。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey-Kramer post hoc检验比较多组间的连续变量。利用独立样本t检验比较两组间的连续变量。当p<0.05时认为有统计学意义研究结果氧化低密度能够导致AIM2表达升高与对照组相比,ox-LDL刺激后的血管平滑肌细胞AIM2表达升高(p<0.05)。ox-LDL导致平滑肌中AM2的升高呈时间依赖性(p<0.05)。氧化低密度能够通过ROS影_A1M2表达与对照组相比,ox-LDL刺激ROS升高,而使用NAC抑制后,ROS明显降低(p<0.05)。而使用NAC干预后,AIM2的表达明显被抑制(p<0.05)。基因干预能有效抑制血管平滑肌细胞AIM2表达而AIM2过表达慢病毒能有效导致AIM2表达增加与NC干预组相比,AIM2-miRNA干预后,血管平滑肌细胞AIM2的表达也明显降低(p<0.05)。而W-AIM2干预后,血管平滑肌细胞种的AIM2的表达明显升高(p<0.05)。AIM2表达水平的改变能够影响MMP-2的表达与NC干预组相比,AIM2-miRNA干预后,血管平滑肌细胞MMP-2的表达也明显降低(p<0.05)。而丨V-AIM2干预后,血管平滑肌细胞种的MMP-2的表达明显升高(p<0.05)。AIM2表达水平的改变能够显著影响TGF-/SMAD2/3信号通路将AIM2基因过表达后,血管平滑肌细胞TGF-员的表达水平,SMAD2和SMAD3的磷酸化水平显著增加(p<0.05),而将AIM2基因沉默后,TGF-0的表达水平,SMAD2和SMAD3的磷酸化水平显著减少(p<0.05)A1M2表达水平的改变能够显著影响血管平滑肌细胞的迀移将AIM2基因过表达后,血管平滑肌细胞迁移数目显著增加(p<0.05),而将AIM2基因沉默后,血管平滑肌细胞迁移数目显著减少(p<0.05)研究结论(1)ox-LDL能够通过ROS途径导致血管平滑肌细胞AIM2表达升高;(2)AIM2能够促进MMP-2的表达,进而促进血管平滑肌细胞迁移;(3)AIM2可以促进TGF-3/SMAD2,3信号通路的活化;
谢惠芳[7]2007年在《JAK/STAT信号转导通路在局灶性脑缺血再灌注损伤中作用的研究》文中进行了进一步梳理研究背景缺血性脑血管病是一种严重影响人类健康的常见病，具有发病率、死亡率、致残率、复发率高等特点。流行病学调查显示，我国脑血管病的发病率为(109.7～217)／10万，患病率为(719～745.6)／10万，死亡率为(116～141.8)／10万。存活者中50～70％病人遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来沉重的负担。脑缺血特别是缺血再灌注损伤的病理生理过程极为复杂，其发病机制涉及脑组织能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸(EAA)的细胞毒性、神经细胞内钙离子(Ca~(2+))超载、酸中毒及单胺类神经递质的毒性作用、氧自由基的过度形成及“瀑布式”自由基连锁反应、炎性细胞因子等多个环节。近年来实验研究已证实，脑缺血再灌注损伤后缺血中心区的神经元死亡以坏死为主，而缺血周边半暗带区的神经元死亡与凋亡有关，如何挽救缺血半暗带区受损的神经细胞是一个值得关注的重要课题。因此研究引起细胞凋亡的信号转导机制可能为脑缺血提供新的治疗前景。脑缺血时多种信号分子和转录因子参与调节细胞凋亡的过程，如蛋白激酶C(protein kinase,PKC)链、细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated mitogen-activated protein kinase,ERK)、c-jun、c-jun氨基末端蛋白激酶(c-jun NH2 terminal kinase,JNK)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3 kinase,P13-K)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine／threonine kinase,Akt)、核转录因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)、信号转导和转录活化子(signal transducers and activator of transcription，STAT)等，它们在脑缺血神经损伤和修复过程中均起着重要的作用。但脑缺血后神经细胞凋亡的信号转导机制仍未完全阐明。JAK／STAT是近年来新发现的一条细胞内信号转导途径。分别由JAKs蛋白家族(JAK1、JAK2、JAK3、TYK2)和STATs蛋白家族(STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6)组成。细胞外细胞因子识别并与细胞膜上的特异受体结合后诱导受体聚化构成二聚体或三聚体，在胞浆内形成高亲和性的JAKs结合位点，JAKs与受体胞浆区域的JAKs结合位点结合后发生自身或与受体交叉酪氨酸磷酸化而活化，活化的JAKs进一步募集细胞浆内相应的信号传导和STATs，并使其磷酸化而活化，活化的STATs蛋白可相互形成同源或异源二聚体并移向核内，与目的基因的启动子结合，直接激活目的基因表达。大量研究表明许多细胞因子(IFN、IL-2、IL-4、IL-6、CNTF等)和生长因子(EGF、PDGF、CSF等)及氧化应激都利用JAK／STAT信号转导途径诱导细胞的增殖、分化或凋亡。STAT3作为信号转导及转录因子家族的重要成员之一，广泛表达于各类不同的细胞和组织，参与细胞生长、恶性转化、凋亡等生理功能的调节。人类的许多肿瘤易导致STAT3的异常激活，诱导Bcl-2的高表达，有利于瘤细胞存活而加重病情。心肌缺血导致的STAT3异常激活，能够保护心肌抵抗缺血性损伤。但脑缺血导致的STAT3异常激活确切作用尚未十分清楚。脑缺血再灌注损伤时氧自由基的过度形成及释放大量的炎性细胞因子，如白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)等，它们在脑缺血再灌注神经细胞损伤中起着重要的作用。有研究认为STAT1、STAT3的过量活化有促进神经细胞凋亡作用，它能降低Bcl-2、Bcl-x的表达，而Bcl-2、Bcl-x是脑缺血再灌注损伤中重要的抗凋亡基因。但也有研究认为STAT3活化可能具有神经保护作用，从而阻止细胞凋亡。因此进一步研究JAK／STAT信号转导通路与神经细胞凋亡间的关系，并研制以它为作用靶点的神经保护剂对脑缺血治疗将具有深远的意义。因此通过建立稳定的大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤动物模型。观察脑缺血再灌注损伤不同时间点JAK2、STAT3活化及细胞凋亡情况。并利用JAK2特异性抑制剂及抗氧化剂阻断JAK2／STAT3异常激活，观察其对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损、脑梗死面积、促凋亡基因及细胞凋亡等影响。探讨JAK2、STAT3异常激活在神经细胞凋亡中的作用及引起神经细胞死亡的可能途径。研究目的1．探索脑缺血再灌注损伤后JAK2、STAT3激活及变化规律。2．探索脑缺血再灌注损伤后JAK2／STAT3活化是否通过介导Caspase-3引起神经细胞死亡。3．利用JAK2特异性抑制剂及抗氧化剂阻断JAK2／STAT3异常激活，观察其对脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损、脑梗死面积、促凋亡基因及细胞凋亡等影响。探讨JAK2、STAT3异常激活在脑缺血神经细胞凋亡间中的作用。本实验分三部分探讨JAK／STAT信号转导通路在局灶性脑缺血再灌注损伤中作用的研究第一部分大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后磷酸化JAK2／STAT3蛋白表达及细胞凋亡的研究采用大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，观察磷酸化JAK2、磷酸化STAT3蛋白在局灶性脑缺血再灌注损伤后的表达及细胞凋亡的变化规律。方法1．健康成年雄性SD大鼠，体质量250-300g。动物随机分为假手术对照组、脑缺血2h再灌注3h、6h、12h、24h、48h、72h、168h组，每组10只动物。2．采用改良大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。3．各组按照不同时间点(再灌注3h、6h、12h、24h、48h、72h、168h)麻醉，经左心室-升主动脉插管，灌注生理盐水、4％多聚甲醛。断头取脑。脑组织行冰冻切片，分别用H.E染色、免疫组织化学、TUNEL法检测磷酸化JAK2、磷酸化STAT3免疫阳性细胞及凋亡细胞，计数各组磷酸化JAK2、磷酸化STAT3免疫阳性细胞及凋亡细胞。4．采用Western blotting检测缺血侧脑组织磷酸化JAK2、磷酸化STAT3蛋白表达情况。结果1．假手术大鼠、脑缺血再灌注损伤3h组大鼠脑组织未见P-JAK2、P-STAT3蛋白阳性表达信号，脑缺血再灌注损伤6h组大鼠缺血侧脑组织可见少量P-JAK2、P-STAT3免疫阳性细胞，12h阳性表达开始增强，24h达高峰，以缺血半暗带区最明显，随再灌注时间延长，以后逐渐下降，至168h仍有表达。2．脑缺血再灌注损伤后脑组织P-JAK2、P-STAT3 Western blotting检测结果在分子量为131KD、92KD的位置上可以看到有特异的发光带，假手术组未检测到P-JAK2、P-STAT3蛋白表达带，脑缺血再灌注损伤3h组可见少量表达，12h表达水平开始增强，24h达高峰，以后逐渐下降，168h仍有少量表达。3．假手术组、手术组大鼠的右侧大脑半球未见明显TUNEL阳性细胞，缺血再灌注3h偶见极少量的凋亡细胞，主要位于缺血中心区。缺血再灌注6h即有明显特征凋亡细胞。随着缺血再灌注时间延长，缺血灶周边区凋亡细胞逐渐增加，24～48h阳性细胞数达高峰，以后逐渐下降，TUNEL阳性细胞胞核染成棕褐色。结论脑缺血再灌注损伤能激活JAK2／STAT3信号转导通路。脑缺血再灌注损伤后磷酸化JAK2、磷酸化STAT3蛋白表达明显增强，以缺血半暗带区表达最明显，再灌注24h达高峰，之后开始下降。缺血再灌注损伤后凋亡细胞也显著增多，再灌注24h达高峰，凋亡细胞的变化与磷酸化JAK2、磷酸化STAT3蛋白表达变化一致。脑缺血再灌注损伤后引发JAK2、STAT3的活化及超量表达可能与神经细胞生存与凋亡有关，JAK2／STAT3信号通路可能参与了脑缺血再灌注损伤与修复的病理生理过程。第二部分信号转导阻滞剂AG490对脑缺血再灌注损伤后脑组织JAK2／STAT3信号转导及细胞凋亡的影响利用JAK2蛋白激酶的特异性磷酸化抑制剂AG490阻断炎性介质的信号转导，抑制JAK2／STAT3的激活，下调缺血后半暗带区P-JAK2、P-STAT3的表达，观察其对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后神经行为学、脑梗死体积、神经细胞凋亡及凋亡调控基因caspase-3蛋白表达的影响，旨在进一步探讨JAK2／STAT3信号转导在局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制。方法1．健康成年雄性SD大鼠，体质量250-300g。动物随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、生理盐水治疗组、AG490治疗组。治疗组于脑缺血开始时及再灌注后12h分别腹腔注射AG490 1mg·kg~(-1)或等量生理盐水。每组16只动物，每组6只用于TTC染色，6只用于免疫组化，4只用于Western blotting。2．采用改良大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。3．按经典的Zea Longa法评定神经功能缺损，TTC染色检测脑梗死体积。4．取大鼠脑组织切片，经免疫组织化学、TUNEL法检测脑组织P-JAK2、P-STAT3、caspase-3的免疫阳性细胞及凋亡细胞。5．采用Western blotting检测缺血侧脑组织磷酸化JAK2、磷酸化STAT3、caspase-3蛋白表达情况。结果1．AG490治疗组神经功能评分较低，脑梗死体积缩小，与模型组及生理盐水治疗对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)。2．AG490治疗组能明显减少缺血再灌注损24小时缺血侧脑组织P-JAK2、P-STAT3及caspase-3免疫阳性细胞；缺血侧脑组织P-JAK2、P-STAT3及caspase-3蛋白表达显著减少；缺血半暗带区凋亡细胞数也显著减少，与模型组及生理盐水治疗对照组比较均有显著性差异(P＜0.001)。结论脑缺血再灌注损伤早期给予JAK2蛋白激酶的磷酸化抑制剂AG490可以缩小脑梗死面积，改善神经功能缺损。AG490能有效阻断JAK2／STAT3信号转导通路的异常激活，部分阻断炎性细胞因子的细胞内信号转导，进而影响其下游靶基因caspase-3，抑制缺血半暗带区脑组织caspase-3蛋白表达上调，减少细胞凋亡的发生，减轻脑损伤。阻断缺血后JAK2／STAT3异常激活具有神经保护作用。JAK2／STAT3信号通路通过caspase-3激活介导脑缺血再灌注损伤的神经细胞凋亡。第三部分抗氧化剂依达拉奉对脑缺血再灌注损伤后脑组织JAK2／STAT3信号转导及神经细胞损伤的影响采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，观察抗氧化剂依达拉奉是否能通过抑制与炎性细胞因子及氧化应激有密切关系的JAK2／STAT3信号转导通路而起到神经保护作用。方法1．健康成年雄性SD大鼠，体质量250-300g。动物随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、生理盐水治疗组、依达拉奉治疗组。治疗组于脑缺血开始时及再灌注后12h分别腹腔注射依达拉奉3mg·kg~(-1)或等量生理盐水。每组16只动物，每组6只用于TTC染色，6只用于免疫组化，4只用于Western blotting。2．采用改良大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。3．按经典的Zea Longa法评定神经功能缺损，TTC染色检测脑梗死体积。4．取大鼠脑组织切片，经免疫组织化学、TUNEL法检测脑组织P-JAK2、P-STAT3、caspase-3的免疫阳性细胞及凋亡细胞。5，采用Western blotting检测缺血侧脑组织磷酸化JAK2、磷酸化STAT3、caspase-3蛋白表达情况。结果1．依达拉奉治疗组能明显减轻脑缺血再灌注损伤后神经功能缺损，缩小脑梗死体积，与模型组及生理盐水治疗对照组比较均有显著性差异(P＜0.01)。2．缺血再灌注损24小时，依达拉奉治疗组缺血侧脑组织P-JAK2、P-STAT3及caspase-3免疫阳性细胞较模型组及生理盐水治疗组显著减少；P-JAK2、P-STAT3及caspase-3蛋白表达也显著减少；缺血半暗带区凋亡细胞数也显著减少，与模型组及生理盐水治疗对照组比较均有显著性差异(P＜0.001)。结论抗氧化剂依达拉奉尚能通过抑制与氧化应激有密切关系的JAK2／STAT3信号转导通路，下调caspase-3在缺血半暗带区的表达，减少凋亡细胞的数量，明显缩小大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑梗死体积，减轻神经功能缺损，促进神经功能恢复。具有良好的神经保护作用。
于舒[8]2008年在《红景天苷对低糖低血清损伤PC12细胞的保护作用》文中认为目的观察红景天苷(Salidroside)对低糖低血清损伤PC12细胞的保护作用。方法1、体外培养PC12细胞,采用低糖低血清培养基制备PC12细胞的低糖低血清损伤模型。通过MTT检测,观察低糖低血清损伤后不同时间(12h、24h、36h、48h)PC12细胞活力的变化。2、体外培养PC12细胞,给予不同浓度红景天苷(80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml)预保护24h,经低糖低血清损伤后24h,通过形态学分析和MTT检测,观察红景天苷对低糖低血清损伤PC12细胞形态和活力的影响。3、通过Hoechst33342染色和流式细胞仪分析,观察红景天苷对低糖低血清损伤PC12细胞凋亡的影响。4、通过RT-PCR和Western blot,观察红景天苷对低糖低血清损伤PC12细胞Bcl-2和Bax mRNA及其蛋白表达的影响。5、通过RT-PCR和Caspase3活性检测,观察红景天苷对低糖低血清损伤PC12细胞Caspase3 mRNA及其蛋白活性的影响。6、采用亲脂性阳离子荧光染料Rhodamine123标记PC12细胞,通过激光共聚焦显微镜检测低糖低血清刺激引起的PC12细胞线粒体跨膜电位的变化。同时观察红景天苷预保护对低糖低血清损伤PC12细胞线粒体跨膜电位的影响。7、利用分子探针DCFH-DA标记PC12细胞,通过流式细胞仪测定荧光产物DCF的荧光强度,观察红景天苷预保护对低糖低血清损伤PC12细胞内活性氧自由基(ROS)含量的影响。结果1、MTT结果显示,低糖低血清培养对PC12细胞有明显的细胞毒性作用,随着低糖低血清培养时间的延长,细胞活力逐渐下降。2、形态学观察及MTT检测结果显示,红景天苷能拮抗低糖低血清损伤PC12细胞活力下降,在所观察的剂量范围内,随着药物浓度的增加,作用逐步增强,至320μg/ml作用最显著(P<0.05)。3、Hoechst 33342染色和流式细胞仪检测结果显示,红景天苷能显著减少低糖低血清损伤PC12细胞的凋亡(P<0.05)。4、RT-PCR和Western blot结果提示,红景天苷能拮抗低糖低血清损伤所导致的PC12细胞Bcl-2/Bax mRNA及其蛋白比例的下降,此作用存在剂量效应关系,至320μg/ml作用最显著(P<0.05)。5、RT-PCR和Caspase3活性检测显示,红景天苷能拮抗低糖低血清损伤PC12细胞Caspase3 mRNA表达的上调和蛋白活性的增强,此作用存在剂量效应关系,至320μg/ml作用最显著(P<0.05)。6、线粒体跨膜电位检测结果显示,低糖低血清损伤后,PC12细胞线粒体跨膜电位明显下降,而红景天苷预保护能显著拮抗线粒体跨膜电位的下降(P<0.05)。7、活性氧自由基(ROS)检测结果显示,低糖低血清损伤后,PC12细胞内ROS含量明显上升,而红景天苷预保护能显著拮抗细胞内ROS含量的升高(P<0.05),发挥清除ROS的作用。结论1、红景天苷能拮抗低糖低血清对PC12细胞的损伤作用,且这种作用呈现剂量相关性。2、红景天苷对低糖低血清损伤PC12细胞的保护作用与其调节凋亡相关基因、稳定线粒体跨膜电位和清除细胞内ROS有关。
邢宏义[9]2006年在《脑缺血后神经可塑性与修复的研究》文中认为目的脑缺血后神经可塑性与修复是近年来研究的热点，选择怎样的动物模型及脑保护剂是其研究的基础。本研究介绍一种标准的小鼠局灶性脑缺血／再灌注模型的制作，并观察脑梗死体积和脑水肿的变化。研究罗伐他汀(rosuvastatin)、氨甲酰促红细胞生成素(CEPO)、促红细胞生成素(EPO)对缺血性脑损伤的保护作用及机制。探讨多药耐药蛋白(P糖蛋白，P-glycoprotein,P-gp)对FK506通过血脑屏障(BBB)进入脑内浓度及其脑保护功能的影响。应用三级康复方案对急性脑卒中患者生理功能、生存质量的影响及卫生经济学评价，为脑血管病的康复制定最佳策略。方法用腔内线栓法制作脑缺血／再灌注动物模型(MCAO)；用TFC染色法进行脑大体观察；用甲酚紫染色法观察脑切片梗死灶；用脑血流激光多普勒监测脑缺血过程中脑血流的变化；用ImageJ软件计算脑梗死体积和脑水肿；用蛋白免疫印迹法分析脑缺血前后内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和活化型caspase-3(activated caspase-3)的变化；用免疫组织化学方法观察脑缺血再灌注后诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的改变。用免疫组织化学方法和western blot观察P-gp的表达；用ELISA法检测血和脑组织FK506浓度；用TUNEL法观察凋亡细胞。42例脑卒中偏瘫患者被随机分成康复组和对照组。两组患者急性期(21天内)均进行早期康复治疗。恢复期康复组于康复机构康复治疗2个月，再到社区或家庭康复治疗3个月，对照组自行在家练习。分别采用美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)、Fugl-Meyer运动功能评定(Fugl-Meyer assessment，FMA)、改良巴氏指数(modified barthel index，MBI)、SF-36量表来评定疗效。采用成本—效果分析及增量分析进行卫生经济学评价。结果(一)小鼠局灶性脑缺血／再灌注模型的制作及可重复性论证：(1)当线栓封闭大脑中动脉时，脑血流就会急剧下降至最低水平，拔出线栓后脑血流迅速上升至缺血前水平。(2)脑缺血后，脑片上呈现明显的梗死灶，脑梗死体积和脑水肿的大小较恒定。(3)脑缺血30 min再灌注24 h组梗死体积、脑水肿体积和脑水肿百分数分别为81.3±5.6 mm~3、61.6±3.5 mm~3、38.5±2.3％，显著小于脑缺血90 min再灌注24 h组(分别为105.2±8.9 mm~3、79.3±6.4 mm~3、49.6±3.9％)(P＜0.001)。(4)脑缺血30 min再灌注24 h和72 h脑水肿非常明显，分别为61.6±3.5 mm~3、72.6±4.3 mm~3(P＜0.001)，再灌注7天时脑水肿开始减退，仅为50.9±4.1 mm~3，再灌注30天时脑容积出现萎缩，脑水肿呈负值(-20.1±1.8 mm~3)。(二)罗伐他汀对缺血性脑损伤的保护作用及机制：(1)rosuvastatin 0.5 mg／kg、rosuvastatin 5 mg／kg组与对照组的梗死体积、脑水肿的差异无显著性意义，但rosuvastatin 20 mg／kg可以明显减少梗死体积，减轻脑水肿。(2) western blots显示脑缺血前脑组织eNOS表达为100±43.3％，缺血后明显升高至1668.9±112.2％(P＜0.001)，rosuvastatin可以使非缺血区脑组织eNOS表达从100±43.3％上调至511.4±68.7％(P＜0.001)，但rosuvastatin组缺血区脑组织eNOS表达为1678.8±121.3％，与对照组缺血区脑组织eNOS表达(1668.9±112.2％)比较差异无显著性意义(P＞0.05)。(3)非缺血区皮层无activated caspase-3表达，脑缺血后activated caspase-3表达上升至88.3±15.6％，rosuvastatin可使之显著降至42.1±11.2％(P＜0.01)。(4)免疫组织化学显示非缺血脑组织无iNOS阳性细胞表达，脑缺血再灌注后iNOS表达增至2.6±1.8cells／sq．，rosuvastatin 20mg／kg可明显减少iNOS的表达(0.6±0.3 cells／sq．)(P＜0.05)。(三)抑制P-糖蛋白可加强FK506对缺血性脑损伤的保护作用：(1) MCAO 30min再灌注3小时大脑皮质和纹状体中P-gp的表达即开始显著升高，持续至24小时，分别升高55.3％和67.9％(P＜0.05)；但再灌注72小时P-gp表达已不再升高，MCAO90分钟组P-gp的表达升高幅度较MCAO 30分钟组大。提示脑缺血后P-gp的表达在早期一过性升高。(2)脑缺血前后，P-gp抑制剂tariquidar(TQD)对血中FK506浓度的影响无显著性差异(P＞0.05)；使用TQD后，非缺血侧大脑半球FK506浓度无显著性变化，但在缺血侧大脑半球FK506浓度显著升高，脑与血的浓度比率平均从6.3上升至42.2(P＜0.001)，提示脑缺血后P-gp表达过多，阻止了FK506进入脑组织，当TQD抑制P-gp的活性后，FK506进入脑组织的量迅猛上升。(3) FK506在较低剂量(1mg／kg和3 mg／kg)无抗细胞凋亡作用，只有较大剂量(5 mg／kg)才有抗细胞凋亡作用，凋亡的细胞数从对照组的81.2±12.3下降至46.5±9.2(TUNEL(+)细胞数／square)(P＜0.001)。单独使用TQD无抗细胞凋亡作用，当TQD与FK506合用时，FK506较低剂量(1 mg／kg)即可发挥抗细胞凋亡作用。(4)单独使用TQD或FK506 3mg／kg无显著减少脑梗死体积的作用，当FK506 3mg／kg与TQD合用时，脑梗死体积从113.5±11.1 mm~3显著降低至70.6±10.2 mm~3(P＜0.01)，而FK506 5mg／kg可使脑梗死体积降低至85.2±10.1 mm~3(P＜0.01)。提示TQD抑制P-gp活性，使FK506对缺血性脑保护作用的阈值从5 mg／kg降低至1 mg／kg。(四)氨甲酰促红细胞生成素对缺血性脑损伤的保护作用：(1) CEPO 50μg／kg与较高剂量EPO(50μg／kg)具有相同的减少神经功能缺损评分作用，而低剂量EPO(5μg／kg)时无此作用；(2) NS组、EPO 5μg／kg组、EPO 50μg／kg组、CEPO 50μg／kg组的脑梗死体积分别为103.2±10.1、98.7±11.2、66.9±8.3、67.1±8.5 mm~3，脑水肿体积分别为78.9±6.8、76.8±7.3、52.2±5.4、53.1±5.6 mm~3；(3) EPO 50μg／kg使大脑皮层细胞凋亡数从对照组的94.2±15.2／sq．下降至40.5±9.8／sq．(P＜0.001)，CEPO 50μg／kg的抗细胞凋亡作用与EPO 50μg／kg相似；(4) CEPO和EPO脑缺血后大脑皮层eNOS无明显影响，但CEPO 50μg／kg可使activated caspase-3表达从95.4±16.7％明显下降至43.5±13.1％(P＜0.001)，EPO 50μg／kg也有类似作用，而EPO 5μg／kg无此作用；(5)CEPO 50μg／kg使缺血皮层iNOS表达从NS组的3.1±1.9 cells／sq．下降至0.7±0.2cells／sq．，(P＜0.05)，EPO 50μg／kg组的表达与CEPO 50μg／kg组相似，为0.8±0.2／sq．。(五)急性脑卒中患者应用三级康复程序的效果和卫生经济学评价：(1)脑卒中急性期(21天内)，康复组与对照组患者NIHSS、FMA及MBI的改善程度，差异无显著性意义(P＞0.05)；而恢复期(21 d后～6个月)的各个阶段，康复组明显好于对照组(P＜0.01)。(2)在康复后6个月及2年随访时，康复组的生存质量各个维度明显改善，与对照组相比差异有显著性意义(P＜0.05)；(3)康复组患者神经功能缺损积分每减少1分、运动功能及日常生活活动能力每提高1分需分别花费人民币2412.5元、442元和332.1元，而对照组则分别需花费3285.4元、637.8元和447.5元。结论(1)该小鼠局灶性脑缺血／再灌注模型具有重复性好、容易操作。(2) rosuvastatin通过增加eNOS的表达、抑制iNOS和activated caspase-3的表达而起到神经保护作用。(3) TQD抑制P-gp活性，增加FK506进入脑内的浓度，降低FK506脑保护作用的阈值，从而加强FK506的神经保护作用。(4)低剂量的EPO(5μg／kg)无脑保护作用。CEPO 50μg／kg与较高剂量EPO(50μg／kg)具有相似的减少梗死体积、缩小脑水肿、抗细胞凋亡作用，它们通过减少activated caspase-3和iNOS的表达而发挥神经保护作用。(5)三级康复方案对脑卒中患者功能恢复及生存质量具有良好的促进作用，而且更为经济。
赵瑞[10]2004年在《癫痫模型海马神经元细胞凋亡中caspase 3作用机理的初步研究》文中进行了进一步梳理癫痫是神经内、外科的常见病,我国的癫痫病人约有600万;估计每年新发病例接近40万。颞叶癫痫是癫痫中的常见类型,约占癫痫总数的20～30%,其中部分患者采用药物治疗无法控制发作,成为难治性癫痫,社会危害较大。颞叶癫痫患者常伴有海马组织萎缩及由此引起的与学习记忆功能损害有关的一系列症状,其中海马萎缩主要由海马神经细胞丢失引起。较多的临床试验及动物模型研究均显示颞叶癫痫中海马神经细胞丢失以细胞凋亡为主,且caspase 3在该过程中发挥重要作用。Caspase 3在癫痫模型动物神经元凋亡过程中把ICAD酶切,从而导致DNA碎片的产生。细胞需要表达新基因及合成新蛋白质以完成凋亡过程,故考虑癫痫发作引发海马神经元凋亡的过程中可能有特异性的新基因及新蛋白质的表达,且其中可能有未曾发现的caspase 3的底物。真核生物起始因子2(Eukaryotic Translation Initiation Factor 2,eIF2)是一个调控真核细胞mRNA翻译起始的蛋白质,在翻译启动过程中起着关键作用。有作者报道在某些发生细胞凋亡的过程中发生eIF2的α亚基(eIF2α)被caspase 3酶切,酶切后eIF2调控翻译起始的能力降低。凋亡的进程可因不同组织、不同的病理生理条件而具有不同特点。在颞叶癫痫导致海马神经元凋亡中eIF2与caspase 3有无相互作用,其作用是否具有特殊性目前尚未见文献报道。本实验采用通用的海人藻酸癫痫模型,研究模型中caspase 3对其已知底物eIF2α的酶切及其与海马神经元凋亡的关系,并以酵母三杂交技术筛寻颞叶癫痫模型海马神经元细胞凋亡中caspase 3 的新底物,为进一步研究探讨caspase 3在颞叶癫痫病人海马神经元凋亡过程中的作用奠定基础。第一部分 海人藻酸癫痫模型大鼠中Caspase 3对eIF2α作用的初步研究目的:对颞叶癫痫模型海马神经元凋亡中caspase 3对其已知底物eIF2α的酶切进行初步研究。方法:制备海人藻酸大鼠癫痫模型,观察记录其发作情况及脑电图表现,在发作终止后12、24、48、72、96h分别取海马组织,用TUNEL凋亡检测法检测模型大鼠海马神经元凋亡情况,用Western blot 法检测模型大鼠海马组织中eIF2α的表达变化,比较其与细胞凋亡之间的时程关系。结果:在癫痫发作后,随时间延长,海马神经元凋亡数量不断增加,在72小时达高峰,同时海马神经元中也出现了caspase 3酶切eIF2α产生的片段。结论:癫痫模型大鼠海马神经元中caspase 3 对eIF2α的酶切与海马神经元凋亡的发生时程一致,提示<WP=7>caspase 3酶切eIF2α在癫痫模型大鼠海马神经元凋亡中可能发挥重要作用。第二部分 从癫痫模型大鼠海马神经元中克隆caspase 3的新底物PIAS1及MIZ1目的:从癫痫模型大鼠海马的cDNA文库中筛寻caspase 3的新底物。方法:制作癫痫模型大鼠海马组织cDNA文库;以PCR方法,从文库中克隆获得caspase 3及 eIF2α的全长cDNA,再以PCR方法获得caspase 3的 P12小亚基和酶切功能位点有点突变的P17大亚基,然后分别定向插入到pBridge质粒的两个MCS中,构建酵母三杂交诱饵载体,通过与eIF2α之间的一对一实验,检验该载体的有效性;以该载体对癫痫模型大鼠海马组织cDNA文库进行酵母三杂交筛库。结果:成功建立了癫痫模型大鼠海马组织cDNA三杂交文库,构建了大鼠caspase 3基因的酵母三杂交诱饵载体,并通过caspase 3与eIF2α之间的相互作用验证,筛库获得caspase 3的新底物PIAS1及MIZ1, 均具有Caspase 3的底物酶切位点的典型特征,且发现PIAS1与抑癌基因p53亦有相互作用。结论:用酵母三杂交系统寻找caspase 3下游底物具有可行性,从癫痫模型大鼠海马的cDNA文库中克隆获得caspase 3的新底物PIAS1及MIZ1。已知MIZ1与细胞转录有关;PIAS1亦参与细胞凋亡,且可与p53作用诱导细胞凋亡。以上结果可促进对海马神经元凋亡过程的理解,具有深入研究价值,为进一步研究caspase 3在癫痫发作引起的海马神经元损伤中的作用机制奠定了基础。综上所述,本课题初步证明caspase 3对其底物的酶切在癫痫所致海马神经元丢失过程中有重要作用,并利用酵母三杂交技术对癫痫模型大鼠海马神经元凋亡进行研究,初步发现两个caspase 3的新底物,本研究结果将为探索在颞叶癫痫中caspase 3介导海马神经元凋亡的途径以及caspase 3可能参与的其他细胞学活动提供线索,为进一步研究颞叶癫痫海马神经元损伤机制及防治癫痫发作时神经元的损伤提供实验依据。
参考文献：
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[4]. 缺血缺氧性视神经视网膜损伤的分子机制研究[D]. 费霏. 第四军医大学. 2015
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[8]. 红景天苷对低糖低血清损伤PC12细胞的保护作用[D]. 于舒. 南通大学. 2008
[9]. 脑缺血后神经可塑性与修复的研究[D]. 邢宏义. 华中科技大学. 2006
[10]. 癫痫模型海马神经元细胞凋亡中caspase 3作用机理的初步研究[D]. 赵瑞. 第二军医大学. 2004
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