刘明[1]2000年在《H5和H7亚型禽流感分子防制技术的研究》文中指出本文根据禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）核蛋白（NP）基因核苷酸序列，设计合成了NP基因特异的引物NPF/R。不需要经过病毒分离，直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中用Trizol试剂提取病毒核酸，采用RT-PCR技术可以扩增出326bp的NP基因片段。采用引物NPF/R对14个亚型禽流感病毒标准参考株，4个亚型12株国内分离野毒株进行RT-PCR，都能特异的扩增出扩增326bp左右的目的片断，采用地高辛标记的NP基因探针进行斑点杂交，结果证明了PCR产物的特异性。新城疫病毒、法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒RT-PCR扩增结果都呈阴性。禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）和A/African Starling/England/983/79（H7N1）人工实验感染鸡病料的RT-PCR检测结果与鸡胚病毒分离结果分别为34/42、32/42；24/55、24/55符合率在95％以上。RT-PCR最少可以检测到10pg的病毒核酸。对山东某地发病鸡场样品进行RT-PCR检测，只用6个小时就得出确实的诊断结果。 根据Genbank数据库中发表的H5和H7亚型禽流感病毒血凝素基因（HA）核苷酸序列，分别设计合成了H5和H7亚型HA基因特异的引物H5F/R和H7F/R，建立了RT-PCR鉴别H5和H7亚型的分子分型诊断技术。引物H5F/R经RT-PCR能够扩增出H5亚型247bp的目的片段，引物H7F/R经RT-PCR能够扩增出H7亚型192bp的目的片段，这两对引物对其它亚型流感病毒和新城疫、传染性支气管炎病毒RT-PCR检测结果均呈阴性。采用地高辛标记的HA基因探针进行斑点杂交，结果证明了上述PCR产物的特异性。RT-PCR对H5和H7亚型实验感染鸡病料的检测结果与病毒分离结果分别为H5，32/38、30/38；H7，19/38、21/38的符合率为95％。使用引物H5FS/RS或H7FS/RS，经RT-PCR分别扩增出H5亚型998bp或H7亚型712bp的包含裂解位点在内的HA基因片段，目的片段回收后直接用于测序反应，根据核甘酸序列推出的蛋白质氨基酸序列可以用来判定H5或H7亚型病毒的致病性高低，从而为H5或H7型禽流感的毒力分析预测提供可靠的实验依据。 分别设计了HA基因和NA基因特异的引物，引物5’端分别添加有BamHI位点和HindIII位点，经RT-PCR分别扩增了禽流感病毒A/Goose/Guandong/1/96（H5N1）1.7kb的HA基因和1.4kb的NA基因，BamHI和HindIII酶切，然后分别克隆到pUC19的BamHI位点和HindIII位点，酶切筛选得到阳性重组子pUCH5和pUCN1。经序列测定后，再将HA基因和NA基因分别亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB的BamHI位点和HindIII位点中，随机筛选得刘 明 HS和 H7亚型禽流感病毒分子防制技术的研究 2000年 6月别亚克隆到杆状病毒转移载体PBlueBacHisB的BalnHI位点和Hindlll位点中，随机筛选得到重组转移载体pBacHS和pBacNI，序列分析证实读框正确后用于转染实验。从含有A／African Starling／Ensland／983／79（H7NI）HA基冈的重组质粒pUCH7中用 BamH切下1．7kb的M基因，然后将其插入杆状病毒转座载体pFaslBacDUAL的 BalnHI位点，随机筛选酶切鉴定得到止向重组转座于pFASTll7，经序列分析证明HA基因完整，方向正确，然后转染含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac，经抗生素筛选，PCR鉴定得到阳性穿梭转座子rBacmidH7。 在脂质体转染试剂CeellFECTIN介导下，将杆状病毒转移载体pBacHS和pBacNI与线性化的杆状病毒DNA（Bac－N－Blue DNA）共转染对数生长期的肝 昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经二轮蚀斑纯化，获得重组杆状病毒rBacHS和rBacNI。重组穿梭载体pBacmidH7在脂质体转染试剂介导卜．转染肝 细胞，获得重组杆状病毒rBacll7。提取重组杆状病毒DNA经PCR扩增证明目的基因片段插入到杆状病毒基因组中。间接免疫荧光染色试验、ELISA试验结果表明 HA和 NA基因在重组杆状病毒感染的蚊 细胞获得表达。SDS－PAGE电泳分析显示用组杆状病毒表达HA蛋白分子量为60kDa左右，能够凝集公鸡红细胞，血凝价1280—2560HAU／ml。里组杆状病毒表达M蛋白分子量为 50kDa左右。 页织杆状病毒rBacHS、rBacNI、rBacH7和野生病毒AcMNPV分别感染肚 细胞72小时后收集细胞，免疫6组6周龄肝P鸡。卜4组，m只／组，m‘细胞／只肌肉注射；对照组1fU 2，5只／组 10‘细胞／只肌肉注射。rBacHS和 rBacH7，rBacNI免疫组经二次免疫后，每次间隔时间为2周，rBacHS和rBacNI联合免疫组1＆免疫后4周；分别以10’EID。。的A／Goose，／G。angdong／1／96（HSNI）和A／African Starling／England／983／79（H7N）肌肉接种 10’EIDS。进行攻毒试验，试验结果表明所有亚单位疫苗免疫组都可产生禽流感病毒亚型特异性抗体，rBacHS一次免疫即可诱导产生血撤抑制抗体（HI） 3．slooZ，加强免疫后HI抗体效价明显升高 4．slogZ。rBacHS二次兔疫组和 rBacHS＋rBacNI联合免疫组对强毒攻击的保护率达 90％（9／10），rBdCNI免疫组对强毒攻击保护率为 50％（5／10），而空白对照组对强毒攻击不能提供保护，5只鸡全
左青山[2]2007年在《共表达禽流感病毒HA5和HA9基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究》文中进行了进一步梳理本试验构建了禽流感HA5和HA9基因共表达禽痘病毒转移载体,经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化,获得了遗传形状稳定的HA基因重组禽痘病毒。提取感染重组病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA进行PCR扩增,获得1.7k6的携带有外源目的基因片段。收集纯化的重组病毒CEF细胞,分别用H5亚型和H9亚型AIV多克隆血清作一抗,碱性磷酸酶标记的鸡IgG为二抗进行Western blot检测,结果表明重组痘病毒能在体外的CEF细胞表达HA糖蛋白。用该重组病毒进行鸡翅刺种免疫60日龄SPF鸡,免疫3周后,每只鸡用50XLD H5亚型HPAIV攻毒,H5免疫组无一发病和死,攻毒保护率100%;H9组用50XLD H9亚型LPAIV攻毒,攻毒保护率20%;对照组全部发病并在攻毒后3-9天相继死亡,发病率和死亡率均为100%。H5抗体效价检测结果表明重组病毒免疫组鸡在免疫后7大即可检测到高效价的HI5抗体,抗体效价在免疫后14天达到高峰,随后在较高水平上缓慢下降,攻毒对抗体效价及其变化没有影响;而H9抗体检测效价较低,平均1.2Log2。通过本试验研究,获得了遗传性状稳定,表达AIV HA5和HA9基因重组禽痘病毒,SPF鸡免疫和攻毒试验结果表明,重组病毒疫苗能全面诱导机体的细胞免疫和体夜免疫反应,对H5强毒攻击产生强的免疫保护,为进一步开展疫苗研究奠定科学的理论和实验基础。
李呈军[3]2005年在《中国H9N2亚型禽流感病毒进化分析与H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究》文中指出我国在1994年从广东省分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒(AIV),此后,该亚型病毒在全国范围内广泛流行。本研究对1996-2002年中国大陆分离到的27株H9N2亚型AIV进行了系统的进化分析,其目的是为如下问题提供答案:1)中国大陆H9N2亚型AIV的遗传演化关系如何? 2)是否具备感染哺乳动物的能力? 3)它们的抗原性关系如何,是否出现了抗原变异株? 27株病毒以10~6EID_(50)的剂量鼻腔感染SPF鸡,表明所有病毒均为低致病性毒株。抗原性分析表明,这些病毒的抗原性比较复杂,出现了多株抗原变异株。CK/GX/10/99,CK/HLJ/35/00和CK/SH/10/01三株病毒的灭活疫苗免疫保护实验结果表明,只有CK/SH/10/01疫苗可以对同源病毒攻击产生完全的免疫保护,而且灭活疫苗对异源的CK/SH/10/01和CK/GX/10/99病毒的交叉免疫保护效果很差,攻毒后有多只鸡排毒。 进一步利用BALB/c小鼠模型评价H9N2亚型AIV对哺乳动物的感染能力,根据感染后小鼠的体重变化和病毒在小鼠肺脏中的生长滴度,将27株病毒分为3组。第一组5株病毒感染小鼠后在肺脏中未分离到病毒,小鼠不致病,体重不下降。第二组包括14株病毒,其中11株病毒感染后3天肺脏病毒滴度在2.8-5.8log_(10)EID_(50)/ml之间,另外3株病毒感染后3天未从小鼠肺脏中分离到,感染后5天则可以检测到较低水平的病毒复制,该组病毒感染后小鼠体重持续增长或仅引起低于5%的体重下降。第三组8株病毒感染小鼠后3天肺脏病毒滴度在6.0-7.3log_(10)EID_(50)/ml之间,其中7株病毒可导致小鼠出现明显的发病症状,体重下降10-20%。 遗传演化分析表明,所有病毒都是起源于CK/BJ/1/94-like病毒,并且在进化过程中发生了复杂的基因重组,由QA/HK/G1/97,TY/WI/66,CK/HK/G9/97或CK/SH/F/98病毒获得了某些基因片段,形成了9个不同的基因型。发现3株病毒的M2蛋白的31位由S突变为N,经过试验证实这些病毒获得了对金刚烷胺的抗药性。 本研究系统的阐明了我国H9N2亚型AIV的生物学及遗传多样性。这些病毒对家禽呈低致病性,这就使得其更易于传播扩散;多数病毒获得了感染哺乳动物并在其体内有效复制的能力,因此有可能演变成引起人类流感流行的病毒;这些病毒之间存在显著的抗原性差异,而且出现了抗药性毒株,这就为有效防制带来了极大的困难。因此,必须对H9N2亚型禽流感的防制给予足够的重视。 H5N1亚型禽流感的暴发给世界养禽业造成毁灭性打击。疫苗免疫是防制高致病性H5N1亚型禽流感的重要手段,能与自然感染相区别的免疫措施对禽流感的控制和根除非常重要。本研究利用反向遗传操作技术人工救获了H5N1亚型重组流感病毒疫苗株H5N1/PR8-5819,其6个内部基因来源于高滴度鸡胚适应株PR8,HA和NA基因来源于我国分离的第一株H5N1亚型禽流感病毒GS/GD/1/96。通过分子修饰去除了HA基因裂解位点的多个连续碱性氨基酸,使其具备了低致病
熊蕊[4]2007年在《H5亚型高致病性禽流感病毒感染禽的抗体竞争ELISA诊断方法的建立》文中认为本研究分别采用Pcagg-HA重组质粒、含禽流感H5亚型HA基因的VSV重组病毒和新-禽二联疫苗作为免疫原,免疫8周龄BALB/C雌性小鼠,三次加强免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,采用纯化的高致病性禽流感病毒(HPAIV)H5N1亚型A/Duck/Zhejiang/11/00(H5N1)(DZJ/1100)毒株包被ELISA方法检测筛选,阳性细胞克隆经有限稀释法克隆培养,最后获得九株H5亚型HA特异性单克隆抗体(McAb),分别命名为10E2B1、16C11A12、16C11B1、14B5H9、11C7H8、9E1A1、14B4B12、15A9H11和12G1B1。各株McAb腹水效价测定显示九株HA特异性McAb效价均大于5000。抗体亚类检测结果表明九株HA特异性McAbs亚类依次为IgG3、IgG3、IgG3、IgM、IgM、IgM、IgM、IgM和IgG2b,所有McAb均为κ链,经检测具有良好的特异性。采用纯化的高致病性禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00(H5N1)毒株包被ELISA方法, H5亚型特异性单克隆抗体为检测抗体,建立了检测H5亚型高致病性禽流感病毒感染禽的抗体竞争ELISA方法。通过对各步反应条件进行优化,获得的最佳工作条件为:纯化病毒1:1250倍稀释,单抗1:500稀释,酶标抗体为1:5000倍稀释,一抗、单抗及酶标抗体反应时间均为1.0h。用建立的竞争ELISA方法对已知的NDV、EDS76、IBV、IBDV、ILTV、MDV和APV等禽类及猪病阳性血清以及其他15个HA亚型禽流感标准病毒株血清进行交叉反应性试验,结果表明:建立的H5亚型高致病性禽流感病毒感染禽的抗体竞争ELISA方法和其他禽及猪类血清以及其他亚型禽流感标准阳性血清均没有明显的交叉反应性,与阴性对照没有明显差异,说明该方法对H5亚型禽流感病毒抗体具有良好的特异性。
张平静[5]2006年在《共表达H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA基因和NA基因DNA疫苗的构建及其免疫效力评估》文中研究说明众多研究表明，基于禽流感HA基因所研制的基因工程病毒活载体疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗均可对同一HA亚型病毒的攻击产生近100％的保护，而对异源病毒的攻击保护性较差。鉴于禽流感病毒的抗原性是不断变化的，理想的禽流感疫苗需要考虑到它对不同亚型病毒的保护性如何，NA作为AIV的重要的结构蛋白恰好具有弥补HI缺陷的某些优点，可以诱导机体产生特异中和抗体。因此，如果能利用其这一特性研制DNA疫苗将为禽流感的免疫预防带来极大的方便。 为了研究HA、NA基因DNA疫苗，我们用PCR从质粒pBDNA中扩增A／Goose／GuangDong／1／96(H5N1)[GD／1／96(H5N1)]NA基因；以含CMV启动子—增强子的pCI，含鸡β—actin启动子表达载体pCAGGS分别构建真核表达质粒pCINA和pCANA。再用pCANA分别与质粒pCIoptiHA、pCAoptiHA构建双顺反子表达质粒pCIH5N1、pCAH5N1，其中optiHA基因和NA基因都位于各自的强启动子和增强子下，且都带有独立的Poly(A)终止序列，从而保证了此DNA疫苗中的两个基因都能独立表达。此项研究为开展鸡禽类免疫实验和免疫药剂效能的评估奠定了基础。 将构建质粒pCINA、pCANA、pCIoptiH5N1和pCAoptiH5N1分别转染293T细胞，间接免疫荧光检测转染后的48小时293T细胞；另外以Westerm blot检验上述四种质粒可分别表达相应的HA、NA蛋白。结果表明：本试验成功构建了表达优化的HA基因和NA基因的DNA疫苗质粒pCANA、pCINA、pCAoptiH5N1和pCIoptiH5N1，体外瞬时转染293T细胞后用间接免疫荧光及Western blot方法均检测到了相应的HA、NA蛋白表达产物，并具有生物活性。 为进一步评估不同免疫源基因构建DNA疫苗单独、联合使用对SPF免疫鸡形成免疫保护效果，以10μg pCIoptiHA、pCAoptiHA、pCIoptiHA+pCANA、pCAoptiHA+pCANA、pCIoptiH5N1、pCAoptiH5N1、pCANA的免疫剂量分别肌肉注射免疫3周龄SPF鸡，对照鸡则以PBS肌肉注射免疫。首次免疫3周后以相同剂量和途径加强免疫，加强免疫后2周分别用100LD_(50)的HPAIV GD／1／96(H5N1)、A／FPV／Rostock／34(H7N1)鼻腔感染攻毒，观察发病与死亡情况，分别于攻毒后第3、5、7采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况，同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体的动态变化。 以100LD_(50)的HPAIV GD／1／96(H5N1)攻击实验结果：除对照组和pCANA外，所有免疫组在加强免疫后攻毒前HI抗体转阳，并且HI抗体水平都大于5log2。10μg剂量免疫，pCIoptiHA、pCAoptiHA可对免疫鸡形成100％完全保护，不发病，不死亡，但有较多免疫鸡排毒；10μg剂量免疫，pCAoptiHA+pCANA可对免疫鸡形成100％完全保护，并且不发病、不致死、不排毒；10μg剂量免疫，pCIoptiHA+pCANA、pCAoptiH5N1、pCIoptiH5N1也能对免疫鸡形成100％完全保护，不发病、不死亡，只有个别免疫鸡出现排毒情况。10μg剂量免疫，pCANA形成部分免疫保护，但排毒免疫鸡数量多。实验证明了HI抗体在免疫保护中的主导作用，NI抗体在HI抗体存在的条件下，才明显表现出增强免疫保护效果的作用。 以100LD_(50)的HPAIV A／FPV／Rostock／34(H7N1)攻击实验结果：单基因DNA
李雪平[6]2008年在《H9亚型禽流感病毒单抗的制备及其抗原捕获ELISA方法的建立》文中研究表明本研究用H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/6/1996(CK/SD/6/96)作为免疫原,免疫6周龄BALB/c雌性小鼠。加强免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,采用ELISA方法和HI方法筛选,阳性细胞克隆经有限稀释法克隆培养,最后获得3株H9亚型HA特异性单克隆抗体(McAb),分别命名为1F4C4、9F12D1、2C5H12。3株阳性杂交瘤细胞的培养上清及腹水对CK/SD/6/96的HI效价分别为26、24、21和212、210、27。特异性试验表明该3株单抗均不与其他主要禽类病毒和其他14个HA亚型的禽流感病毒发生交叉反应。1F4C4和2C5H12抗体亚类为IgG2b,9F12D1为IgG2a。该3株单抗对某些病毒有较高的中和活性。对已有的H9亚型单克隆抗体进行累加ELISA实验,筛选出针对不同抗原表位的单克隆抗体,并进行纯化及HRP标记。经过配对试验,建立了以单克隆抗体A11/C6作为捕获抗体,酶标BD12为检测抗体的抗原捕捉ELISA方法,用于检测H9亚型禽流感病毒抗原。通过对各个反应条件进行优化,获得的最佳工作条件为:捕获抗体1:4000倍稀释(0.0785μg/孔);标准抗原1:10稀释,酶标抗体最适工作浓度为1:3000倍稀释;抗原反应时间1.5h;酶标抗体作用时间1.0h。0.05mol/L pH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液为包被液,3%脱脂乳-PBS稀释液为封闭液。用建立的抗原捕捉ELISA方法与NDV、IBV、IBDV、ILTV和FPV以及其他14个HA亚型禽流感病毒进行交叉反应性试验,结果表明:H9亚型禽流感病毒抗原捕捉ELISA方法与其他禽类病毒及其他亚型禽流感病毒均没有明显的交叉反应性,说明该方法对H9亚型流感病毒具有高度的特异性。本实验建立的抗原捕获ELISA方法较HA方法敏感2倍以上,对纯化的H9亚型禽流感病毒最低检出量为7.6ng。重复性实验表明,同一样品的板内和板间的变异系数均小于10%。将包被好的反应板及酶标抗体和标准阴阳性抗原组装成简易试剂盒,同时保存于室温、4℃和-20℃,定期进行检测,结果表明:试剂盒在室温保存时极不稳定,保存期限不应超过1个月,4℃可保存4个月,可在-20℃稳定保存5个月以上。
张瑞华[7]2005年在《禽流感病毒血凝素基因的克隆、表达及亚型诊断方法的研究》文中研究表明禽流感(Avian Influenza,AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。它是造成全球突发卫生事件最常见的传染病,自1878年意大利鸡群首次爆发该病以来,世界各地都相继有各种亚型的禽流感病毒(AIV)引起的AI暴发。尤其是高致病力禽流感可导致高达100%发病率和/或死亡率。并可直接感染人并致人死亡。而低致病力禽流感病毒同样可以给养禽业带来灭顶之灾,对人类的威胁同样严重,尤其是H9亚型禽流感。特别是1997香港禽流感事件以及2003年末至2004年初禽流感在东南亚各国和中国的大面积暴发,引起了人们的高度重视。 A型流感病毒亚型众多,易变。目前,已经发现了15种H亚型和9种N亚型,且各亚型之间无血清学交叉反应。从而导致该病的诊断和治疗非常困难。因此,迫切需要一种较为理想的禽流感亚型诊断方法。血凝素(HA)糖蛋白为病毒最重要的表面抗原,具有亚型特异性,同时可以诱导特异性抗体的产生。因此,利用HA蛋白有望建立一种诊断禽流感亚型的方法。鉴于此,本研究利用禽流感H5、H9亚型HA蛋白作为诊断抗原建立了诊断禽流感亚型的ELISA检测方法。该方法快速、灵敏、准确、简便,可以直接检测到亚型,该方法的建立对进出口检验检疫,禽流感的防制具有十分重要的意义。主要研究内容包括: 1.H5N1、H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与序列分析 本研究根据GenBank收录的H5N1、H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物,利用RT-PCR方法从本室分离鉴定并保存A/Chicken/HuBei/326/2002(H5N1)、A/Duck/HuBei/405/2003(H9N2)禽流感病毒中扩增了血凝素基因,将两种扩增产物分别克隆进pMD18-T载体,限制性酶切及序列测定用以筛选阳性克隆子。结果发现H5N1HA、H9N2HA分别为1707bp和1683bp。 2.H5N1、H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的亚克隆及原核表达 基于HA蛋白的信号肽在表达中的负面作用,本研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码序列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,并将其亚克隆到pGEX-KG中,与GST蛋白融合表达。SDS-PAGE结果显示:融合表达的蛋白分子量分别约为90KDa、92KDa。Western blot印迹表明表达蛋白具有免疫学活性,位于包涵体中。
李知新[8]2017年在《宁夏禽流感流行病学调查及病毒HA基因遗传进化分析》文中指出禽流感(avian Influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza viruse,AIV)引起的一种禽类疾病综合征。该病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)甲型流感病毒属(Influenzavirus A),呈世界性分布,能感染许多的禽类。水禽是禽流感病毒的贮存库,一旦禽流感病毒从水禽传播给家禽,可引起致死性的疾病毁灭性的后果。还有一少部分禽流感病毒可由禽类传播给人,甚至导致人的死亡。因此,开展禽流感流行病学调查和分子遗传进化分析研究,对禽流感的防控及人-禽间的流感大流行预测具有重要意义。本研究通过利用简单随机的抽样方法,对宁夏2013~2015年采集的33个规模场、9个活禽市场和3个屠宰场的2700份血清以及18个市场(次)、143个养殖场、5个屠宰场共计297个家禽群体的5840份样品,分别进行血清学和病原学检测,同时利用统计学方法对规模场禽流感的感染风险因素进行分析。血清学检测结果表明,H5和H9亚型禽流感免疫抗体总体个体合格率分别为84.41%和94.3%,场群合格率分别为86.67%和98.89%;规模场免疫抗体水平总体高于活禽市场和屠宰场;H7亚型禽流感感染抗体个体阳性率和场群阳性率均为0。病原学检测结果表明,各监测场点主要以H9亚型禽流感病原为主。此外,在1个县的规模场检测到了H5N6亚型高致病性禽流感,在1个市场中检测到了H7N9亚型禽流感,在1个野鸟栖息地中检测到了H3N2亚型禽流感;10月份至次年5月份是病毒的活跃期;从不同监测品种来看,黄羽肉鸡病原学阳性高于其它品种的禽类;从不同地区检测结果来看,各地均检测到了禽流感病毒,其中,中卫市和固原市为禽流感流行的主要区域。规模场感染风险因素分析表明,执行全进全出制度、安装严密的防鸟网、病死禽及时无害化处理、单批次养殖、人员出入严格消毒、不进出活禽市场和不与外部人员接触可以有效预防规模场禽流感的感染;利用logistic回归建立回归模型,并绘制ROC曲线,结果表明,模型拟合度和预测规模场禽流感传播风险的能力均较好。利用暴发调查方法,对一起规模场肉杂鸡感染H5N6亚型禽流感病毒疫情开展了紧急流行病学调查。结果表明,引起此次疫情的原因是,由携带有H5N6亚型禽流感的野鸟传播给散养肉杂鸡后,经过养殖场人员与病死禽接触将疫情带入该规模场。对该起疫情通过紧急扑杀和无害化处理后,有效控制了本病的传播和蔓延。针对调查结果,建议养殖场应加强生物安全建设,转变饲养模式,依法科学开展养殖;同时政府应加大科技研发的投入产出力度,推动科技工作者及时研制高效匹配的疫苗,以用于禽流感的防控。为了研究宁夏禽流感病毒遗传进化特性,对分离的16株禽流感病毒开展了HA基因的遗传进化分析。结果显示,分离的1株野鸟源H3N2亚型禽流感与蒙古国A/duck/Mongolia/199/2015(H3N8)株的核苷酸同源性为最高,为98.6%,提示该毒株由外源传入;分离的1株H5N6亚型禽流感病毒属于Clad 2.3.4.4分支,较2015年之前在宁夏分离到的3株H5亚型禽流感毒核苷酸同源性发生了很大的变异,提示要及时利用匹配的疫苗来开展预防和控制;分离到1株H7N9流感病毒与2013新发H7N9亚型流感病毒的表面基因高度相似,与人源代表株A/Anhui/1/2013(AH/1)的HA基因的核苷酸同源性同样高度相似,达到98.7%,提示要密切加强对该病毒的监测,关注此类病毒变异情况;分离的13株H9N2亚型禽流感病毒与疫苗毒株的核苷酸同源性在88.7%~91.4%之间,说明分离到的H9亚型毒株的HA基因序列已经发生了变异,推测当前使用的疫苗难以起到有效的保护作用。同时,为满足禽流感病毒的检测需要,本研究建立了H5和H9亚型禽流感病毒TaqMan MGB荧光RT-PCR检测方法。与病毒分离鉴定、商品化试剂盒一致性检验结果相比,本研究建立的H5亚型和H9亚型禽流感病毒TaqMan MGB探针荧光RT-PCR检测方法特异性强,敏感性高,能快速、准确地检测禽咽喉-泄殖腔拭子、病理组织和粪便中H5和H9亚型禽流感病毒核酸,可为禽流感诊断、疫病监测、流行病学调查等方面提供有力的科学依据。
李俊辉[9]2008年在《表达禽流感病毒H7亚型HA基因的禽痘重组病毒的构建及其免疫效力的评估》文中提出禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起的禽类的感染和/或疾病综合征,广泛流行于世界上许多国家和地区,给养禽业造成了巨大的经济损失。高致病力禽流感(HPAI)多以突然发病和高死亡率为主要特征,常常导致感染鸡群的全群覆没,被国际兽疫局列为A类烈性传染病。近几年来,在我国的一些地区也相继出现了AI的流行, 1997香港禽流感直接传播给人并致人死亡事件的发生,更加突出了AIV的公共卫生学意义。目前,H5亚型高致病性禽流感成为研究的焦点,而H7亚型高致病性禽流感的研究报道较少,其相关的生物制品比较匮乏。虽然近年来H7型未出现大规模的流行,但禽流感不同亚型的流行变幻莫测,本研究构建的H7亚型重组禽痘活载体疫苗将为我国H7亚型高致病性禽流感的防治提供物质储备和技术支持。本研究将我国H7亚型禽流感分离株A/Chicken/Hebei/1/02(H7N2)的HA基因克隆到pSY538质粒上,把含有禽痘病毒启动子P11的LacZ基因克隆到质粒pSY538-HA的SmaI位点,然后切下同时含有HA和LacZ基因的片段再克隆到禽痘病毒载体pSY681的NotI位点,构建出禽痘病毒转移载pSY681-HA7-LacZ。将重组质粒与亲本禽痘病毒S-FPV-017共转染鸡胚成纤维细胞,进行同源重组,通过加入X-gal进行阳性重组病毒的筛选、纯化,获得了遗传性状稳定的表达H7亚型HA基因的重组禽痘病毒rFPV- H7HA。提取重组病毒的总DNA进行PCR扩增,获得了1.7kb的携带有外源目的基因片段,证明所获得的重组病毒携带有外源目的基因片段;Western blot检测结果表明:重组痘病毒能在体外的CEF细胞有效表达HA糖蛋白。分别用106、104、102的PFU剂量的重组病毒rFPV- H7HB免疫4周龄SPF鸡,4周后分别用100LD50的HPAIV A/FPV/Rostock/34 (H7N1)鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况,分别于攻毒后第3、5、7天采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、AGP抗体的动态变化,对重组病毒的免疫保护效果进行全面评估。结果,不同剂量的重组病毒免疫后均可诱导出较高水平的HI抗体,抗体效价在免疫后可达到6lg2,而且其AGP抗体均为阴性;在病毒攻击后免疫鸡无一发病和死亡,攻毒保护率为100%,病毒分离和滴定结果显示所有免疫鸡没有发生排毒;而对照组全部发病并在攻毒后3-8天相继死亡,发病率和死亡率均为100%,并在其泻殖腔和喉头拭子中均分离到了较高滴度的病毒。本试验研究结果表明,稳定高效表达我国H7亚型禽流感分离株A/Chicken/Hebei/1/02(H7N2)HA基因的重组禽痘病毒rFPV- H7HA能有效诱导机体的体液免疫反应,可以对H7亚型高致病性病毒的攻击产生100%的免疫保护,此重组活载体疫苗可为我国H7亚型高致病性禽流感的防制提供必要和有效的物质技术储备。
李贺[10]2006年在《H7亚型禽流感基因工程亚单位疫苗的研究》文中认为应用RT-PCR方法扩增A／PFV／Restock／34(H7N1)HA 1.7kb的HA基因，然后克隆到pMD-18T载体中，筛选到阳性重组子pMDH7HA，经酶切和PCR鉴定正确后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBac4.5／V5-His-TOPO的下游，随机筛选得到重组转移载体命名为pBHis-H7HA，经序列分析证明HA基因完整。与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-Blue~(TM) DNA)共转染Sf9昆虫细胞，经三轮蚀斑纯化，获得重组杆状病毒rpH7HA。将重组杆状病毒在High Five细胞中表达，SDS-PAGE上有一63.7kD大小的泳带，正常细胞对照组无此条带，表明目的蛋白已表达。Western-blot实验结果显示表达H7HA蛋白在63.7 kD位置出现特异性阳性条带，说明所表达目的的蛋白有免疫学活性。 将目的蛋白定量后用弗氏完全佐剂乳化预制成禽流感H7HA基因工程亚单位疫苗。15只SPF鸡平均分三组：一次免疫组、加强免疫组和对照组。以20μg／羽剂量免疫三周龄一次免疫组、加强免疫组SPF鸡，两周后对加强免疫组进行二免：一免四周时(加强免疫组二免两周时)攻毒，结果表明一次免疫组对同源强毒攻击的保护率为40％，加强免疫组对同源强毒攻击的保护率为100％，对照组全部死亡。鸡攻毒后3天、5天和7天，分别取各组鸡的咽拭子，泄殖腔拭子进行病毒分离。结果显示加强免疫组鸡咽拭子、泄殖腔拭子均未检测到排毒，一次免疫组鸡有两只可以检测到，而对照组鸡攻毒后5天内全部死亡。分离实验表明该疫苗对禽流感有一定的保护力。本研究研制的H7亚型禽流感亚单位疫苗期待为我国的禽流感防制作出贡献。 我们使用10L转瓶对昆虫／杆状病毒表达系统大规模表达禽流感H7HA重组目的蛋白进行了的研究。结果表明：维持27.5℃，转速150rpm，添加10u／L的表面活性剂肝素钠，细胞接种密度2×10~5～3×10~5cell／ml可通过昆虫／杆状病毒表达系统在转瓶得到大量的具有生物学活性的目的蛋白。本实验可作为生产禽流感基因工程亚单位疫苗抗原的探索，并为下一步规模化生产奠定基础。
参考文献：
[1]. H5和H7亚型禽流感分子防制技术的研究[D]. 刘明. 中国农业科学院. 2000
[2]. 共表达禽流感病毒HA5和HA9基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D]. 左青山. 新疆农业大学. 2007
[3]. 中国H9N2亚型禽流感病毒进化分析与H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究[D]. 李呈军. 中国农业科学院. 2005
[4]. H5亚型高致病性禽流感病毒感染禽的抗体竞争ELISA诊断方法的建立[D]. 熊蕊. 新疆农业大学. 2007
[5]. 共表达H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA基因和NA基因DNA疫苗的构建及其免疫效力评估[D]. 张平静. 福建农林大学. 2006
[6]. H9亚型禽流感病毒单抗的制备及其抗原捕获ELISA方法的建立[D]. 李雪平. 中国农业科学院. 2008
[7]. 禽流感病毒血凝素基因的克隆、表达及亚型诊断方法的研究[D]. 张瑞华. 华中农业大学. 2005
[8]. 宁夏禽流感流行病学调查及病毒HA基因遗传进化分析[D]. 李知新. 甘肃农业大学. 2017
[9]. 表达禽流感病毒H7亚型HA基因的禽痘重组病毒的构建及其免疫效力的评估[D]. 李俊辉. 新疆农业大学. 2008
[10]. H7亚型禽流感基因工程亚单位疫苗的研究[D]. 李贺. 新疆农业大学. 2006
标签：畜牧与动物医学论文; 抗体论文; 禽流感论文; 抗原抗体反应论文; 抗原表位论文; 基因合成论文; 细胞免疫论文; 传染病论文; 重组蛋白论文; 问题疫苗论文; 疫苗事件论文;