饶静静[1]2007年在《嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌多重PCR检测方法的建立与应用》文中认为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是多种水产动物的主要致病菌，还是引发食源性疾病的重要病原菌。研究表明，嗜水气单胞菌可引起人的急性胃肠炎、败血症及伤口感染、中耳炎、腹膜炎等。目前，在国外已将嗜水气单胞菌纳入腹泻病原菌的检测范围，是食品卫生检验的对象；迟钝爱德华氏菌是人鱼共患的条件致病菌。因此，嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌不仅对养殖生产是一种威胁，对人的健康也是一种潜在危险，检测水产动物及食品中嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌具有重要的实际意义。研究资料表明，嗜水气单胞菌的致病性与气溶素基因(aerA)、溶血素基因(hlyA)密切相关，这也是用于鉴别致病株与非致病株的关键因素；谷氨酸脱羧酶基因(gadB)是迟钝爱德华菌七个毒力基因(orfA、citC、fimA、gadB、katB、mukF和ssrB)之一，只存在于致病菌株中而不存在于非致病菌株中。本文在扩增上述毒力基因的基础上，建立了鉴定致病性嗜水气单胞菌的多重PCR方法和能同时检测致病性嗜水气单胞菌与迟钝爱德华氏菌的多重PCR方法，并用该方法及常规的微生物学方法对送检样品和水产养殖场水样进行了检测。试验Ⅰ根据GenBank中登录的相应基因序列设计并合成叁对特异性引物，扩增嗜水气单胞菌aerA、hlyA基因和迟钝爱德华氏菌gadB基因，克隆后送交TaKaRa公司测序，与GcnBank中提交的相应核苷酸序列进行同源性比较。结果发现aerA、hlyA和gadB这叁个基因与GenBank中提交的相应核苷酸序列都有较高的同源性，其中aerA基因的核苷酸序列与AF539467参考株的同源性最高，达到99．8％；hlyA基因的核苷酸序列与AF146599参考株的同源性最高，达到97．9％；gadB基因的核苷酸序列与AY078505参考株的同源性最高，达到87．1％．说明所设计的引物具有较高的特异性和可靠性，为建立多重PCR方法奠定了基础。试验Ⅱ根据试验Ⅰ设计的引物扩增aerA、hlyA基因，再辅以气单胞菌属所特有的内参照基因16s rRNA，进行多重PCR反应体系优化、多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性试验，试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测，结果显示非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA，而致病性分离株则至少含有hlyA基因；对40份送检的水产动物病料进行多重PCR检测，结果与常规微生物学检测符合率为97．5％。该方法具有较高的敏感性与特异性，可检测最低10 ng的模板。该试验建立的方法可快速检测水产动物及食品中的致病性嗜水气单胞菌。试验Ⅲ根据试验Ⅰ设计的引物扩增aerA、hlyA和gadB基因，进行多重PCR反应体系优化、特异性和敏感性试验，试图建立一种可同时用于嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌检测的多重PCR方法。对7株嗜水气单胞菌分离株和3株迟钝爱德华氏菌分离株进行多重PCR检测，结果显示非致病性分离株均未扩增出相关毒力基因，而致病性嗜水气单胞菌分离株则至少含有hlyA基因，致病性迟钝爱德华氏菌含有gadB基因；对40份送检的水产品样品及12份养鳗场取的样品进行多重PCR检测，结果与常规微生物学检测符合率分别为100％(爱德华氏菌)和98．1％(嗜水气单胞菌)。该方法具有较高的敏感性与特异性，最低可检测到10~(-9)g(ng)级。该方法的建立对水产动物感染致病性嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。试验Ⅳ从福建省某养鳗厂的养殖池水体中分离出一株病原菌，该菌为革兰氏阴性短杆菌，运动力阳性，氧化酶阳性，产生吲哚，葡萄糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖、七叶灵、V-P阳性，根据菌落形态、生化特性及试验Ⅱ建立的多重PCR方法，最后鉴定为嗜水气单胞菌。致病性试验结果显示该分离菌具有较强的致病性，均能致死小白鼠和鳗鱼。药敏试验结果表明，该菌对卡那霉素、氯霉素和呋喃唑酮、氧氟沙星、环丙沙星等喹诺酮类药物极为敏感。试验Ⅴ进行了对喹诺酮类药物敏感的嗜水气单胞菌DNA旋转酶A亚单位(gyrA)基因的原核表达。喹诺酮类药物是通过影响gyrA所催化的DNA超螺旋反应过程中DNA裂解和重新组合步骤，从而阻断细菌DNA复制，达到抑菌和杀菌目的，当gyrA基因发生突变后往往意味着细菌对喹诺酮类药物抗性的产生。本试验根据GenBank中登录的gyrA基因序列设计引物，运用PCR扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pET30a(+)的EcoRI和XhoI位点，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导获得高效表达，用Ni-NTA纯化目的蛋白，SDS-PAGE蛋白电泳表明在约28．0 kD处出现特异带，与理论推断值相符。经扫描定量分析，纯化后的融合蛋白纯度达到79．2％。gyrA基因蛋白的高效表达为其耐药性的分子机理研究奠定了基础。
臧明发[2]2011年在《鲫鱼IgM单克隆抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体ELISA检测方法的建立》文中进行了进一步梳理嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)分布于世界各地,广泛存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中,对水产养殖及野生鱼、虾、蛙、甲鱼等生物有致病性,并可进一步通过水产动物和水产品感染人畜,造成人畜腹泻和败血症等。它们所致的鱼类等嗜水气单胞菌病具有流行广、发病快、死亡率高等特点,常常造成养殖渔业的巨大经济损失。因此,建立快速、特异、有效的检测和鉴定嗜水气单胞菌的方法显得尤为重要。研究证实,鱼类在受到微生物、寄生虫等病原体感染或接受人工免疫后,均能产生由免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)介导的特异性体液免疫反应。这些免疫球蛋白在鱼体的免疫防御中起着十分重要的作用。因此,制备高纯度的鱼类免疫球蛋白对于研究鱼类体液免疫应答规律、建立以免疫球蛋白为核心的病原快速诊断和鱼类血清学分析方法具有重要的意义。采用饱和硫酸铵分步盐析结合Macro-prep high Q Cartridge阴离子交换柱以及SephacrylTM S-300凝胶柱层析提取纯化了非免疫鲫鱼血清IgM,免疫BALB/c鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了6株分泌抗鲫鱼血清IgM单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株,分别命名为A1、C2、C3、F3a、F3b和F3c，Ig亚类分别是IgG1、IgG1、IgG2a、IgG1、IgG1和IgM。用间接ELISA检测,C3和F3a的细胞培养上清液的效价均为1×103,腹水效价为1×108～1×1011；A1、C2、F3b和F3c的细胞培养上清液的效价为1×101～1×102,腹水效价为1×103～4×106。用间接ELISA分析特异性,6株mAbs均为抗鲫鱼血清IgM特异性单克隆抗体。Western blotting表明,6株mAbs在蛋白分子量约79.2kDa处有特异性条带。运用HisTrap Protein G HP亲和层析柱纯化腹水并进行了HRP标记；同时将纯化好的腹水与CNBr活化的琼脂糖凝胶偶联,制备亲和层析柱,纯化鲫鱼血清IgM,SDS.PAGE检测表明,提纯的鲫鱼血清IgM纯度较高,其分子量为837kDa左右,重链分子量为79.2kDa左右,轻链分子量为25.5kDa左右。为了监测免疫动物的抗体水平以及流行病学调查的需要,本试验以灭活Ah J-1为包被抗原,抗鲫鱼血清IgM单克隆抗体作为酶标二抗,建立检测鲫鱼IgM抗体水平的间接ELISA方法。经筛选确定,抗原最适工作浓度为107cfu/mL;血清最佳稀释度为1：160；抗原抗体最佳作用条件为37℃1.5h；酶标二抗最佳工作浓度和反应时间分别为1：200,37℃1.5h；底物的最佳反应时间为15min；血清样品OD450值≥0.208,且P/N≥2.1判为阳性,OD450值≤0.178为阴性；建立的间接ELISA检出下限为1：1280,高于玻片凝集试验的1：320；重复性试验和稳定性试验表明：血清的批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于10%,表明建立的间接ELISA方法具有良好的可重复性和稳定性。运用已建立的间接ELISA方法测定了鲫鱼不同免疫及感染时期血清中IgM抗体水平的动态变化,结果显示：免疫组首免7d未在鲫鱼血清中检测到IgM抗体,8-10d开始出现IgM抗体并呈上升趋势；30-40d血清中IgM抗体水平达到高峰；感染组感染后3d未在鲫鱼血清中检测到IgM抗体,8-10d开始出现IgM抗体并呈上升趋势；20-30d血清中IgM抗体水平达到高峰。以灭活Ah J-1作为检测抗原,兔抗Ah J-1作为竞争抗体,利用竞争原理针对淡水鱼感染嗜水气单胞菌建立了一种快速的间接竞争ELISA检测方法,并对工作条件进行了优化。结果表明：抗原最适工作浓度为107cfu/mL;兔抗血清最佳稀释度为1：5000；酶标二抗最佳工作浓度和反应时间分别为1：5000,37℃1.0h；检测血清的最佳稀释度为1：2；最佳竞争反应时间为1.0h；底物的最佳反应时间为10min。该方法对60份健康鲫鱼血清样品进行检测,并用统计学方法对检测数据进行了分析,确定了阳性值判定标准为：在阴性对照PI<30%情况下,抑制率大于36%为阳性。对实验室感染的60份鲫鱼血清分别用间接竞争ELISA.间接ELISA和凝集试验进行病原体检测,结果表明,建立的间接竞争ELISA检出率为56.7%,比传统的凝集试验(30%)要敏感,虽然没有间接ELISA(66.67%)敏感,但是它能用一种兔的抗体检测不同的血清样品,而不需要针对不同鱼种的二抗,为病原的检测提供方便。同时对临床的93份血清进行检测,阳性率为35.48%,与凝集试验的符合率为89.24%。
陈瑞[3]2007年在《抗嗜水气单胞菌单克隆抗体和抗温和气单胞菌单克隆抗体的制备及鉴定》文中研究表明嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)和温和气单胞菌(Aeromonas sobria，As)分布于世界各地，广泛存在于淡水、咸淡水和污水中，对养殖及野生鱼、虾、蛙、甲鱼等生物有致病性，并可进一步通过食物链感染人，造成人类的腹泻和败血症等。它们所致鱼类等嗜水气单胞菌病和温和气单胞菌病具有流行广、发病快、死亡率高等特点，常常造成养殖渔业的巨大经济损失，严重危害渔业及其它水产业的发展。目前国内外有关嗜水气单胞菌鱼病和温和气单胞菌鱼病的研究多局限于病原微生物学方面，对该病的诊断主要依靠病理观察及细菌学鉴定，两种方法在准确性及检测速度上均有一定限制；防治方面主要利用抗生素或减活、灭活疫苗，安全性和有效性均不理想。鉴于此，本研究设计制备抗嗜水气单胞菌单克隆抗体和抗温和气单胞菌单克隆抗体，为嗜水气单胞菌病和温和气单胞菌病的检测及治疗提供新的技术方法，并为进一步制备其抗独特型单克隆抗体奠定了基础。具体实验方法及结果如下：(1)通过动物免疫、细胞融合、筛选、克隆化及利用ELISA检测技术，制备并鉴定抗嗜水气单胞菌的单克隆抗体(mAb)和抗温和气单胞菌的单克隆抗体(mAb)。获得5株能稳定分泌抗嗜水气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株，分别命名为1A8、1F11、1G10、3F11、4G10。经测定杂交瘤细胞培养上清及其诱生的腹水mAb效价分别为1×10~(-2)～1×10~(-3)、1×10~(-5)～1×10~(-6)。5株杂交瘤细胞系所分泌的单抗亚类是：1F11为IgG1，1A8为IgG2a，1G10、3F11、4G10为IgG2b。其中mAb 3F11经交叉反应试验证明，与弧菌属其它几种细菌均不起反应，特异性强。获得6株能稳定分泌抗温和气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株，分别命名为1A8、2A8、2F11、3C6、3D11、4G2。经测定杂交瘤细胞培养上清及其诱生的腹水mAb效价分别为1×10~(-2)～1×10~(-3)、1×10~(-5)～1×10~(-6)。6株杂交瘤细胞系所分泌的单抗亚类是：2A8、2F11为IgG1，1A8、3D11为IgG2a，3C6为IgG2b，4G2为IgG3。其中mAb 3C6经交叉反应试验证明，与弧菌属其它几种细菌均不起反应，特异性强。它们可分别用于嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的检测及进一步研究。(2)以嗜水气单胞菌和温和气单胞菌分别感染乳鼠为模型。对制备的5株抗嗜水气单胞菌单抗的治疗保护效果进行研究。结果表明：单抗1G10能提高受10LD_(50)剂量嗜水气单胞菌感染乳鼠的存活率，其保护率为62.50％，对乳鼠具有明显保护效果。上述结果提示单抗1G10所针对的可能是嗜水气单胞菌的中和性抗原表位，具有免疫中和或减弱细菌毒性的作用，可用作鱼类嗜水气单胞菌感染的中和性抗体治疗制剂，也可作为制备嗜水气单胞菌抗独特型抗体的理想候选单克隆抗体。对制备的6株抗温和气单胞菌单抗的治疗保护效果进行研究。结果表明：单抗3C6能提高受10LD_(50)剂量温和气单胞菌感染乳鼠的存活率，其保护率为62.50％，对乳鼠具有明显保护效果。上述结果提示单抗3C6所针对的可能是温和气单胞菌的中和性抗原表位，具有免疫中和或减弱细菌毒性的作用，可用作鱼类温和气单胞菌感染的中和性抗体治疗制剂，也可作为制备温和气单胞菌抗独特型抗体的理想候选单克隆抗体。综上所述，本研究利用杂交瘤技术分别制备出多株抗嗜水气单胞菌的单克隆抗体和抗温和气单胞菌的单克隆抗体，利用乳鼠观察了治疗保护效果，分别筛选出1株具有保护作用的细胞株，为嗜水气单胞菌病和温和气单胞菌病的诊断、治疗提供了条件。嗜水气单胞菌单克隆抗体和温和气单胞菌单克隆抗体的研究，国内外迄今未见报道。
潘子豪[4]2009年在《致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的研制》文中指出根据嗜水气单胞菌16srDNA和气溶素序列设计引物,建立双重PCR检测体系。用该方法对本实验室保存的23株嗜水气单胞菌进行检测,与脱脂奶平板检测结果的符合率为100%。在双重PCR基础上,增加嗜水气单胞菌丝氨酸胞外蛋白酶和弹性胞外蛋白酶的引物,建立和优化嗜水气单胞菌的多重PCR检测体系。结果表明已建立的双重PCR检测体系能够覆盖嗜水气单胞菌多重PCR的检测结果,可准确、快速、稳定地鉴别致病性嗜水气单胞菌。根据以上结果,组装致病性嗜水气单胞菌双重PCR检测试剂盒,并起草《嗜水气单胞菌PCR检测试剂盒检验检疫规程》。用该试剂盒检测了从南京地区卫岗,小卫街等四处农贸市场的的200份鱼样和从常熟、兴化、临沂、赣榆、郑州、南京等六个市区多个规模化渔场收集的水样和病料,从中共检测出8株嗜水气单胞菌,其中4株为致病性嗜水气单胞菌。参照GB／T 186522-2002致病性嗜水气单胞菌检验方法,用J-1株胞外蛋白酶EPR2-3重组蛋白高免血清为抗体,优化检测致病性Ah的Dot-ELISA检测方法。用该方法对本实验室保存的23株嗜水气单胞菌进行检测,与双重PCR检测试剂盒的检测结果符合率为91.3%。
王雷[5]2012年在《嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌适体的SELEX筛选》文中提出嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌是水产养殖中比较常见的两种致病病原菌，易引起多种水产养殖动物致病或致死，对水产养殖业造成了重大经济损失，同时对人也有一定的危害。指数富集系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）是一种结合分离、筛选、PCR的组合技术，其模拟达尔文进化过程可筛选到与靶目标结合的适配子。本研究的目的就是利用SELEX技术建立一种快速检测嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌的技术，为两种菌的检测提供了一种新的检测方法。本研究利用体外人工合成一段长为78nt，中间随机序列为35nt，两端为固定序列的寡核苷酸文库，利用已设计出的引物，以嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌为靶目标，利用SELEX法筛选出能分别与嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌特异性结合的适体，并用磁珠富集及地高辛-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统（ELISA），对筛选到的适体进行亲和力测定，最后一轮的筛选产物克隆测序后分别对其一级结构及二级结构进行了研究。1、经过12轮筛选，嗜水气单胞菌的亲和力吸光值由第一轮的0.32升到第9轮的0.72，亲和力提高了2.25倍，利用DNAstar软件分析嗜水气单胞菌的39个克隆子，按照其与预期长度是否一致分为两个群体，与预期长度一致的有33条，与预期长度不一致的只有6条，分析发现保守序列GGTGG存在于所有的39条序列中。对其二级机构分析发现茎环结构存在于所有的二级结构中，这可能是适配子与配体结合的构象结构。对嗜水气单胞菌的39条适配子的二级结构进行分析，按照茎环出现位置的不同可分为7类。在利用39条适配子分别测亲和力的基础上检测出嗜水气单胞菌的最佳适配子，并对嗜水气单胞菌的最佳适体进行了特异性检测，其与嗜水气单胞菌的结合率为0.763，远高于与其他几种菌的结合率，证明了筛选到的适体对嗜水气单胞菌有比较强的特异性。2、经过14轮的筛选后，迟缓爱德华菌的亲和力吸光值由第一轮的0.632上升到第十叁轮的1.799，用DNASTAR、DNAMAN软件分析20条迟缓爱德华菌适体的一级序列与二级结构，20条适体中有17条与预期长度一致，其一级结构主要由GGTGGG、TTTTX、GGAGGX叁条保守序列组成。对迟缓爱德华菌的适配子二级结构按照茎环出现的位置分类可分为5类，通过比较分析其二级结构，发现二级结构原件中环是结合位点，而茎则是稳定结构，二级结构都是以茎环状结构为主，推测茎环结构可能是适配子的结合关键，在二级结构中同样存在着一些口袋结构，这可能是适配子的结合部位。3、针对筛选过程中的纯化步骤做了一个对比发现，选择性纯化筛选到的适配子相比每轮都纯化得到的适配子，其一级序列的同源性更高，同源性100%的序列出现的频率较高。通过二级结构分析发现，每轮纯化筛选到的适配子二级结构按照茎环出现的位置只有5类，而选择性纯化的适配子则有7类，这说明过多的纯化会导致适配子筛选丰富性大大降低，对筛选起着弱化作用。4、筛选到了针对嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌的特异性适配子，并对嗜水气单胞菌的适配子做了特异性验证，发现其与嗜水气单胞菌有了一定的特异性。
肖丹[6]2011年在《射阳盐场地区鲫源嗜水气单胞菌分子流行病学研究》文中研究表明细菌性败血症是银鲫的主要病害之一,此病流行时间长、流行地域广、危害性大,给银鲫养殖户带来了巨大的经济损失。本研究于2009年5月至2010年10月间对射阳盐场地区银鲫细菌性败血症的流行情况进行了调查,并对病原菌进行了分离鉴定,通过分子生物学方法对其进行基因分型,研究其与菌株致病能力及抗原性的关系,以期为银鲫细菌性败血症防控措施的制定奠定基础。本研究主要分为以下4个部分。1射阳盐场地区银鲫细菌性败血症流行病学调查及病原菌分离鉴定2009年5月-2010年10月对射阳地区银鲫细菌性败血症于20℃-34℃开始流行,29℃-33℃为发病高峰,主要危害0.2-0.4kg的当年鱼种及成鱼,分慢性型与急性型两种发病类型,水体中水温、溶氧的变化及较高的亚硝酸盐含量会使疾病病情恶化;从自然患病鱼体上共分离了17株病原菌,鉴定均为致病性嗜水气单胞菌; 17株病原菌生化表型、致病性间存在差异。17株病原菌耐药性严重,对阿莫西林、多西环素、氟苯尼考、土霉素等药物完全耐药;对左氟沙星、恩诺沙星、罗红霉素、新霉素、庆大霉素、复方新诺明、磺胺二甲嘧啶、多粘菌素等药物不同程度耐药。2鲫源嗜水气单胞菌的ERIC-PCR分型方法建立及应用本实验建立了一套嗜水气单胞菌ERIC-PCR分子分型方法,并对PCR体系、反应条件等关键点进行了优化,该方法稳定性好、可有效区分菌株遗传学背景的差异,适用于嗜水气单胞菌分子流行病学研究;用所建立的方法对2009-2010年射阳地区分离的17株致病性嗜水气单胞菌分离株及7株本实验室保藏的分离与其他地区的嗜水气单胞菌进行检测发现,24株鲫源嗜水气单胞菌可聚为3类,分别用A、B、C型表示。其中14株射阳地区分离株与江西株S2、浙江株BSK-10、广东株S3及80916同为B型,其余3株分离株基因型与浙江株H-1同为A型,说明射阳地区与这些地区可能存有致病性嗜水气单胞菌输出或输入现象;本研究还发现,从同一病例中分离的多株致病性嗜水气单胞菌株基因型存在差异,从同一发病池塘不同时间发病病例中分离的致病性嗜水气单胞菌株基因型间存在差异。3鲫源嗜水气单胞菌毒力因子分布及其与基因型的关系本实验建立了一套致病性嗜水气单胞菌5个主要毒力基因多重PCR检测方法,并对PCR体系、反应条件等关键点进行了优化,该方法特异性强、敏感性高、反应结果清晰且易判断,适用于大量样本的快速检测。用所建立的方法对2009-2010年射阳地区分离的17株致病性嗜水气单胞菌进行检测发现,不同菌株间5种毒力基因的携带情况存有差异,毒力基因型为aer+hly+alt+ahp+act+的菌株最多。此外,本研究发现菌株致病力与菌株毒力基因携带情况存在联系,毒力基因组成为aer + hly + alt +ahp +act+菌株毒力高于毒力基因缺失株,可能是急性型细菌性败血症的致病株,而毒力缺失株可能会导致慢性型的细菌性败血症;17株鲫源致病性嗜水气单胞菌分离株的致病力及毒力基因携带情况与ERIC-PCR基因型存有一定的关系,毒力基因型aer+hly+alt+ahp+act+的嗜水气单胞菌分离株ERIC-PCR基因型均为B型具有急性毒性,ERIC-PCR基因型为A型的嗜水气单胞菌分离株的5个毒力基因均有不同程度的缺失,毒性较弱。这表明B型嗜水气单胞菌多可能为强毒株,有必要加强对此类菌株的监测及防控,避免此类强毒株在大范围内流行。4鲫源嗜水气单胞菌抗原性及其与基因型的关系本实验通过研究17株鲫源嗜水气单胞菌的ERIC-PCR基因型与免疫原性进行研究,发现各菌株对同种基因型菌株交叉凝集效价显着高于对不同基因型间菌株的交叉凝集效价,说明ERIC-PCR基因型与菌株免疫原性间存一定关系,ERIC-PCR方法经标准化后可以传统克服血清分型法受到标准菌株限制、存在大量不可分型株、实验室间难以比较等缺点,成为嗜水气单胞菌疫苗株的筛选分析的新途径,为嗜水气单胞菌多价疫苗、亚单位疫苗的开发及疫苗预期效果评价奠定基础。
夏君[7]2009年在《应用ELISA方法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌》文中指出本实验分别提取了嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌外膜蛋白(OMPs)作为抗原免疫健康新西兰白兔,制备了兔抗血清。根据ELISA原理,分别设计了常规的间接ELISA和Dot-ELISA法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌。实验确定了两种ELISA方法的最佳优化条件、检测灵敏度、检测特异性、重复性和稳定性,并利用两种ELISA法和玻片凝集法检测了人工感染嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌的草鱼样品和野外采集的草鱼样品。研究结果如下:1.利用间接ELISA法对所制备的嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌兔抗血清进行效价分析,其效价均为1:32000,可用于后面的ELISA实验工作。实验所确定的间接ELISA最佳反应条件为:针对两种细菌的兔抗血清最佳稀释度均为1:5000,抗原的最佳浓度为分别为1×10~7 cfu/mL(嗜水气单胞菌)和1×10~6 cfu/mL(柱状黄杆菌);CBS(0.05 mol/L,pH 9.6)为理想的包被液;最佳酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)稀释倍数为1:10000;抗原抗体最适反应时间、酶标二抗最适反应时间、底物最适反应时间分别为1h、1.5h和15min;最佳包被条件为37℃湿盒包被2h。在最佳优化条件下,利用间接ELISA检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌的最低检测限分别达到1.0×10~5 cfu/mL和5.0×10~4 cfu/mL,且该方法与水产常见致病菌副溶血弧菌、哈维氏弧菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌无交叉反应,具有较好的敏感性和特异性,同时,阻断实验也表明两种抗血清分别对嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌具有良好的特异性,且重复性较好。2.实验所确定的Dot-ELISA最佳反应条件为:最佳包被液为CBS(0.05 mol/L,pH 9.6);针对两种细菌的兔抗血清和酶标二抗的最佳稀释度均为1:500、1:1000;抗原抗体最适反应时间、酶标二抗最适反应时间、底物最适反应时间分别为60min、60min和15min;最佳包被条件为常温干燥1h或点样后37℃干燥1h。在最佳优化条件下,利用间接ELISA检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌的最低检测限分别达到1.0×10~4 cfu/mL和5.0×10~3 cfu/mL,表明该法的检测灵敏度较常规间接ELISA法要高,且该法具有较好的特异性、重复性和稳定性。3.间接ELISA、Dot-ELISA和玻片凝集试验同时检测人工染病草鱼和野外采集的草鱼样品。确认肠道和鳃分别是检测感染嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌后较为理想的病原检测组织。间接ELISA、Dot-ELISA和玻片凝集试验(样品增菌后)对野外采集样品中嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌的检测阳性率均分别为20.0%、26.7%,几种方法的检测符合率为100%。以上结果表明,本研究所建立的两种ELISA法能对嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高的优点,尤其是Dot-ELISA法不需借助其他的实验仪器就能完成整个检测过程,更具实用价值。
任燕[8]2005年在《致病性嗜水气单胞菌的检测与一种温敏胞外蛋白酶基因的克隆、表达及其免疫性研究》文中指出在鱼类致病性气单胞菌诊断试剂盒的基础上,用Dot-ELISA检测致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)胞外蛋白酶,同时扩增Ah的16S rDNA和aer基因。脱脂奶平板法、Dot-ELISA与PCR扩增检测72株分离株,Dot-ELISA、脱脂奶平板法、aer基因扩增和16S rDNA扩增检测的阳性率分为90.3%(65/72)、75%(54/72)、94.4%(68/72)、81.9%(59/72)。Dot-ELISA与脱脂奶平板法两者符合率为79.2%(57/72),与aer基因扩增的符合率为91.6%(66/72),与16S rDNA扩增的符合率为81.9%(59/72)。Dot-ELISA试验用批内、批外的试剂盒重复3次结果一致。这表明Dot-ELISA检测具有敏感、特异、实用的特点,可用于鱼类致病性Ah的临床诊断。 根据已发表的人源Ah温敏胞外蛋白酶基因eprAl的核甘酸序列,设计合成一对引物,以Ah J-1基因组DNA为摸板,通过PCR扩增得到1005bD的温敏胞外蛋白酶基因eprCAI,从第90个碱基开始编码蛋白质,有305个氨基酸。将该基因片段连接到pMD18-T载体中,构建克隆载体pMD-eprCAI。序列分析发现与发表的Ah AH1的胞外蛋白酶eprAl基因的同源性有91%,有较高的抗原性。根据测序结果重新设计一对引物,检测21株Ah。建立检测Ah eprCAI的PCR方法。检测灵敏度可达1.5×10~(-3)g/L的模板DNA。 根据eprCAI基因测序结果,在其ORF阅读框内设计编码成熟蛋白的引物进行PCR扩增。得到850bp目的产物,经EcoRI+SalI双酶切后以正确阅读框架定向克隆于经同样双酶切的pET-32a(+)中,转化表达宿主菌BL21。该菌株经IPTG诱导可表达分子量约53.2kD的特异蛋白,占菌体总蛋白的42%。在30℃和37℃诱导分别产生以可溶性和包涵体为主的特异蛋白。诱导后,重组菌冻融液在脱脂奶平板上经28℃24h孵育可见透明的溶蛋白圈,即有蛋白酶活性,而经56℃30min处理后则无溶蛋白圈出现。免疫转印显示Ah J-1胞外产物的抗血清可以识别该融合蛋白,表明该重组蛋白具备天然蛋白的抗原性,但Ah J-1的胞外金属蛋白酶ECPase54抗血清不能识别该融合蛋白。用50LD_(50)的Ah J-1菌体(10~7CFU)及过滤除菌后的培养上清,分别腹腔注射免疫后的小鼠,则融合蛋白的相对保护率均为60%。
王春瑞[9]2011年在《嗜水气单胞菌的分子流行病学调查及其两种分型方法的研究》文中研究说明致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)可引起水产动物传染性、爆发性疾病,在我国淡水养殖发达的华东地区,每年由此菌引起的淡水鱼类流行性疾病给该地区养殖业造成的经济损失尤为严重。为阐述华东地区主要淡水养殖鱼类嗜水气单胞菌病的分子流行病学特征,本研究采用传统流行病学调查与分子生物学技术相结合的方法进行了嗜水气单胞菌的分离鉴定、分型及其分子流行病学等方面的研究。主要研究工作包括如下几个部分:2009年4月~2009年11月,采用实地采样、调查等方法,跟踪调查了华东地区的11个淡水养殖场主要养殖鱼类嗜水气单胞菌病的发病及流行情况,并对所分离病原菌进行了致病性嗜水气单胞菌的双重PCR鉴定。结果表明:嗜水气单胞菌自4月至11月均有检出;相关疾病发病率达73%,发病范围广,7~9月为疾病高发期,发病后平均死亡率为20%~30%;对团头鲂、鲫鱼等危害最为严重。发病原因主要由于夏、秋季节持续高温使得嗜水气单胞菌大量滋生,加之鱼种放养密度过高,养殖水体环境恶化,养殖区域过度密集等,诱发了疾病的广泛流行。以O:5典型菌株BSK-10和O:9典型菌株TPS-30制备相应O抗原血清,并以此对分离、鉴定出的35株致病性嗜水气单胞菌进行血清分型。结果表明:O:5血清型菌株5株,O:9血清型菌株12株,非O:5或O:9菌株18株;O:5、O:9广泛分布于浙江、江苏、安徽等地,两种血清型菌株在鲢、鳙、鲫、鳊等宿主鱼类上均有分离,且以嗜水气单胞菌病高发的夏、秋季更为多见。采用ERIC-PCR技术对分离、鉴定的35株致病性嗜水气单胞菌进行指纹图谱分型分析,进一步从基因水平上描述我国华东地区鱼源嗜水气单胞菌的流行病学特征。结果表明:在聚类重新标定距离为10的水平下,可以把35株菌归为5个类群,而E1类群可能是当前我国华东地区鲤科鱼类病原性嗜水气单胞菌的优势基因型类群;菌株基因型的地域性差异明显;菌株基因型无明显宿主差异,说明鲫、鳊、鲢、鳙的嗜水气单胞菌相关疾病的病原菌是一致的;不同季节的流行性基因型类群菌株有所不同。与传统血清分型方法相比,ERIC-PCR耗时少,操作简便,图形重复性和分辨率好,能够据此对所有菌株进行基因水平差异与关联上的分析,可作为一种实用的手段应用于嗜水气单胞菌分子流行病学调查与监测。该研究对把握我国华东地区鱼源嗜水气单胞菌的流行病学特征有重要意义,可为制备针对性更强的疫苗提供科学依据,也为临床进行该病原菌的诊断与监测提供可靠方法。
夏飞[10]2012年在《团头鲂源嗜水气单胞菌分离鉴定、检测及绿色荧光蛋白标记菌株的构建》文中提出团头鲂(Megalobrama amblycephala),俗称武昌鱼,是全国推广的淡水养殖优良品种,由于集约化养殖技术的发展,现在养殖密度越来越高,导致生态环境恶化,各种病害接踵而至,并呈现大规模暴发和流行的趋势,给团头鲂养殖业带来了严重的经济损失。2011年江苏省常州市武进区养殖的团头鲂出现大量死亡,病鱼主要表现为行动缓慢,摄食量少,浮头,鱼体表出血严重。从患病的团头鲂肝脏中分离得1株优势菌记为WJ-8。将菌WJ-8进行人工回感试验,其患病症状同自然发病症状,证明其对团头鲂有致病性。该菌的形态特征、主要理化特性、16S rRNA序列测定结果及系统发育树的构建表明该菌株为嗜水气单胞菌。药敏试验结果显示,该菌对氟苯尼考、甲哌利福霉素、链霉素、卡那霉素等21种药物敏感,对青霉素、氨苄西林、羧苄青霉素、苯唑西林等12种药物表现出耐药性。运用石蜡包埋及组织切片技术对发病团头鲂以及健康团头鲂的肝脏、肾脏以及脾脏叁种组织进行了病理学研究,病症主要表现为：叁种组织中均有部分细胞核固缩或肿胀,细胞破损、坏死,肾脏以及脾脏组织中有铁血黄素沉着。根据GenBank收录的细胞兴奋性肠毒素(alt)基因和气溶素结构基因(aerA),依据嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)保守序列分别设计能检测alt和aerA基因的特异性引物,并进行PCR反应体系和反应条件的优化。建立了一种快速检测嗜水气单胞菌双重PCR方法。结果显示,在同一PCR反应体系中,供试菌株嗜水气单胞菌扩增2条目的条带,扩增产物的片段大小分别为200bp和280bp,而对照菌株温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、(?)鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、河流弧菌(Vibrio fluxialis)勺PCR扩增则没有条带检出。敏感性试验结果显示,该双重PCR最低能检测3×104CFU/mL菌体浓度的嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌模板DNA的检出极限为49fg/μL；对嗜水气单胞菌的强毒株、弱毒株以及无毒株也进行了试验,发现强毒株以及弱毒株有目的条带；同时对送检的患病水产品进行抽检,检测出阳性结果的样品均可分离到优势生长的嗜水气单胞菌。结果证实,试验所建立的基于2种基因的双重PCR方法快捷、灵敏,为今后由于该菌所引起的水产动物疾病的检测提供了参考依据。利用生产中常用的10种药物分别进行了其对分离菌的MIC以及MBC测定,试验结果表明盐酸金霉素对分离菌株的抑菌效果以及杀菌效果最好,分别为2μg/mL、4μg/mL;其次为氟苯尼考、恩诺沙星以及硫酸链霉素,这3种抗菌药物的最小抑菌浓度以及最小杀菌浓度均小于10μg/mL.实验以绿色荧光蛋白质粒pEGFPuv (Clontech)为基础,通过抗性基因改造构建了荧光粒pEGFPuv-Kar。通过电击转化法成功导入到嗜水气单胞菌株WJ-8中并且得以表达。质粒在嗜水气单胞菌WJ-8中的稳定性检测结果显示直至接种第12次质粒稳定性为100%,至第21次,质粒稳定性降为5%。WJ-8GFP的人工回感试验结果与WJ-8的人工回感试验相一致,表明将绿色荧光蛋白基因质粒导入嗜水气单胞菌中没有降低其致病力。利用绿色荧光蛋白基因标记的嗜水气单胞菌WJ-8GFP对团头鲂进行腹腔注射,观察其在6h、12h、24h、36h、48h时间段内在团头鲂各组织中的分布情况,发现脾肾为主要的侵染器官,其中肾脏遭受攻击最为严重；菌株WJ-8GFP在12h时对各组织器官的侵染达到最高峰。
参考文献：
[1]. 嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌多重PCR检测方法的建立与应用[D]. 饶静静. 南京农业大学. 2007
[2]. 鲫鱼IgM单克隆抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体ELISA检测方法的建立[D]. 臧明发. 南京农业大学. 2011
[3]. 抗嗜水气单胞菌单克隆抗体和抗温和气单胞菌单克隆抗体的制备及鉴定[D]. 陈瑞. 第四军医大学. 2007
[4]. 致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的研制[D]. 潘子豪. 南京农业大学. 2009
[5]. 嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌适体的SELEX筛选[D]. 王雷. 集美大学. 2012
[6]. 射阳盐场地区鲫源嗜水气单胞菌分子流行病学研究[D]. 肖丹. 上海海洋大学. 2011
[7]. 应用ELISA方法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌[D]. 夏君. 华中农业大学. 2009
[8]. 致病性嗜水气单胞菌的检测与一种温敏胞外蛋白酶基因的克隆、表达及其免疫性研究[D]. 任燕. 南京农业大学. 2005
[9]. 嗜水气单胞菌的分子流行病学调查及其两种分型方法的研究[D]. 王春瑞. 宁波大学. 2011
[10]. 团头鲂源嗜水气单胞菌分离鉴定、检测及绿色荧光蛋白标记菌株的构建[D]. 夏飞. 南京农业大学. 2012
标签：水产和渔业论文; 特异性论文; 单克隆抗体技术论文; 基因合成论文; 基因结构论文; 基因型论文; elisa论文;