储俐 郑燕林 李妍 马素红
（成都中医药大学 四川 成都 610075）
【摘 要】目的：观察在凝血酶诱导下水蛭提取液对恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A)表达TNF-a的影响 ，从而初步探讨中药水蛭防治视网膜新生血管的作用机制。方法：采用消化培养法，对RF/6A细胞进行体外传代培养，选择20U/ml的凝血酶作为诱导浓度，分别作用2,4,6,8,10,12,24小时，观察凝血酶诱导下细胞因子TNF-a的分泌量。观察在有或无凝血酶诱导下水蛭提取液（64mg/ml）对RF/6A细胞表达TNF-a的干预。结果：水蛭提取液对有凝血酶诱导组和单独干预组都能抑制RF/6A细胞TNF-a的表达（p<0.05）。结论：中药水蛭提取液通过抑制细胞因子TNF-a的释放从一定程度上对视网膜新脉络膜生血管性疾病能起到防治作用。
【关键词】水蛭提取液；凝血酶；RF/6A细胞；TNF-a
【中图分类号】R774.1+3 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0657-02
1 引言：
视网膜新生血管（retinal neovascularization）病变，能导致严重的中心视力损害，目前临床治疗方法有手术切除、黄斑转位、激光光凝、光动力疗法等，但是一旦视力受损，在大多数治疗中视力恢复受限，而且这些治疗费用不菲。
视网膜新生血管的形成是一个复杂的过程, 涉及多种细胞因子的调控, 其确切机制目前仍不清楚。但是，血管内皮细胞起着十分关键的作用【1】。血管内皮细胞周围充满着血管生成促进因子和抑制因子，这些因子在正常情况下处于平衡状态，一旦平衡打破，则导致局部新生血管的产生【2】。视网膜新生血管病变伴随眼底反复出血，随着出凝血过程，凝血酶的出现会诱导细胞因子如TNF-α的分泌【3】，从而打破血管生成促进因子和抑制因子的平衡，进一步诱导视网膜新生血管生成。
几千年来的临床实践中祖国医学对视网膜新生血管性疾病的防治有一定的见解和疗效。视网膜新生血管性疾病属中医眼底血症范畴，其治则以化瘀为要，现代眼科医家的临床治疗中祛瘀法也贯穿了眼底血症治疗始终[8-10]。水蛭是逐瘀要药，其在临床运用广泛且逐瘀疗效肯定。但其作用机制目前尚不清楚。因此，本研究观察水蛭提取液在有或无凝血酶诱导下对恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞（rhesus choroid-retinal endothelial cell, RF/6A）分泌TNF-a的影响，从一方面来探讨中药水蛭对视网膜新生血管性疾病的防治作用机制。
2 材料和方法
2.1材料
2.1.1 RF/6A细胞： RF/6A细胞购自上海中国科学院细胞库。
2.1.2主要试剂：RPMI 1640培养基（Gibco BRL，美国），特级胎牛血清（北京元亨公司，中国），胰蛋白酶（Gibco BRL，美国），凝血酶（Sigma公司，美国），中药水蛭提取液（成都中医药大学附属医院制剂科，批号：2007030201），TNF-a酶联免疫试剂盒（Sigma公司）等。
2.1.3主要实验器材：型超净工作台（Heraeus公司，德国），CO2培养箱（Sanyo公司，日本），Herzeus varifuge 3.0RS型低速离心机（Kendro公司，美国），1-13型高速离心机（Sigma公司，美国），550型酶标仪（Biorad公司，美国），MO -18型倒置像差显微镜（Olympus,日本）等。
2.2方法
2.2.1 RF/6A细胞的传代培养及鉴定：
用RPMI1640培养基消化培养RF/6A细胞。取2代细胞，采用VIII因子相关抗原免疫组化法进行细胞鉴定。结果显示，细胞膜表面见棕黄色阳性颗粒，证实细胞类型为血管内皮细胞。
图4细胞膜表面见棕黄色阳性颗粒（第VIII因子相关抗原） 光学显微镜 100×
2.2.2 凝血酶诱导RF/6A细胞表达TNF-a的测定：
选取指数生长的RF/6A细胞，按3×104 cells /ml的单细胞悬液，每孔200ul接种于96孔培养板，加入20 U/ml凝血酶溶液，空白组只加入RPMI1640，分别培养2，4，6，8，10，12，24小时。取上清液，离心后分装于EP管。建立标准曲线，取EP管中细胞培养上清液，每孔100ul注入Ⅰ抗包被的96孔板。弃板内液，每孔100ul依次加入抗TNF-α抗体，置孵箱反应60min。洗板3次后加入ABC液，置孵箱反应60min。再洗板5次，加入TMB显色液，加盖，置孵箱避光反应10min。加入TMB终止液。用酶标仪在450nm测定O.D.值。酶标仪在450nm测定O.D.值。
2.2.3水蛭对有无凝血酶诱导下RF/6A细胞表达TNF-a的影响的观察：
取指数生长的RF/6A细胞，按3×104 cells /ml接种于96孔培养板，培养24小时。弃原培养液，加入无血清RPMI1640培养液，培养24小时，使细胞相对同步化。弃原培养液，随机分成空白对照组（只加入RPMI1640培养液），凝血酶组（加入以RPMI1640培养液配制的20U/ml凝血酶溶液），水蛭提取液组（加入以RPMI1640培养液配制的水蛭提取液64mg/ml）和凝血酶水蛭共同干预组（同时加入凝血酶溶液以及水蛭提取液），同时孵育10小时。取上清液，离心后分装于EP管。建立标准曲线，取EP管中细胞培养上清液，以每孔100ul注入Ⅰ抗包被的96孔板。弃板内液，每孔100ul依次加入生物素抗TNF-α抗体，置孵箱反应60min。洗板3次后加入ABC液，置孵箱反应60min。再洗板5次，加入TMB显色液，加盖，置孵箱避光反应10min。加入TMB终止液。酶标仪在450nm测定O.D.值。
3 统计学方法
数据结果以SPSS11.5统计软件进行统计学处理。P<0.05，有统计学意义。
3.1实验数据计量资料用均数±标准差（ ）表示。
3.2组间差异性比较用单因素方差分析。多组间两两比较用S-N-K检验。
3.3不同时间点两组组间及组内比较采用重复测量资料的方差分析。
4 结果
4.1凝血酶对体外培养的RF/6A细胞表达TNF-a的影响。
各组RF/6A细胞分泌TNF-α的OD值分析结果（n=6）
凝血酶组与空白组相比，TNF-α的分泌升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。水蛭提取液组和凝血酶水蛭提取液共同干预组与空白组相比，TNF-α的分泌均降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。
4 讨论
国外前期研究表明，凝血酶在细胞内功能的发挥主要依赖细胞表面的凝血酶受体即蛋白酶活化受体（ protease-activated receptor，PAR）,凝血酶与 PAR-1结合后引起受体激活【4】。进一步导致蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活【5】。使IkB磷酸化降解，与 NF-kB解离，暴露 NF-kB的核识别位点，使NF- kB进入核内，促进TNF-α基因的转录。本实验结果显示，凝血酶组TNF-α的含量在2，4，6，8，10小时比空白对照组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。这与国外的研究报道有相似之处【6】。凝血酶组RF/6A细胞分泌TNF-α的含量在10小时达高峰。因此本实验选用10小时作为后续的药物干预时间。
但是，本实验结果表明，当作用时间达12、24小时时凝血酶组与空白组TNF-α的含量间差异无统计学意义。因为在体内NF-kB 的激活过程受反馈调节【7】。负反馈调节：当细胞内 NF-k B激活时，胞质内IkB的mRNA 表达和蛋白合成增强。有可能12小时是负反馈调节的节点，这还有待进一步深入研究证实。
水蛭是中医眼底血症常用的活血化瘀要药，特别是在死血期和干血期的运用，临床有肯定疗效【8-10】。但是其机制并不清楚。过去20年的广泛深入研究发现，水蛭素含有与凝血酶受体相似的结构，它能与凝血酶结合从而阻止了凝血酶与其活性受体PAR-1的结合，从源头上阻断了TNF-α的分泌【11】。本次实验采用ELLISA法测量了，在凝血酶诱导下水蛭对RF/6A细胞分泌TNF-a的影响，其结果为TNF-a的分泌较空白组减少，表明在凝血酶诱导下水蛭提取液能够抑制RF/6A细胞对TNF-α的分泌。但是，水蛭提取液单独干预下RF/6A细胞对TNF-α的分泌较空白组减少（P<0.05），表明了在没有凝血酶诱导情况下水蛭提取液也能够抑制RF/6A细胞对TNF-α的分泌。这也从一定程度上证实了水蛭对视网膜新生血管性疾病的预防作用。其机制有可能与内皮细胞分泌TNF-α的关键物PKC、PKA的激活有关，也有可能与其他途径有关。这还有待于其后的更进一步的研究。
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作者简介：
储俐，女，1981年出生,成都中医药大学在读博士，眼科主治医师，研究方向：眼底病中医药防治，
基金项目：
中国国家博士点基金资助课题(编号：20050633003)
论文作者:储俐,郑燕林,李妍,马素红
论文发表刊物:《河南中医》2015年8月
论文发表时间:2016/6/1
标签：凝血酶论文; 水蛭论文; 细胞论文; 视网膜论文; 血管论文; 诱导论文; 提取液论文; 《河南中医》2015年8月论文;