刘宏, 侯凡凡, 梁敏, 蒋建平, 张训[1]2001年在《晚期糖基化终产物修饰蛋白刺激人血管内皮细胞表达粘附分子的研究》文中研究指明为探讨透析相关性淀粉样变 (DRA)时血管内皮细胞粘附分子表达上调的机制 ,采取分离正常人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) ,将晚期糖基化终产物 (AGE)修饰的人血清白蛋白 (AGE HSA)、人血清白蛋白 (HSA)与HUVEC在体外共同培养的方法 ,并用荧光单克隆抗体染色 ,流式细胞仪定量检测内皮细胞表面细胞间粘附分子 1(ICAM 1)、血管细胞间粘附分子 1(VCAM 1)、E 选择素 (E selectin)的表达。结果显示 ,正常人脐静脉内皮细胞表达ICAM 1和VCAM 1,但无E selectin的基础表达。AGE HSA能以时间和剂量依赖的方式上调血管内皮细胞粘附分子ICAM 1、VCAM 1、E selectin的表达 (P <0 .0 5 ) ,而HSA对血管内皮细胞上述粘附分子的表达均无影响。提示AGE能上调血管内皮细胞粘附分子的表达 ,从而促进DRA时单核 /巨噬细胞的浸润。
刘宏[2]2000年在《晚期糖基化终产物刺激人血管内皮细胞表达粘附分子》文中认为目的 单核/巨噬细胞浸润是透析相关性淀粉样变（DRA）的重要病理组织学征象。DRA病人关节滑膜血管内皮细胞粘附分子表达增强，并与局部单核细胞浸润密切相关。本文旨在探讨DRA时血管内皮细胞粘附分子表达上调的机制。方法 分离正常人脐静脉内皮细胞（HUVEC），将晚期糖基化终产物（AGE）修饰的人血清白蛋白（AGE-HSA）、人血清白蛋白（HSA）以及RPMI-1640完全培养基与HUVEC在体外共同培养，用荧光单克隆抗体染色，流式细胞仪定量检测内皮细胞表面细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、血管细胞间粘附分子-1（VCAM-1）、E-选择素（E-Selectin）的表达。结果 正常人脐静脉内皮细胞表达ICAM-1和VCAM-1，但无E-selectin的基础表达。AGE-HSA能以时间和剂量依赖的方式上调血管内皮细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的表达（p＜0.05），而HSA及RPMI-1640完全培养基对上述血管内皮细胞粘附分子的表达均无影响。结论 AGE 能上调血管内皮细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的表达，是DRA时单核/巨噬细胞浸润的重要分子生物学机制。
梁敏[3]2000年在《二羰基化合物对人类血管内皮细胞的病理生物学作用及其机制的研究》文中认为二羰基化合物是体内糖化、氧化反应的中间产物，包括3-脱氧葡糖醛酮（3-deoxyglucosone，3-DG）和甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）等，这类物质在慢性肾衰和糖尿病循环内蓄积已被证实。二羰基化合物作为前体物质，能够加速晚期糖基化终产物的形成，故被认为是间接致病物质。近年发现，二羰基化合物自身对巨噬细胞、神经细胞和胰岛细胞等具有较强的病理生物学作用。本研究旨在观察3-DG和MGO对人血管内皮细胞存活和粘附分子表达的影响，并对其作用机制进行探讨。选择体外培养的人脐静脉血管内皮细胞为靶细胞，以不同浓度3-DG和MGO与人血管内皮细胞孵育，观察细胞凋亡和生物功能变化。通过普通光镜、透射电镜观察细胞的形态改变，用荧光原位末端标记（TUNEL）法证实凋亡细胞，以FITC标记Annexin-Ⅴ和碘化丙啶染色、流式细胞仪定量测定凋亡细胞和死亡细胞。应用间接免疫荧光标记、流式细胞仪检测细胞表面ICAM-1和VCAM-1的表达；以氧化敏感的荧光探针（2，7-二氢二氯荧光素，DCFH）染色，经流式细胞仪测定细胞内氧化水平；应用间接免疫荧光法，观察细胞转录因子NF-κB的移位活化。结果显示：人血管内皮细胞与3-DG和MGO孵育后，观察到以下变化：（1）细胞出现凋亡的形态学改变且TUNEL阳性，凋亡细胞数量与3-DG和MGO呈时间和剂量依赖关系；（2）细胞表面ICAM-1和VCAM-1的表达上调，ICAM-1表达的高峰出现于刺激后12小时左右，VCAM-1的表达于6小时即达峰值；（3）细胞内氧化水平明显升高，并呈时间和剂量依赖关系；（4）正常状态下位于细胞质中的NF-κB被活化，转移进入细胞核；（5）羰基化合物清除剂（氨基胍）和抗氧化剂（N-乙酰半胱氨酸和丙丁酚）能够抑制3-DG和MGO造成的细胞调亡、粘附分子表达上调以及氧化应激和 NF－K B活化。以上结果表明，H＄基化合物通过引起人血管内皮细胞氧化应激，直接损伤血管内皮细胞并改变细胞的生物功能，该类物质在循环内蓄积可能参与了慢性肾衰和糖尿病加速性血管病变的形成。
张玉凤[4]2016年在《SIRT1和HMGB1在AEGs诱导的视网膜色素上皮细胞炎症反应中的作用研究》文中认为糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见的微血管病,也是成人常见的致盲眼病。糖尿病的发生发展从视网膜微血管病变,微血管渗漏,出现视网膜缺血缺氧,造成大量无灌注区形成,最后形成视网膜新生血管的增值性病变,导致视力严重下降。DR的发病机制复杂,包括多元醇通路流量增加、蛋白激酶C激活、己糖胺途径流量增多等途径,以及晚期糖基化终末产物增加,晚期糖基化终产物(AGEs) AGEs积聚在糖尿病视网膜血管细胞、神经元和神经胶质细胞导致DR的发病。第一部分AGEs干预后的ARPE-19细胞中HMBG1和SIRT1的表达目的：通过检测AGEs干预下的ARPE-19细胞中HMGB1、SIRT1的表达,探讨其在DR发病机制中的作用方法：AGEs与ARPE-19细胞共同孵育4,8,12小时后PCR检测细胞中TNF-α,IL-1,IL-6、MCP-1、RANTES和IP-10以及HMGB1、SIRT1mRNA的水平,24h后western blot分析HMGB1、SIRT1蛋白水平。结果：与对照组相比实验组炎性细胞因子白细胞介素1、白细胞介素6以及肿瘤坏死因子mRNA表达上调,两组间比较差异有统计学意义,并且随着AGE剂量的增加,两组间差异更加显著；与对照组相比实验组HMGB1mRNA及蛋白表达上调,两组间HBMG1mRNA表达差异有统计学意义；与对照组相比实验组SIRT1mRNA、蛋白水平及活性下调,两组间表达差异有统计学意义。结论：结果表明,应用AGEs作用后促进了TNF-α, IL-1, IL-6、MCP-1、RANTES和IP-lOmRNA表达,呈剂量依赖。AEGs治疗也显著促进HMGB1在mRNA和蛋白水平的表达,呈剂量依赖性,同时降低了SIRT1的活性和蛋白表达。第二部分HMGB1基因下调对AGEs诱导的炎性细胞因子和趋化因子的影响目的：构建慢病介导的短发夹RNA下调HMGB1的表达,观察其对AGEs介导的TNF-α,IL-1,IL-6、MCP-1、RANTES和IP-10的影响方法：设计并合成可抑制HMGB1表达的sh RNA,转染进入不同条件下的ARPE-19细胞。利用RT-real-time PCR方法检测TNF-α, IL-1, IL-6、MCP-1、RANTES和IP-lOmRNA的表达情况。结果：与空白对照组比较,外源性HMGB1能显著提高IL-1β mRNA的表达。外源性HMGB1组,敲除HMGB1对IL-Iβ表达无统计学差异。在AGEs组,敲除HMGB1能显著降低IL-1 β mRNA的表达。对白细胞介素6、肿瘤坏死因子及趋化因子的检测也得出相同结果。结论：下调HMGB1的表达能介导AGE诱导的炎性细抑制胞和趋化因子的表达第三部分SIRT1激活剂与抑制剂对HMGB1的影响目的：了解在AGE诱导的ARPE-19中炎性反应中SIRT1和HMGB1的关联。方法：通过SIRT1的激活剂和抑制剂来调节SIRT1的活性。分别用RSA(即白藜芦醇,SIRT1激活剂)和Sirtinol(SIRT1抑制剂)作用AGE干预的ARPE-19细胞,然后做PCR/Western blot分析。结果：RSA和Sirtinol对AGE作用的ARPE-19细胞SIRT1、HMGB1mRNA水平表达无影响。sirtinol激活了AGE诱导IL-1和IL-6mRNA的表达,而RSV则抑制了二者的表达。Sirtinol增加了胞浆HMGB1,但抑制了细胞核HMGB1的蛋白水平,RSV则是抑制了细胞质HMGB1蛋白水平,增加了细胞核HMGB1蛋白水平。结论：SIRT1可能通过抑制HMGB1从胞浆到细胞核的迁移和释放,调节AGE诱导的致炎细胞因子和趋化因子。
郭志坚[5]2002年在《晚期糖基化终产物修饰的蛋白质对人血管内皮细胞的病理生物学作用及其机制的研究》文中研究表明研究背景 心血管疾病是终末期肾脏病(ESRD)患者最常见的并发症。ESRD病人心血管疾病的死亡率是一般人群16.6-17.7倍。据美国肾脏病资料系统(USRDS)1999年统计，由心血管疾病所致的死亡占ESRD总死亡率的45％。我国ESRD的原发病因和年龄分布与西方国家有很大差异，但同年中华肾脏病学会透析移植登记报告表明，ESRD病人由心血管疾病所致的死亡率亦高达50％。因此，心血管疾病已成为影响ESRD病人生存率和致残率的最为重要的因素。 ESRD病人心血管疾病的发生率较一般人群高5～10倍。这类病人心血管病的发生率明显高于一般人群，发病年龄明显提前，被称之为“加速型动脉粥样硬化”。尽管导致心血管疾病的原因尚未完全阐明，但近10年临床流行病学研究已使我们对ESRD时心血管疾病的危险因素有了更深入的了解。已证实，ESRD病人存在多种导致心血管疾病的危险因素，包括高血压、糖尿病、高脂血症等见于一般人群的传统危险因素和一些与慢性尿毒症有关的因素，诸如贫血、容量负荷过度所致的血流动力学障碍以及低白蛋白血症、高同型半胱氨酸血症、氧化应激、炎症状态、二价离子紊乱等与尿毒症有关的代谢紊乱。因此，ESRD本身被认为是一种“血管病变状态”(vasculopathic state)。 我们和国外的研究表明，ESRD患者的循环晚期糖基化终产物（AGE）水平异常增高，在罹患有动脉粥样硬化的ESRD患者的血管壁中也检查到了AGE沉积。AGE是蛋白质氨基组与糖的醛基组之间非酶性糖化氧化反应的终产物。反应初期生成SChiff碱，经重排后生成相对稳定的酮胺，亦即inadori产物。后者进一步经过脱水、环化、氧化井重排后生成AGE。在体外试验中，AGE修饰蛋白具有促进内皮细胞表达粘附分于ICAM－l、VCAM－l及E－选择素，增加内皮通透性，降低内皮细胞一氧化氮合成酶（eNOS）活性、缩短 eNOS InRNA半衰期等作用。这些研究提示，AGE是一种对内皮细胞有重要病理生理作用的尿毒症毒素。 慢性肾功能衰竭时加速型动脉粥样硬化（AS）的发病机制目前尚未完全清楚，但近期研究结果表明，AS的本质是炎症反应。AS发病早期可分为两个阶段：（1）首先是在各种致病因素的作用下，内皮细胞的功能发生紊乱。内皮细胞合成释放的一氧化氮（NO）对于内皮细胞维持血管稳态具有非常重要的作用。NO是目前已知最重要的内皮细胞衍生的血管舒张因子，除血管扩张作用外，NO还对血管有多种作用，包括维持血管弹性，抑制由ADP诱导的血小板聚集并有效解聚血小板，抑制血小板、淋巴细胞、粒细胞和单核细胞粘附于血管内皮等。这些作用使NO成为一种重要的防护AS形成的因素。内皮细胞NO生成量或NO水平的变化必然会影响血管的正常防护机制，导致血管的结构和功能异常。而在AS患者，往往有NO的合成障碍，使得内皮细胞同血小板、炎症细胞的粘附性增加。（2）第二阶段，在内皮细胞表达释放的单核细胞趋化因子（MCP．l）以及粘附分子的作用下，单核细胞在受损伤区域聚集且向内皮下迁移，并同时也分泌MCP－l，使局部MCP－l浓度进一步增高，更多的单核细胞被吸引，从而使炎症反应放大。鉴于 NO和 MCPl在AS发病过程中的重要作用，我们假设，ESRD患者升高的AGE修饰蛋 2白可能通过对内皮细胞NO生成及MCP表达的影响，促进了ESRD患者心血管疾病的发生。本研究旨在观察AGE修饰蛋白对人血管内皮细胞合成、分泌一氧化氮（NO）和单核细胞趋化因于－l（MCP－l）的影响，并对上述作用的细胞内信号转导通路及分子机制进行探讨。研究方法 我们选择体外培养的人脐静脉内皮细胞及内皮细胞株ECV304为靶细胞，采用如下的方法观察AGE了修饰蛋白对血管内皮细胞功能的影响： 1．AGE修饰蛋白对内皮细胞合成NO的影响。门）内皮细胞接种在96孔培养板上，在无血清培养基中静止24h，分别加入12．SPg／tnl上5yg／Inl和 50pg／ml的 AGE－HSA或 AGE－BSA，作用 Zh、4h、sh、12h、24h。在每一时间点均设相同浓度HSA、BSA培养作为对照。培养上清NO的浓度用Gness法测定。所得结果以培养结束时相应各孔的细胞数作校正，而后以相应对照（作为100％）的百分数表示。（2）为了避免内毒素对实验结果的影响，我们观察了 100qg／llil多粘菌素 BoMX B功人后，AGE修饰蛋白对内皮细胞生成NO的影响。内皮细胞在无血清培养基中静止24h后，加入无血清培养基、50pg／Inl AGE－HSA、50pg／Illli，GE石SA并均同时加入 llq帅 PMX B共同培养 sh。与同样处理但不加 PMX B的试验组作对比。培养结束时测定培养上清NO水平。 2．AGE修饰蛋白对MCP合成的影响。培养细胞在无血清培养基中静止24h，分别加入12．spg／llil，25pglryil，50卜gltlil的A GEGE－HSA或AGE－BSA（以加入50卜glllil不含AGE的HSA或BSA为对照），于Zh，4h，sh，12h，24h，36h，48h收集细胞，提取蛋白。取50qg细胞蛋白行15阮SDS－聚丙烯酚胺凝胶电泳，电转印或半干转印至硝酸纤维素膜上。5％hST脱脂乳封闭?
孟馨[6]2004年在《单核细胞趋化因子-1及巨噬细胞炎性蛋白-1α在2型糖尿病患者动脉粥样硬化形成和发展中的作用研究》文中进行了进一步梳理前言 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性炎症性疾病，动脉内膜的炎症细胞浸润、平滑肌细胞增生、细胞外基质增加及血栓形成等多种病理改变不同程度贯穿于动脉粥样硬化的全过程。外周血单核细胞粘附于内皮并迁入内皮下间隙，摄取脂质转化为泡沫细胞是AS形成的重要早期事件，在此过程中单核细胞受多种趋化因子的招募，其中单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)对单核细胞的趋化作用已被许多研究者所证实。文献报道，同时敲除MCP-1基因和低密度脂蛋白受体基因的小鼠在喂饲高胆固醇饮食后，其动脉粥样硬化病变与单纯敲除低密度脂蛋白受体基因的小鼠相比明显减轻，但动脉的病变并未完全消失，主动脉壁内仍有巨噬细胞浸润，说明在单核细胞迁入内皮下间隙过程中，除MCP-1外，还有其他趋化因子的参与。巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)与MCP-1同属于CC型趋化因子，其主要功能是对单核细胞的趋化作用。体内实验明确证实了MIP-1α在体内可活化血管内皮，引起单核细胞、淋巴细胞浸润。MIP-1α还可趋化CD4~+CD8~+T细胞及树突状细胞迁移进入免疫反应部位，协调免疫反应的发生，并能调节外周血单核细胞基质金属蛋白酶的产生，介导基质降解，从而在单核细胞迁入动脉内膜的过程中发挥作用。在AS斑块中，T淋巴细胞、单核巨噬细胞、嗜中性粒细胞等都表达MIP-1α。由此可见，MIP-1α在AS的发生中亦起着重要作用。 糖尿病患者大血管病变组织学检查与一般AS无显著差异，但是糖尿病患者AS发生早、进展快、预后差，是2型糖尿病患者致死致残的重要原因。糖尿病患者血浆MCP-1及MIP-1α水平增高，但其在糖尿病患者动脉粥样硬化动脉内膜中的表达与分布尚未报道。本研究采用免疫组织化学方法，检测MCP-1及MIP-1α在2型糖尿病患者和非糖尿病患者动脉粥样硬化动脉内膜中的表达与分布，探讨MCP-1及MIP-1α在2型糖尿病患者动脉粥样硬化形成和发展中的作用。 内皮细胞是AS发病过程中最先被激活的细胞，内皮细胞受各种刺激后，通过分泌炎症介质或调节白细胞在其表面的粘附，引发和扩大动脉管壁的炎症反应。高血糖及长期高血糖状态下蛋白质非酶糖化形成的糖基化终产物(advaneed glyeation end produets，AGEs)是糖尿病病人体内最初和主要的代谢异常，这两种异常对内皮细胞表达MIP一1。的影响目前仍不清楚。为此我们以人脐静脉内皮细胞株ECV304为研究对象，用葡萄糖处理无血清饥饿的人脐静脉内皮细胞，检测MIP一1 amRNA及蛋白的表达水平;同时原代培养人脐静脉内皮细胞，用AGEs处理无血清饥饿的人脐静脉内皮细胞，检测MIP一1 amRNA及蛋白的表达水平，探讨葡萄糖及对AGEs对人脐静脉内皮细胞表达MIP一la的影响，为进一步研究糖尿病患者多发大血管病变提供理论依据。方法 1.动脉标本的处理: 将术中获得的新鲜标本在离体30分钟内用OCT包埋，放人液氮中迅速冷冻形成冻块，取出后用铝箔包好，编号后存人一so℃冰箱中保存。实验前于恒温冰冻切片机制成6卜m厚的冰冻切片，贴于涂有防脱片剂并处理过的载玻片上，4%多聚甲醛固定20分钟，PBS冲洗，准备用于HE染色、油红O染色及免疫组化染色。 2.细胞培养及细胞周期同步化 (l)人脐静脉内皮细胞株ECV304购自上海细胞所，用含10%(voFvol)56℃灭活的新生牛血清的RMPll640培养液，于37℃、5%CO:的条件下培养，隔天换液。0.25%胰酶消化传代，接种于预先放置有盖玻片的24孔培养板及100而培养瓶中，内皮细胞在倒置显微镜下呈铺路石状排列。将传代生长至融合状态的内皮细胞用无血清培养液饥饿24小时，此时细胞同步于G0/Gl期。(2)人脐静脉内皮细胞原代培养:采用改良Jaffe等法。取健康新生儿脐带25一ocm，PBS冲洗后注入 0 .125%胰蛋白酶刁.02%ED-TA室温消化15一O而n，收集内皮细胞悬液，离心后用含20%56℃灭活的新生牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，调整细胞数在3 xlo，个/耐，接种于预先放置有盖玻片的24孔培养板及100血培养瓶中，隔天换液。间接免疫荧光法测定姗因子相关抗原进行内皮细胞的鉴定。细胞生长至融合状态后，无血清培养液培养24h。 3.油红O染色 固定后的冰冻切片用60%异丙醇浸泡305，然后于油红O稀释液中55℃浸泡40而n。用60%异丙醇浸泡105，苏木素染色2而n，自来水冲洗5而n，最后甘油明胶封片。 4.免疫组化染色 (l)SP法: 每张切片加l滴3%过氧化氢阻断液，以阻断内源性过氧化物酶活性，室温下孵育10min。PBS冲洗(3 xs’)。每张切片加1滴正常兔血清封闭液，室温下孵育巧而n，倾余，不洗。每张切片加1滴羊抗人MCP一1多克隆抗体(1:100)，4℃过夜。PBS冲洗(3 xs‘)。每张切片加1滴生物素标记的第二抗体，室温下孵育巧而n。PBS冲洗(5 xs‘)。每张切片加l滴链霉菌抗生素蛋白过氧化酶溶液，室温下孵育巧而n。PBS冲洗(3 xs‘)。每张切片加2滴新鲜配制的DAB显色15一omin，苏木素复染，中性树胶封片。 (2)SABC法: 30%过氧化氢+纯?
马晖[7]2016年在《基于氧化应激研究养阴益气活血法防治GK大鼠大血管病变的机理》文中提出目的：本研究采用全转录组表达谱芯片数据筛选的方法寻找养阴益气活血法防治糖尿病大血管病变的分子靶点,从差异基因表达和相关代谢通路角度探讨养阴益气活血法通过抗氧化应激防治糖尿病大血管病变的分子机制,为中药防治糖尿病大血管病变提供科学依据。方法：将160只空腹血糖≥11.0 mmol/L的7-～-8周龄雄性自发性2型糖尿病GK大鼠随机分成模型组、参芪复方高剂量组、参芪复方中剂量组、参芪复方低剂量组、西药二甲双胍组共五组,每组均连续12周给予高脂饲料喂养,最终造成糖尿病大血管病变模型。另设32只Wistar大鼠为空白组,给予普通饲料喂养。各组进行干预治疗16周,其中模型组给予10ml/kg.d生理盐水灌服,参芪复方高、中、低剂量组分别给予28.8g/kg.d、14.4g/kg.d、7.2 g/kg.d参芪复方浸膏灌服,二甲双胍组给予0.1g/kg.d二甲双胍灌服。实验期间观察GK大鼠的饮水量及进食量,分别在药物干预0周、8周、16周三个时间段,每组随机抽取10只GK大鼠,检测血糖、3-硝基酪氨酸(3-NT)、血清氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL);提取主动脉血管组织检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性与水平：每组随机抽取6只GK大鼠作HE和Masson染色观察主动脉病理形态学,比较不同干预方式抑制模型大鼠的氧化应激反应的效果。于实验第16周借助表达谱芯片技术获得的差异基因,运用GO富集和pathway分析,结合基因表达谱分析参芪复方产生影响的分子机制。结果：①参芪复方各组饮水量、进食量较模型组减少。②参芪复方各组在各时间段均能有效降低血糖、氧化应激相关指标水平,有效下调胶原纤维和血管壁面积比。③参芪复方中剂量组可明显调节主动脉血管组织SOD、GSH-Px、3-NT、 ox-LDL水平,降低高糖引起的氧化应激反应,第8周效佳。④光镜观察显示：参芪复方对高糖引起的血管内皮损伤具有较好的保护作用,减少胶原纤维的产生,以参芪复方高、中剂量组效果最明显。⑤经GO注释、Pathway分析,参芪复方中剂量组与模型组差异表达基因和涉及信号通路有Sodl、Sod2、Pon1、Pon3、 Elavl1、Lama4,JAK/STAT 和 Notch信号通路,主要涉及血管新生、细胞凋亡、细胞黏附、细胞代谢等功能。结论：养阴益气活血法能干预大血管病变GK大鼠糖脂代谢紊乱,氧化应激,血管内皮损伤,动脉硬化,以中剂量组第8周综合效果最佳。其作用机理可能是通过调控Sod1、Sod2,Pon1、Pon3、Elavl1、Lama4基因和JAK/STAT、Notch信号通路,减轻氧化应激对血管的损害,减少胶原纤维产生,抑制血管新生,促进糖尿病大血管病变早期受损内皮细胞修复,从而防治糖尿病大血管病变。
侯凡凡[8]2001年在《单核/巨噬细胞在透析相关性淀粉样变发病学中的作用》文中认为透析相关性淀粉样变 (DRA)是导致透析病人骨关节破坏性病变的致残性并发症 ,发病机制不明。淀粉样沉积周围有单核 /巨噬细胞浸润是DRA的组织病理学特征 ,但导致单核细胞浸润的原因及其在DRA发病学中的作用尚未阐明。笔者近期的研究证实 ,淀粉样纤维中的β2 微球蛋白 (β2 m)可通过与晚期糖基化终产物 (AGE)修饰的I型胶原的结合 ,在原位被AGE所修饰。AGE修饰的 β2 m(AGE β2 m)通过直接趋化作用或通过对关节滑膜成纤维细胞趋化因子生成的调节募集单核细胞 ,AGE β2 m并能延缓单核细胞的自发性凋亡 ,从而导致关节局部的单核细胞聚集。单核 /巨噬细胞的募集、活化又可通过释放促炎症细胞因子导致局部组织的炎症反应并刺激滑膜细胞表达粘附分子和产生降解基质蛋白的胶原酶 ,最终引起骨关节组织的破坏性病变
金虹[9]2005年在《结缔组织生长因子在糖基化终产物诱导人肾系膜细胞纤维结合蛋白表达中的作用》文中研究指明研究目的1.观察糖基化终产物(AGEs)对体外培养人肾系膜细胞的增殖、活性氧生成的变化以及结缔组织生长因子(CTGF)和纤维结合蛋白(FN)表达的影响,探讨AGEs在糖尿病肾病发生、发展中的机制以及氨基胍对糖尿病肾病的防治作用。2.探讨重组人CTGF蛋白(rhCTGF)对人肾系膜细胞CTGF、FN表达的影响以及抗人CTGF中和抗体(anti-CTGF IgG)在AGEs诱导的人肾系膜细胞FN表达中的作用,揭示AGEs在以细胞外基质增生和纤维化为特征的糖尿病并发症中的潜在作用机制。研究方法采用体外人肾系膜细胞珠培养方法,用葡萄糖和牛血清白蛋白模拟人体环境合成糖基化终产物(AGE-BSA),然后分别用不同浓度的AGE-BSA、重组人CTGF蛋白、抗CTGF中和抗体以及氨基胍干预系膜细胞的条件下培养至各自设定的时间。四唑盐比色试验(MTT)法测定细胞的生长情况,借助分光光度法检测系膜细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量;半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定细胞CTGF和FN的mRNA水平;免疫细胞化学方法测定细胞的CTGF、FN蛋白含量以及用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测细胞上清液中FN的蛋白水平。结果1、一定条件下,AGEs呈浓度和时间依赖方式促进系膜细胞的增殖,干预时间延长反而抑制其生长(P<0.05);2、细胞培养上清液MDA含量、SOD与CAT活性随着AGEs干预时间的延长而升高,AGEs可促进系膜细胞MDA的生成,同时降低SOD与CAT的活性,(P<0.05);3、一定条件下,AGEs呈浓度和时间依赖方式增强系膜细胞CTGF mRNA和FN mRNA的表达(P<0.05),氨基胍可通过抑制AGEs的生成从而使制得的AGEs对系膜细胞CTGF mRNA和FN mRNA表达水平的影响部分地降低(P<0.05);4、重组人CTGF蛋白在一定条件下能增强系膜细胞CTGF mRNA和FN mRNA的表达(P<0.05);5、一定条件下,抗人CTGF中和抗体可显著抑制AGEs诱导的FN的表达,但不能完全阻断这一效应(P<0.05)。结论1、AGEs可引起系膜细胞的增殖;促进系膜细胞活性氧的生成,并降低抗氧化酶活性,加重系膜细胞的氧化负荷;2、AGEs可上调系膜细胞CTGF和FN的表达,并且,AGEs诱导系膜细胞FN的表达一定程度上是由AGEs诱导的CTGF所介导,这可能是AGEs致以细胞外基质增生和纤维化为特征的糖尿病肾病的一个重要机制。氨基胍通过抑制AGEs的生成从而降低其生物学效应,对糖尿病肾病起一定的防治作用。
史春虹[10]2009年在《晚期氧化蛋白产物对人血管内皮细胞基质细胞衍生因子1α表达及信号转导通路的研究》文中研究表明背景:动脉粥样硬化性心脑血管疾病在2型糖尿病患者中的发生率和死亡率均明显增高,2型糖尿病患者是发生心脑血管疾病的高危人群。2型糖尿病发生动脉粥样硬化的易患因素包括高血糖、脂代谢紊乱、高血压等,但是往往在良好的血糖、血脂、血压控制的情况下仍然发生大血管病变。2型糖尿病患者体内存在氧化与抗氧化系统的失衡,增强的氧化应激从内皮细胞功能紊乱、血管炎症、动脉粥样硬化斑块形成和易脆性、前血栓状态的促进等多个病理生理学方面加速大血管病变的进展。晚期氧化蛋白产物(AOPP)是Witko-sarsat于1996年首次从尿毒症患者血浆中发现的一种尿毒症毒素,主要是血清白蛋白的酪氨酸残基被活化的中性粒细胞髓过氧化物酶产生的次氯酸氧化形成的蛋白交联产物。AOPP是敏感而精确的氧化应激标志物,又可加重氧化应激,是潜在的氧化应激诱导物,同时促进炎症的发展,起到炎症介质的作用。很多实验表明AOPP与动脉粥样硬化密切相关,但是,AOPP促进动脉粥样硬化的具体机制还不明确。基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)是一种高效的淋巴细胞、单核细胞趋化因子,表达于血管内皮细胞、平滑肌细胞等。研究表明在动脉粥样硬化斑块中的平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞中均有SDF-1α高表达,并且SDF-1α可趋化单核细胞进入血管壁,说明SDF-1α参与了动脉粥样硬化的形成。丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路是细胞内主要的信号转导通路,多种外界刺激作用于细胞后通过这一通路将信号传递到细胞核,介导细胞产生各种反应。哺乳动物细胞MAPK通路主要有:ERK, JNK/SAPK, p38三条途径。本研究拟探讨AOPP对人血管内皮细胞与单核细胞粘附的影响,对SDF-1α趋化单核细胞的作用,以及对人血管内皮细胞SDF-1αmRNA表达及蛋白合成的影响,同时探讨这一作用是否通过MAPK径路转导,最后从临床角度观察2型糖尿病患者血浆AOPP水平及其与心血管危险因素的关系。方法:一、ECV304细胞株及THP-1细胞株的培养两种细胞均常规培养于37℃,5%CO2湿润的恒温孵箱中。培养液为含有10%胎牛血清的RPMI1640。取第3-5代用于实验,以台盼蓝染色法检测细胞死亡率,各组细胞死亡率均≤5%。二、AOPP-BSA的制备200mg/ml BSA与0.2mol/L NaOCl各取等量混合(即以1:60摩尔比混合),室温孵育30分钟,4℃以0.01mol/L PBS(pH 7.4)透析24小时,0.22μm硝酸纤维素膜过滤消毒,-70℃冻存。以经同样处理但未加NaOCl的BSA作对照。酸性条件340nm测AOPP-BSA浓度,以氯胺-T为标准品,实际测定的为AOPP对氯胺-T的相对浓度。三、THP-1/ECV304细胞粘附实验将ECV304细胞接种于6孔板,加入不同浓度AOPP,之后再加入THP-1细胞37℃孵育30分钟,倒置显微镜下计数每个视野粘附的THP-1细胞数。四、SDF-1α趋化THP-1细胞实验单核细胞迁移用8μM孔径的Transwell小室来分析。不同浓度AOPP预处理24小时的THP-1细胞加到上室,下室加入不同浓度的SDF-1α,37℃孵育10小时后取出上室,在300×显微镜下连续计数4个视野的细胞数,取其平均值。五、SDF-1αmRNA的测定ECV304细胞分别与细胞培养基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/l AOPP-BSA共同孵育6小时,或者与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、2、6、12、24小时后,收集细胞,加入Trizol试剂提取细胞总RNA。RT-PCR法测定SDF-1αmRNA的表达。六、SDF-1α蛋白的测定ECV304细胞分别与细胞培养基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/l AOPP-BSA共同孵育12小时,或者与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、2、6、12、24小时后,收集细胞,提取细胞总蛋白。Western-blot法测定SDF-1α蛋白的表达。阻断实验中先以不同浓度的p38MAPK特异性阻断剂SB203580或者ERK1/2特异性阻断剂U0126与ECV304孵育1小时,然后与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育12小时,ELISA法测定上清液中SDF-1α蛋白浓度。七、p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白的测定ECV304细胞分别与细胞培养基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/l AOPP-BSA共同孵育15分钟,或者与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、15、30、60、120分钟后,收集细胞,提取细胞总蛋白。Western-blot法测定p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白的表达。八、2型糖尿病患者血清SDF-1α及AOPP浓度测定清晨空腹抽取静脉血5ml加入含10% EDTA的抗凝管中,离心取上清。SDF-1α浓度采用酶联免疫吸附法,按照说明书进行,用荧光免疫分析仪检测每孔在450nm处的吸光度。AOPP浓度应用分光光度法测定,血清与PBS按1∶5稀释,以氯胺-T同法稀释作空白对照,加入1.16 mmol/L KI 10μl及乙酸20μl后立刻测340 nm处的吸收度值。结果:一、AOPP呈剂量依赖性的方式促进THP-1细胞与ECV304细胞的粘附未经AOPP处理时粘附于ECV304的THP-1细胞甚少,50μmol/l的AOPP就可使粘附的THP-1细胞数目明显增加,以200μmol/l的AOPP组所粘附的细胞数目最多,与对照组相比较增加了约26倍。二、AOPP呈剂量依赖性的方式增强SDF-1α对THP-1细胞的趋化作用将不同浓度AOPP处理24小时后的THP-1细胞用10ng/ml SDF-1α进行趋化。随着AOPP浓度的增加,被趋化的细胞数也逐渐增加,200μmol/l AOPP组所趋化的细胞数是对照组的11倍。三、AOPP呈时间和剂量依赖的方式促进ECV304细胞SDF-1αmRNA表达增加与200μmol/L AOPP-BSA孵育2小时后ECV304细胞SDF-1αmRNA表达量较对照组既显著增加,6小时达高峰,之后逐渐下降,24小时SDF-1αmRNA表达量与对照组比较无显著差异。与50μmol/l,100μmol/l,200μmol/L AOPP-BSA孵育6小时后ECV304细胞SDF-1αmRNA表达量依次升高,与对照组相比差异有统计学意义。200μmol/L BSA孵育或者未加处理因素者也有SDF-1αmRNA的表达,两组间无差异。四、AOPP呈时间和剂量依赖的方式促进ECV304细胞SDF-1α蛋白合成增多与200μmol/L AOPP-BSA孵育2小时后SDF-1α蛋白合成量较对照组显著增加,随时间的推移蛋白合成量逐渐增加,24小时合成量最多。与50μmol/l,100μmol/l,200μmol/L AOPP-BSA孵育24小时后ECV304细胞SDF-1α蛋白合成量依次增加,与对照组相比差异有统计学意义。与200μmol/L BSA孵育或者未加处理因素者也有SDF-1α蛋白的合成,两组间无差异。五、AOPP呈时间和剂量依赖的方式促进ECV304细胞p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白合成增多与200μmol/L AOPP-BSA孵育15分钟后p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白合成量较对照组显著增加,之后逐渐下降,120分钟仍处于较高水平。与50μmol/l,100μmol/l,200μmol/L AOPP-BSA孵育15分钟后ECV304细胞p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白合成量依次增加,与对照组相比差异有统计学意义。六、p38MAPK特异性阻断剂SB203580或者ERK1/2特异性阻断剂U0126均可呈剂量依赖方式阻断AOPP对ECV304细胞SDF-1α蛋白合成的促进作用0.1μM的SB203580或者U0126均可明显抑制AOPP-BSA对SDF-1α蛋白合成的促进作用,随着阻断剂浓度的增加,抑制率逐渐升高,10μM阻断剂的抑制率最高。七、2型糖尿病患者血清AOPP及SDF-1α水平升高,血清AOPP水平与多种心血管危险因素相关与正常对照组相比,2型糖尿病患者血清AOPP及SDF-1α水平显著升高。2型糖尿病患者中血糖控制良好组血清AOPP水平高于血糖控制不良组,胰岛素抵抗(IR)组血清AOPP水平高于非胰岛素抵抗(non-IR)组,有大血管并发症组血清AOPP水平明显高于无大血管并发症组。2型糖尿病患者中高AOPP组体重指数(BMI),空腹血糖(FPG),糖化血红蛋白(GHbA1c),甘油三酯(TG)及SDF-1α水平明显高于正常AOPP组,差异均有统计学意义。单因素相关分析显示2型糖尿病患者血清AOPP水平与FPG, GHbA1c,TG,BMI,HOMA-IR及SDF-1α呈正相关。logistic回归分析显示,影响2型糖尿病大血管并发症的因素有年龄、血清AOPP水平和平均血压(MBP)。结论:一、AOPP呈剂量依赖方式促进ECV304细胞与THP-1细胞间的粘附,同时增强SDF-1α对THP-1细胞的趋化作用。二、AOPP呈时间和剂量依赖的方式促进ECV304细胞SDF-1αmRNA表达及蛋白合成增加。三、AOPP促进ECV304细胞SDF-1α蛋白合成增加是通过p38MAPK及ERK1/2信号转导通路。四、2型糖尿病患者血清AOPP及SDF-1α水平升高,血清AOPP水平与多种心血管危险因素相关,是2型糖尿病患者大血管并发症发生的独立危险因素。
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[10]. 晚期氧化蛋白产物对人血管内皮细胞基质细胞衍生因子1α表达及信号转导通路的研究[D]. 史春虹. 大连医科大学. 2009
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