胡川闽[1]1996年在《抗人肝癌单链免疫毒素的构建及其导向作用的实验研究》文中认为本文围绕新近获得的鼠源性HAb25抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的特异性及其基因工程改造，开展了二个层次四个方面的研究工作。以同位素和阿霉素标记或结合HAb25单克隆抗体，进行了荷肝癌裸鼠和肝癌患者放射免疫显像，及对肝癌细胞的体外杀伤实验和荷肝癌裸鼠的导向治疗实验研究，结果提示HAb25单克隆抗体具有临床应用前景，有必要对其实施基因工程改造，提高其临床应用价值；藉RT-PCR方法从分泌HAb25单克隆抗体的杂交瘤细胞中，分别克隆出该抗体的VH和VL基因，进一步序列分析表明其为新的重排的小鼠可变区基因；采用亚克隆的方案，以(Gly4Ser)3为连接肽，构建和融合高效表达了HAb25(ScFv)单链抗体，活性检测显示HAb25(ScFv)较好地保持了亲本抗体的特异性和亲和力；将HAb25(ScFv)单链抗体基因与已去除细胞膜受体结合结构
孙志伟[2]1998年在《抗肝癌单链抗体融合TNFα的构建、表达及其导向作用的初步实验研究》文中指出本课题在胡川闽博士构建的鼠抗人肝癌单克隆抗体HAb25的部分轻链缺失的单链抗体的基础上，以完整的轻链可变区基因替换原部分缺失的轻链可变区基因，重新构建了鼠抗人肝癌单链抗体(mscFv)，将其与检测标签E-tag偶连并在原核表达载体pET15b中获得高效融合表达，表达产物(mscFv-E-tag)经初步纯化后进行的活性检测结果显示，mscFv较好地保持了亲本抗体HAb25的抗原结合特异性和亲和性。在此基础上，将mscFv及其经过人源化改造的抗人肝癌单链抗体(hscFv，由军事医学科学院袁清安博士构建)分别与人肿瘤坏死因子α(TNFα)基因偶连，分别构建了PGEX 4T-1 m／hscFv-TNFα抗肝癌双功能抗体的原核融合表达载体，并实现了高效表达，表达产物经纯化后进行的活性检测结果显示，m／hscFv-TNFα均保持了亲本抗体HAb25的抗原结合特性，并对靶细胞(SMMC-7721)具有明确的选择性杀伤作用，进一步的荷肝癌(SMMC-7721)裸鼠体内抑瘤实验结果表明，m／hscFv-TNFα均具有明确的导向杀伤作用。 一、抗肝癌单链抗体的重新构建、表达及其活性检测
赵强子[3]2003年在《抗肝癌单链抗体融合PE38重组免疫毒素的构建、表达及纯化》文中研究表明原发性肝癌在世界范围流行较广泛，是严重影响我国人民健康的疾病之一。尽管近半个世纪以来我国在肝癌的临床治疗方面积累了丰富的经验，基础研究水平取得长足的进步，但远未达到控制该病的程度；肝癌对常规的放疗、化疗方法不敏感，近年来多倾向于以手术为主的综合治疗，但手术治疗仅对一部分肝癌患者适用，因此亟需寻求新的治疗方法。 肿瘤细胞异常表达的分化抗原、激素和生长因子受体以及某些病毒抗原是导向治疗的依据，因此出现应用于体内外导向治疗各种特异性抗体、重组激素、生长因子及病毒相关性糖蛋白受体等。基因工程抗体技术在恶性肿瘤的诊断、导向治疗方面的应用，取得了令人鼓舞的成果，肿瘤的导向治疗已经成为继手术治疗、放疗、化疗三大常规治疗之后，又一类新的治疗手段——生物治疗的重要组成部分。采用基因工程手段制备的肿瘤特异性单链抗体等小分子抗体的问世，为解决肿瘤治疗的靶向性提供了新的手段，成为肿瘤 第四军医大学硕士学位论文一导向治疗中的热点；重组免疫毒素采用抗体片段或其他具有特异性导向作用的细胞因于等，与细菌或植物毒素结合组成，是一类新型的有较高抗肿瘤特异性的生物制剂，在诸多有关肿瘤治疗的基础研究领域以及临床实验中取得较好的结果。 抗体技术及融合蛋臼技术在肿瘤治疗方面不断取得进展，但抗肝癌单链抗体与毒素融合蛋白治疗肝癌的尝试较少；因此，为了探讨重组免疫毒素在肝癌的导向治疗中的作用，本研究采用基因工程技术，将人源化抗肝癌单链抗体hSCFV基因及改构型绿脓杆菌外毒素PE38基因重组，构建原核表达载体PGEX4TlhSCFV－PE38（PGEXh—PE38），研究其在大肠杆菌JM109中的诱导＄达情况及表达条件，对诱导产物纯化后，得到抗肝癌免疫毒素hscFv－PE38，初步研究其对人肝癌细胞系SMMC－7721的生长抑制作用，制备出具有一定临床应用溶能的特异性抗肝癌免疫毒素，为今后肝癌的临床导向治疗研究打下基础。实验方法和结果如下： 实验采用PCR的方法成功扩增PE38基因片段，并在PE38的两端加上所需要的酶切位点，PE38基因5’端与hscFv基因3’端连接，构建原核表达载体pGEX4T－lhSCFV－PE38（pGEXh—PE38），重组表达载体及PCR扩增的PE38基因通过基因测序证实无突变，PE38基因与hscFv基因由CTTAAGAAA九个碱基对连接；PGEXh—PE38转化感受态N109，受IPTG诱导之后，成功表达预期的GST融合蛋白，分子量为90kD，在不同浓度IPTG诱导条件下最大表达量占细菌总蛋白的9％一 if％，表达产物以包涵体形式存在；包涵体经变性、复性、重折叠，经GST亲和层析柱层析纯化，凝血酶切割、进一步纯化后，得到纯化的hscFV－PE38抗肝癌兔疫毒素，分子量为66kD，纯度达到实验要求。 为进一步研究hsCFv－PE38融合蛋白的活性，实验在设置严格对照的条件下，了解其对人肝癌细胞系SMMC—7721及正常肝细胞系QZG的生长抑制作用，采用MTT法测定经不同浓度hSCFV－PE38处理后培养细胞的A4。。值。实验结果显 第一页 第四军医大学硕士学位论文一示，hSCFV－PE38融合蛋白对SMMC－7721细胞具有较好的杀伤效果，浓度与A490之间有较明显的相关，呈较好的剂量－效应关系（Pearon拟合优度检验，x‘＝8．844，V＝5，P＝0．115），最大抑制率为75％，而与正常肝细胞系不存在剂量一效应关系；SMMC－7721的存活率与浓度之间做Probit分析，方程为LositP＝－0．259－0．273In（x），ICS。为0．386u g／mL。 实验研究结论：①成功构建了人源化抗肝癌单链抗体hSCFV融合改构型绿脓杆菌外毒素PE38表达载体PGEXh—PE38；②完成该载体的诱导表达，并成功纯化了表达产物 hSCFy－PE38：＠重组免疫毒素对人肝癌细胞系SMMC－772的具有较强的生长抑制作用。以上结果提示通过基因重组技术，可大量表达并纯化具有生物活性的特异性兔疫毒素，为进一步肝癌的导向治疗研究提供了一条可行的途径。
宁保安[4]2006年在《超抗原SEB抗肿瘤效应研究》文中认为作为强大的T细胞激活剂，SEB在抗肿瘤方面有着潜在的应用价值，可以通过超抗原依赖的细胞毒作用(SDCC)直接对MHC Ⅱ类阳性的肿瘤细胞进行杀伤，但是，葡萄球菌肠毒素B可以导致呕吐腹泻并引起食物中毒等，这些副作用严重限制了其临床应用。SEB(H12D／H32D)、SEB(H105D／H121D)、SEB(H12D／H32D／H105D／H121D)、SEB(H32D)、SEB(H32Q)、SEB(H32L)是我们实验室构建的一组葡萄球菌B型肠毒素突变体，本研究中我们系统地评价了该系列突变体作为抗肿瘤制剂的可能性。首先通过幼猫催吐实验评价了该系列突变体的致吐活性，发现在高达5-10倍致吐剂量的攻击下，SEB(H105D／H121D)与SEB(H32Q)组5只猫中有4只没有出现呕吐反应，而对照组wt-SEB组全部出现呕吐反应，这两个突变体不仅与wt-SEB具有类似的MHC Ⅱ类分子结合活性，而且在针对SMMC-7721与KB两种不同来源的肿瘤细胞的体外抑瘤活性实验中均具有良好的肿瘤细胞生长抑制能力，SEB(H32Q)对SMMC7721的半数抑制浓度仅为0.798ng／mL，在建立的C57BL／6 Lewis肺癌模型中，腹腔给予125μg／kg的SEB(H32Q)可明显抑制小鼠的肿瘤生长，与生理盐水对照组相比具有显著性差异(P＜0.05)，且治疗组与对照组相比，出现了明显的肿瘤坏死和淋巴细胞浸润。我们第一次证实了SEB(H32Q)作为肿瘤免疫治疗制剂的可行性，体内外实验均证明该突变体分子具有较高的肿瘤抑制活性。 SDCC具有MHC-Ⅱ限制性，只能裂解表达MHC-Ⅱ类抗原的靶细胞。但许多肿瘤细胞MHC-Ⅱ类分子表达水平低下或缺失，使超抗原对肿瘤细胞的杀伤不能借助SDCC作用，治疗效果令人失望。抗肿瘤特异性抗体与超抗原偶联形成的靶向超抗原可以通过超抗原抗体依赖的细胞毒作用(SADCC作用)克服这一缺点，从而有效的裂解肿瘤细胞。因此我们制备了以连接肽GGGSGGS连接抗肝癌基因工程抗体scFv25和SEB的融合蛋白(scFv-SEB)并对其体外抗肿瘤活性进行了系统评价。首先我们采用生物信息学软件对融合蛋白scFv-SEB分子的可及性与柔性，抗原性与疏水性以及二级结构等进行了预测与分析，结果显示，融合后对scFv及SEB具有各自的空间结构，连接肽具有低抗原性和高结合活性，
李咏梅[5]2007年在《重组免疫毒素EGF-Linker-TCS的制备及其靶向抗肿瘤效果的评价》文中研究表明背景肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病,寻找有效的抗肿瘤药物与方法是世界医学界的重要研究课题。研究表明许多中药具有抗肿瘤作用,但其作用成分复杂,具有多种作用成分和通过多种作用途径产生抗肿瘤作用。弄清中药的抗肿瘤作用途径和靶位点对加速抗肿瘤中药的开发具有重要意义。近50年来尽管肿瘤治疗取得了一些进展,化疗、放疗、手术仍是治疗基本手段。但是由于现有的化疗药物和放疗的选择性不高,杀伤肿瘤细胞的同时也损害体内正常细胞,治疗中常出现较明显的毒副反应,所以研究、开发一种对肿瘤细胞选择性高、杀伤作用强但对正常组织副作用小的抗肿瘤药物非常有意义。免疫毒素是提高治疗效果的一条重要途径,是新一代的癌症治疗方法,此疗法与传统的化疗不同,其药物能在肿瘤部位有相对较高的浓度,存留较长时间,对肿瘤靶细胞有较强的杀伤活性,而对正常细胞无作用或毒性很小,免疫毒素是靶向性治疗肿瘤的有代表性的药物,也是免疫学研究的热点之一,被称为“生物导弹”,近年来利用基因工程技术构建了不同用途的免疫毒素。免疫毒素是具有导向能力的分子(载体)和具有细胞毒性的分子(毒素)构成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子。载体一般由抗体、细胞因子和激素等组成,毒素一般为来自于细菌或植物。载体可以把毒素定向带到病灶部位,将癌细胞或病变细胞杀死,而很少伤害正常细胞。研究表明,免疫毒素在体内具有靶向性,使毒素更易于与肿瘤细胞结合,大大提高了毒素对肿瘤细胞的杀伤率,降低了其对正常细胞的毒副作用。天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是从葫芦科植物栝蒌的根块中提取出来的一种碱性蛋白,属于Ⅰ型核糖体失活蛋白(ribosome inactivating proteins,RIPs)。天花粉蛋白临床主要用于引产及宫外孕、葡萄胎、绒癌等的治疗,另外使核糖体不可逆失活,从而抑制蛋白质的合成,其应用范围已涉及抗病毒、抗肿瘤等方面,同时可抑制艾滋病病毒在感染的免疫失活细胞内复制繁衍,此外还发现在培养的细胞系统中,TCS对乙脑、乙肝、麻疹、单纯疱疹及水泡性口腔炎等病毒均有明显抑制作用,并且这种抑制作用与TCS的浓度呈正相关。但是由于天花粉蛋白在临床上使用所产生的副作用,限制了它进一步的推广和应用,我们可以考虑如何在TCS不引发过敏反应的剂量内,最大限度的发挥其抗肿瘤作用,这就需要我们找到一种能与TCS一起最大限度发挥协同杀伤肿瘤细胞的物质。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的异常高表达可见于多种恶性肿瘤,并与肿瘤细胞的恶性生物学行为以及肿瘤患者的不良预后密切相关。EGFR已成为阳性表达肿瘤的重要治疗靶标。以EGFR为靶点的治疗主要有单克隆抗体以及小分子化合物激酶拮抗剂两种方式,目前已进行了广泛的实验与临床研究,其抗肿瘤的主要作用机制包括:细胞周期阻滞、促凋亡、抗肿瘤浸润与转移、抗新生血管生成、放化疗细胞毒增敏等。此外,以人EGFR为免疫原在小鼠体内可以激发特异的免疫反应,该反应能交叉反应于鼠同源EGFR,进而达到治疗EGFR阳性表达肿瘤的目的。迄今,EGFR靶向治疗均很少观察到显著的EGFR相关的毒副作用,这可能与正常细胞EGFR显著的调控性低表达以及对EGFR通路信号的相对不依赖性相关。为此,本研究以传统中药天花粉蛋白为毒素,人表皮生长因子为载体,利用基因工程技术,制备重组免疫毒EGF-Linker-TCS,并对其靶向性抗肿瘤作用给予评价,为中医药在抗肿瘤方面的应用进行了有益的探索,对促进中药开发、中药现代化具有一定的意义。目的1、因天花粉蛋白成分复杂,纯化步骤繁琐,得率低,目前构建的携带有天花粉蛋白基因的表达载体其表达水平较低,并且费用昂贵,为后续的研究带来困难。本实验拟通过基因工程技术,摸索出可以高效、稳定、简单、廉价的制备高纯度融合蛋白TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS的方法。2、对正常人肝LO-2细胞、肝癌BEL-7402细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胃腺癌BGC-823细胞表面EGF受体表达量进行检测,探讨EGF作为靶向抗肿瘤免疫毒素载体的可能性。3、通过结晶紫法,计算TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对正常人肝LO-2细胞、肝癌BEL-7402细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胃腺癌BGC-823细胞的半数抑制有效浓度(IC_(50))及其选择指数、应用流式细胞仪对TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS选择性诱导细胞凋亡的研究,对TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS的体外靶向抗肿瘤作用给予评价。4、研究免疫毒素EGF-Linker-TCS对建立荷人肝癌BEL-7402细胞的裸鼠模型,研究肿瘤生长抑制及移植肿瘤的肝转移情况,对EGF-Linker-TCS的体内靶向抗肿瘤作用给予评价。方法1、克隆、表达、纯化TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS融合蛋白提取栝蒌基因组,使用PCR方法扩增TCS基因,将TCS基因插入到pQE30载体中,构建TCS的原核表达质粒pQE30/TCS;使用PCR方法扩增EGF基因,将EGF基因插pQE30/TCS中,构建原核表达质粒pQE30/EGF-TCS;考虑到融合蛋白中间加Linker可能会使两个蛋白更好的保持各自的构象,更好的保持各自的生物学活性,使用PCR方法扩增了EGF-Linker基因,将EGF-Linker基因插入pQE30/TCS中,构建了原核表达质粒pQE30/EGF-Linker-TCS,分别进行基因测序。将这三个重组质粒转化至M15工程菌中诱导表达,SDS-PAGE重组蛋白在M15工程菌中的表达,检测表达量占菌体蛋白总量。将鉴定的重组质粒pQE30/TCS、pQE30/EGF-TCS、pQE30/EGF-Linker-TCS转化至M15工程菌中,挑单菌落接种于含Amp50μg/ml LB培养基中,摇床培养,至OD值为0.6时,分别加入IPTG诱导表达,取样做SDS-PAGE分析。IPTG诱导大肠杆菌表达TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS 3h,超声波破碎菌体,离心后取上清液,用Ni-NTA Agrose亲和纯化,检测样品的纯度。2、正常细胞和肿瘤细胞的EGF受体表达量的检测EGF和TCS构成的融合蛋白靶向性抗肿瘤的靶点是EGF受体,使用流式细胞仪对正常细胞和肿瘤细胞表面的EGF受体表达量进行检测。3、TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对正常细胞及肿瘤细胞的半数抑制有效浓度(IC_(50))及其选择指数的确定采用结晶紫法检测纯化的TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒作用,测定其对细胞的半数抑制有效浓度(IC_(50))及其选择指数。按以下公式计算杀伤率:杀伤率(%)=[(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值]×100%,通过计算细胞生长的抑制百分率,用origin 6.0软件计算出IC_(50),并根据IC_(50)值计算出选择指数:选择指数=IC_(50)(正常细胞)/IC_(50)(肿瘤细胞)。4、流式细胞仪检测EGF-TCS、EGF-Linker-TCS选择性诱导细胞凋亡情况EGF-TCS和EGF-Linker-TCS可以通过EGF受体结合肿瘤细胞,TCS可以使肿瘤细胞的核糖体失活,蛋白合成抑制而死亡。TCS除了核糖体失活,有可能还有其它机制导致真核细胞死亡,我们使用流式细胞仪观察EGF-TCS、EGF-Linker-TCS诱导LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞的凋亡作用。5、电镜观察EGF-Linker-TCS对肝癌BEL-7402细胞凋亡的影响使用电镜观察EGF-Linker-TCS对肝癌BEL-7402细胞的影响,进一步研究EGF-Linker-TCS诱导细胞凋亡的机制。6、EGF-Linker-TCS对裸鼠的肿瘤模型的体内抑瘤实验分别给裸鼠右腋皮下接种人肝癌BEL-7402细胞,接种后第6天,尾静脉注射100μg/kg、50μg/kg和25μg/kg EGF-Linker-TCS进行治疗,设空白对照组,停药后第2天处死小鼠,称量瘤重,计算抑瘤率,取出肝脏计算肿瘤转移灶。肿瘤组织用10%甲醛固定做免疫组织化学实验,从而研究其抑制肿瘤生长、转移的途径。结果1、TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS融合蛋白的制备对pQE30/TCS、pQE30/EGF-TCS和pQE30/EGF-Linker-TCS三个质粒分别进行基因测序,测序结果表明与设计一致;将这三个重组质粒转化至M15工程菌中,诱导表达,SDS-PAGE结果表明重组蛋白在M15工程菌中以可溶性形式表达,表达量均占菌体蛋白总量的30%。免疫印迹分析结果显示,重组蛋白可与特异性抗体发生特异性免疫反应。纯化的样品纯度均超过95%。2、正常肝细胞和肿瘤细胞的EGF受体检测使用流式细胞仪对正常肝细胞和肿瘤细胞的EGF受体进行了检测,检测结果显示正常肝LO-2细胞EGF受体阳性表达量为5.51%,肝癌BEL-7402细胞EGF受体阳性表达量为72.33%,乳腺癌MCF-7细胞EGF受体阳性表达量为63.92%,胃腺癌BGC-823细胞EGF受体阳性表达量为70.41%。肿瘤细胞的EGF受体数量明显高于正常细胞。3、TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对正常细胞及肿瘤细胞的半数抑制有效浓度(IC_(50))及其选择指数结果结果显示:TCS对LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞的IC_(50)分别为39.70μg/ml、33.37μg/ml、36.53μg/ml、41.52μg/ml,对BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞选择指数分别为1.19、1.09、0.96;EGF-TCS对LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞的IC_(50)分别为115.34μg/ml、8.90μg/ml、13.75μg/ml、15.36μg/ml,对BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞选择指数分别为12.96、8.39、7.51;EGF-Linker-TCS对LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞的IC_(50)分别为113.99μg/ml、6.98μg/ml、11.97μg/ml、13.53μg/ml,对BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞选择指数分别为16.33、9.52、8.43。实验的结果符合我们的设计,EGF-TCS和EGF-Linker-TCS对肿瘤细胞的IC_(50)要小于TCS,而对正常细胞的IC_(50)与TCS接近,EGF-TCS和EGF-Linker-TCS的选择指数高于TCS,均大于2,符合靶向药物的要求,EGF-Linker-TCS对肿瘤细胞的IC_(50)低于EGF-TCS,选择指数高于EGF-TCS。4、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS诱导肿瘤细胞凋亡作用流式细胞仪检测结果显示:EGF-TCS对乳腺癌MCF-7细胞、胃腺癌BGC-823、肝癌BEL-7402细胞的凋亡率分别为35.61%、39.59%、50.57%,同样的剂量只能引起正常肝LO-2细胞少量的凋亡,凋亡率仅为8.99%,结果表明EGF-TCS(5μg/ml)具有诱导肿瘤细胞产生凋亡的作用;EGF-Linker-TCS(5μg/ml)也同样具有诱肿瘤细胞乳腺癌MCF-7细胞、胃腺癌BGC-823细胞、肝癌BEL-7402细胞凋亡的作用,凋亡率分别为:36.67%、42.56%、58.56%,同样的剂量只能引起正常肝LO-2细胞少量的凋亡,凋亡率仅为8.08%。5、电镜观察EGF-Linker-TCS对BEL-7402细胞的影响电镜下可见对照组细胞核清晰完整,有丰富正常的线粒体及内质网;EGF-Linker-TCS蛋白组出现细胞凋亡不同时期特征,染色质浓集,核不规则,可见空泡状内质网,凋亡小体。6、EGF-Linker-TCS对荷人肝癌裸鼠肿瘤模型体内的抑瘤实验为了进一步观察重组毒素的抗肿瘤效果,我们使用EGF-Linker-TCS重组蛋白对裸鼠的肿瘤模型进行了体内的抑瘤实验,结果表明EGF-Linker-TCS能明显的抑制裸鼠实体瘤的生长。高、中和低剂量组的抑制率分别为71.3%、60.87%和45.22%,对治疗结束后各组平均瘤重进行统计学分析,说明EGF-Linker-TCS能明显的抑制裸鼠实体瘤的生长,结果有显著性差异(F=8.712P=0.006);同时我们也观察了药物对移植肿瘤肝转移的抑制情况,解剖裸鼠检查肝脏,可见移植瘤转移到肝脏后呈现单个的白色病灶,对每只裸鼠的肝转移病灶计数后进行统计学分析,结果表明EGF-Linker-TCS能显著的抑制裸鼠移植瘤肝脏转移,结果有显著性差异(F=8.744 P=0.002);免疫组化结果显示EGF-Linker-TCS可以明显的抑制肿瘤血管的形成,高剂量组肿瘤组织未有可见血管,中低剂量组肿瘤组织血管明显少于模型组,其抑制肿瘤生长、转移的途径可能是通过抑制肿瘤血管生长来抑制肿瘤生长及转移。结论经上述研究,可以得出以下结论:1、通过基因工程技术,摸索出了可以高效、稳定、简单、廉价的制备高纯度融合蛋白TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS的方法,为下一步研究其生物学功能奠定了基础。2、在很多肿瘤细胞表面EGF受体过度表达,EGF可以特异地结合肿瘤细胞过度表达的EGF受体,可以用于免疫毒素的导向。3、通过TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对肿瘤细胞体外靶向杀伤作用的研究,证明EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对肿瘤细胞具有良好的选择性,选择指数大于2,并且具有较高的细胞毒性,对正常细胞的细胞毒性要小于TCS。4、免疫毒素EGF-Linker-TCS能明显抑制肝癌动物模型肿瘤生长及肿瘤的肝转移,说明EGF-Linker-TCS对实体瘤作用明显。
张静[6]2000年在《抗肝癌单链抗体融合突变型TNF-α的构建、表达及其导向作用的初步实验研究》文中研究表明我室从1982年以来一直从事肝癌导向治疗的研究，曾成功地制备并高效表达了抗肝癌单链抗体m／hscFv_(25)，与人天然型TNF-α连接后，先后进行了原核、真核表达及导向治疗研究，取得了一定的治疗效果。但由于天然型TNF-α的毒副作用很大，在临床应用中常出现发热、寒战、恶心、呕吐等症状，严重者甚至出现全身消瘦，导致各脏器衰竭而死亡，大大限制了它在临床上的应用，因此我们尝试用高生物学活性、低毒性的突变型TNF-α(mTNF-α)将之替代，构建新型、高效、低毒的抗肝癌双功能抗体原核表达载体pGEX4T-1／scFv_(25)-mTNF-α，通过诱导表达、纯化后，对SMMC-7721肝癌细胞及荷肝癌裸鼠进行导向治疗研究，以期制备出具有临床应用潜能的抗肝癌双功能抗体，为今后肝癌的临床导向治疗研究打下基础。 一 m／h scFv_(25)-mTNF-α的构建、表达 采用PCR的方法在mTNF-α的两端加上所需要的酶切位点，将之连接在m／hscFv_(25)的3’端，构建原核表达载体pGEX4T-1 m／hscFv_(25)-mTNF-α，
付勇, 刘彦仿, 赵君, 杨守京, 孙志伟[7]2004年在《二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达》文中认为目的 :构建二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体 (hdsFv)与人嗜酸性细胞神经毒素 (hEDN)融合基因原核表达载体 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用RCR的方法扩增hEDN基因 ,克隆入含抗肝癌hdsFv基因的TIH原核表达载体 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)plyS后 ,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS -PAGE及Westen -blot分析及鉴定。结果 :成功构建了抗肝癌hdsFv -hEDN融合基因原核表达载体 ;SDS -PAGE和Westen -blot分析显示 ,诱导表达产物出现一条Mr约为 4 5 .0KD的新生蛋白带 ,表达量占菌体总蛋白量的 2 2 % ,主要以包涵体形式存在。结论 :抗肝癌hdsFv -hEDN重组免疫毒素融合基因的成功构建及表达 ,为其进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础
张桂红[8]2006年在《抗肝癌单链抗体抑瘤效果的提高》文中研究表明制备单克隆抗体技术的出现和发展，为肿瘤的治疗提供了新的手段，即肿瘤的导向治疗。本实验室从事肝癌导向治疗的研究已达20余年，应用人新鲜肝癌细胞悬液制备的抗肝癌单克隆抗体HAb25，经免疫组织化学和放射免疫显像实验证实特异性强，亲合力高，具有良好的导向作用。此后，又分别克隆了抗肝癌单克隆抗体HAb25的VH和VL基因，通过连接肽(Gly4Ser)3相连制备了msFv25，经二硫键稳定和人源化改造获得了抗肝癌hdsFv。近年来，本实验室构建并表达了多种抗肝癌重组免疫毒素，如scFv25-TNFα，scFv25-突变型TNFα，hdsFv-突变型TNFα，hdsFv25-PE38和hdsFv25-RC-RNase等，经对体外培养的肝癌细胞的MTT实验及对荷肝癌裸鼠的抑瘤实验表明均具有明确的导向作用，在对肝癌的治疗中取得了良好的治疗效果。 研究表明，核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)不仅具有催化活性，而且具有细胞毒性，有望成为一类新型的抗肿瘤药物应用于临床肿瘤的治疗。细胞毒性RNase，尤其是来源于蛙类的RNase，它们分子量小，细胞毒性非常强，具有强大的选择性杀伤肿瘤细胞的作用，很少对机体产生毒副作用。本实验在付勇博士实验的基础上，将他构建的牛蛙核糖核酸酶(RC-RNase)原核表达载体在大肠杆菌中进行表达及纯化，使用免疫印迹法(Western blotting)检测其
苏醒[9]2008年在《抗黑色素瘤scFv-mTNF-α免疫细胞因子的构建及其抗肿瘤活性研究》文中研究表明目的:构建抗黑色素瘤免疫细胞因子ScFv-mTNF-α,在大肠杆菌中表达并纯化具有黑色素瘤特异性结合活性和杀伤活性的融合蛋白,为黑色素瘤的抗体导向治疗打下基础。方法:为了避免使用天然型TNF-α所造成的强烈的副作用,我们尝试用高生物学活性、低毒性的突变型TNF-α(mTNF-α)将天然型TNF-α替代,与抗黑色素瘤单链抗体构建新型、高效、低毒的抗黑色素瘤免疫细胞因子原核表达载体pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α,待鉴定正确后,通过在大肠杆菌中诱导表达、纯化,用制备的融合蛋白在体外对L929细胞进行TNF活性的检测,对B16-F10黑色素瘤细胞进行体外杀伤实验,在体内对荷黑色素瘤Balb/c小鼠进行导向治疗研究,以期获得具有临床应用潜能的抗黑色素瘤免疫细胞因子。首先鉴定本室保存的两个质粒pGEX-4T-1/ScFv和pGEX-4T-1/mTNF-α,并对其进行测序,用获得的测序结果推导出对应的氨基酸序列,查阅文献获得linker序列,将模拟得到的理论融合蛋白片断通过Insight II软件,采用同源建模、分子力学和分子动力学等方法预测蛋白质三维结构。设计含有限制性内切酶和linker序列的引物并分别扩增ScFv基因和mTNF-α基因,用重叠延伸PCR方法把ScFv基因与mTNF-α基因进行融合,将所获得的免疫细胞因子基因克隆入带GST标签的质粒pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α,用限制性内切酶酶切分析、DNA序列测定、SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白原核表达载体构建和表达的情况。IPTG诱导表达之后的表达产物经包涵体的纯化→变性→复性→透析→浓缩→亲和层析后,得到比较纯的ScFv-mTNF-α的抗黑色素瘤的融合蛋白。采用MTT法,标准曲线法用小鼠成纤维细胞L929检测免疫细胞因子的TNF-α活性;MTT法检测免疫细胞因子对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞株的杀伤作用;免疫荧光测定ScFv对黑色素瘤细胞的特异结合活性;体内实验用Balb/c小鼠尾静脉注射小鼠黑色素瘤细胞株B16-F10,实验分为PBS组、ScFv组、mTNF-α组、ScFv-mTNF-α四组,每组8只动物。接种一天后开始尾静脉注射给药,连续给药一个星期,每24h一次,给药量为60ug/只·天,一周后解剖各组小鼠进行比较,观察小鼠肺部黑色素瘤转移的情况。结果:质粒pGEX-4T-1/ScFv经过测序后ScFv基因长732bp,基因内无终止码,为开放读框,编码244个氨基酸,含六个CDR区,并含有维持抗体结构所必需的四个半胱氨酸。计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性,表明所克隆基因为功能性重排小鼠抗体可变区基因。mTNF-α基因与天然型TNF-α基因比较,缺少了7个N端氨基酸的同时Pro8Ser9Asp10改也变为ArgLysArg,C端第157位Leu由疏水性氨基酸Phe替代。根据文献确定linker序列为GTGGGS,将ScFv与mTNF-α基因融合后对获得的理论融合蛋白的序列进行三级结构预测,结果显示融合蛋白单体和形成三聚体后的ScFv与mTNF-α彼此功能结构域不会互相影响。PCR扩增出ScFv和mTNF-α基因片断,通过OE-PCR方法将两个片断进行融合,构建了原核表达质粒pGEX-4T-1/ScFv-mTNF-α,转化大肠杆菌TG1,经IPTG诱导在分子量为69KD处有一条明显的新生蛋白带,用抗GST单抗进行Western blot分析也证实了该新生蛋白带为GST-ScFv-mTNF-α融合蛋白。表达产物经包涵体的纯化→变性→复性→透析→浓缩→亲和层析→凝血酶切→亲和层析后,得到比较纯的ScFv-TNF-α的抗黑色素瘤的免疫细胞因子。在ScFv-mTNF-α的MTT实验中,我们发现ScFv-mTNF-α对TNF敏感的小鼠成纤维细胞L929具有明显的杀伤作用,测得免疫细胞因子的mTNF-α活性为34382 u/mg,表明融合蛋白的mTNF-α端具有良好的生物学活性;免疫荧光实验结果表明scFv具有良好的与黑色素瘤细胞结合的特异性;对B16-F10细胞株的杀伤实验表明免疫细胞因子具有体外结合并杀伤黑色素瘤细胞的特性,杀伤效应存在浓度依赖关系,即融合蛋白浓度越大,对细胞的杀伤越强,浓度在100μg/ml时对B16-F10细胞的杀伤效果最佳。B16-F10接种的各组Balb/c小鼠在经过一周的治疗后肺表面均没有明显的黑色素瘤转移结节,PBS对照组也没有发现肺部肿瘤转移灶形成,可能的原因是B16-F10对Balb/c小鼠有较强的免疫原性。因此我们将实验进行了改进,改用C57/BL6小鼠,延长实验周期,即延长肿瘤转移后的生长时间,再对其采用融合蛋白进行治疗,观察融合蛋白在体内对黑色素瘤的杀伤效应。实验正在进行中。结论:成功构建了抗黑色素瘤免疫细胞因子pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α原核表达载体,用获得的融合蛋白进行体内外活性研究,实验结果表明免疫细胞因子ScFv-mTNFα具有较好的体外生物学活性。
张歌萌[10]2003年在《抗肝癌单链抗体的表达、纯化及其在荷人肝癌裸鼠体内的放射免疫显像的初步研究》文中研究指明肝癌是我国及某些亚非地区的最常见的恶性肿瘤之一，其中90％以上是肝细胞肝癌。肝细胞肝癌恶性度高，多数病人在发现时已是中晚期，目前仍缺乏有效的治疗措施，攻克肝细胞肝癌已成为亟待解决的重大课题。早期发现和治疗对于患者的预后仍起着关键性的作用。 肿瘤放射免疫显像(RⅡ)是利用放射性核素标记肿瘤抗体，结合体外影像诊断肿瘤的技术。其基础是标记抗体能够选择性地浓聚于肿瘤部位，以肿瘤/非肿瘤(T/NT)比来定量的衡量这种亲肿瘤的特异性分布，近半世纪的动物实验及临床研究的结果证明，放射免疫显像技术对于恶性肿瘤的定位及定性诊断有着其它手段所不能比拟的优越性。通过对不同放射性核素的选择，使之成为临床恶性肿瘤诊断和治疗的有利的辅助手段。但是到目前为止，对于肝肿瘤仍缺乏良好的示踪剂进行诊断。因此，临床迫切需要一种特异性较高的肝癌阳性显像示踪剂，以利于早期病灶的检出。 1：目的 初步研究~(131)I标记的mscFv25在荷人肝癌裸鼠体内的生物学分布和放射免疫显像，为肝癌抗原的单链抗体在肝癌的早期诊断和治疗的应用奠定基础。 2：方法 2．1 mscFv25的表达及纯化 第。军区大q硕士嗲伍伶式 将原核表达载体 pGEX 4T－mscFv25转化 E．col JM109，通过nTG的诱导表达目的蛋白，此种融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的12％，表达产物经包涵体的纯化一变性一复性一亲和柱纯化一凝血酶酶切一进一步纯化。2．2‘’‘工mscFv25在荷瘤裸鼠体内的放射兔疫显像的初步研究 将25只荷人肝癌裸鼠随机分为A、B两组，其中A组20只又分为AI、AZ组，分别通过静脉和腹腔注射相同剂量的”‘工mscFv25，B组5只为阴性对照。然后分别于注射标记品后1、4、8、16、24、28h固定动物，进行放射免疫显像。然后处死裸鼠，取肿瘤、全血及主要组织器官，称重，测放射性活度，计算瘤（T）／非瘤（NT）比值及每克组织占注射剂量的百分数。3：结果 成功制备了分子量约为52000的mscFv25与GST融合蛋白，，然后通过包涵体的纯化及GST亲合柱纯化得到了分子量约为26 000的电泳纯的mscFv25。高效碘标法制备‘’‘工mscFv25，标记率为80％。放射免疫显像结果显示试验组荷人肝癌裸鼠在6－8小时全部明确显像，对照组鼠瘤区未出现放射性浓聚。”l标记 mscFv25的瘤／肝比值28小时为9．63士0．05。静脉途径和腹腔途径试验组裸鼠放射免疫显像没有明显差异。4：结论‘”工mscFv能提高瘤／肝比值（T／NT），缩短显像时间，有可能成为肝癌早期诊断的一项重要技术。
参考文献：
[1]. 抗人肝癌单链免疫毒素的构建及其导向作用的实验研究[D]. 胡川闽. 第四军医大学. 1996
[2]. 抗肝癌单链抗体融合TNFα的构建、表达及其导向作用的初步实验研究[D]. 孙志伟. 第四军医大学. 1998
[3]. 抗肝癌单链抗体融合PE38重组免疫毒素的构建、表达及纯化[D]. 赵强子. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[4]. 超抗原SEB抗肿瘤效应研究[D]. 宁保安. 中国人民解放军军事医学科学院. 2006
[5]. 重组免疫毒素EGF-Linker-TCS的制备及其靶向抗肿瘤效果的评价[D]. 李咏梅. 第一军医大学. 2007
[6]. 抗肝癌单链抗体融合突变型TNF-α的构建、表达及其导向作用的初步实验研究[D]. 张静. 第四军医大学. 2000
[7]. 二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达[J]. 付勇, 刘彦仿, 赵君, 杨守京, 孙志伟. 西北国防医学杂志. 2004
[8]. 抗肝癌单链抗体抑瘤效果的提高[D]. 张桂红. 第四军医大学. 2006
[9]. 抗黑色素瘤scFv-mTNF-α免疫细胞因子的构建及其抗肿瘤活性研究[D]. 苏醒. 中国人民解放军军事医学科学院. 2008
[10]. 抗肝癌单链抗体的表达、纯化及其在荷人肝癌裸鼠体内的放射免疫显像的初步研究[D]. 张歌萌. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
标签：肿瘤学论文; 肝癌论文; 肿瘤细胞论文; 融合蛋白论文; 肿瘤免疫论文; 抗原抗体论文; 基因合成论文; 细胞免疫论文; 肝癌症状论文; 蛋白质纯化论文; 融合基因论文; 黑色素瘤论文; 癌症论文; egf论文;