隋雨桐 黄吉峰 李泽光（通讯作者）
黑龙江中医药大学附属第一医院 哈尔滨 150040
摘要：目的：观察对乌龙丹对胶原诱导的关节炎模型大鼠的治疗作用及血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF–α的表达情况的影响。方法：通过Ⅱ型胶原诱导大鼠建立类风湿关节炎模型，随机分为假手术组，模型组，乌龙丹高、中、低剂量组，于造模后第14天开始给药。观察各组关节关节炎指数积分及关节肿胀率情况；并以Elisa法检测血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF–α的表达情况。结果：乌龙丹各剂量组关节炎指数积分及关节肿胀率均显著降低，与模型组比较且具有显著性差异；乌龙丹各剂量组与模型组相比较，血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF–α均有不同程度的改善，其中乌龙丹中剂量组改善最为显著。结论：乌龙丹对胶原诱导的关节炎模型大鼠，具有良好的治疗作用。能有效缓解胶原诱导的关节炎模型大鼠关节炎指数积分及关节肿胀率；有效降低类风湿关节炎时血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF–α。
关键词：类风湿关节炎；胶原诱导型关节炎；乌龙丹
Effect of Wulongdan on collagen induced arthritis in rats
SUI yu-tong HUANG ji-feng LI ze-guang#
（The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040）
Abstract：To observe the effect of Wulongdan on the treatment of collagen induced arthritis in rats and the expression of IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α in serum. Methods：The model of rheumatoid arthritis was established in rats induced by type II collagen. The model group was randomly divided into sham operation group，model group，high，medium and low dose group of Wulongdan，and began to be given fourteenth days after the model. The index of joint arthritis and the rate of joint swelling were observed. The expressions of IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α were detected by Elisa.. Results：The index score of arthritis index and the joint swelling rate of Wulongdan group were significantly lower than those in the model group. Compared with the model group，the serum IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α were improved in different degrees，and the improvement of the dosage group in Wulongdan was the most significant. Conclusion：Wulongdan has a good therapeutic effect on collagen induced arthritis rats. It can effectively alleviate the index integral of arthritis and the rate of joint swelling in the rats with collagen induced arthritis，and effectively reduce the serum IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α in the serum of rheumatoid arthritis.
Key words：Rheumatoid arthritis；collagen induced arthritis；Wulongdan
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性滑膜炎和血管翳形成为病理特点的自身免疫性疾病[1][2][3]。研究认为NF-κB活化后可增强IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、COX2等基因的转录水平。RA属于中医学“痹证、历节”范畴，通过临床实践总结出以“乌龙丹”为基础方剂，临床应用中发现其在缓解症状和控制疾病进展方面取得了很好的疗效。本研究基IL-1β、IL-6、IL-8、TNF –α的表达情况的研究，探究乌龙丹对胶原诱导的关节炎模型大鼠的治疗的作用机制，以期为临床治疗提供可行性实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性Wistar大鼠50只，体质量（190±20g），由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（黑）2015004。
1.2 伦理审查
实验经过黑龙江中医药大学动物伦理委员会审查，编号：SN14073-D。
1.3 药物与试剂
乌龙丹（由乌骨藤、穿山龙、秦艽、杜仲、白芍、川断、木瓜、威灵仙组成，提取的制备由黑龙江中医药大学药学院国家中药材规范化生产及质量标准实验室制备，每克浸膏相当于生药量5.3克）；牛Ⅱ型胶原、弗式完全佐剂，购于美国sigma公司；IL-1β、IL-6、IL-8、TNF–α Elisa试剂盒，购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.4 仪器
微量加样器，购于法国 GILSON公司；Mode145O型酶标仪，购于美国BIO-RAD；低温离心机，购于日本日立公司；微量离心机，购于德国Eppendorf公司。
2 实验方法
2.1模型建立
取Wistar雄性大鼠，随机选出10只为正常组。其余大鼠于颈、背部5个部位皮内注射BCⅡ乳剂总量0.5ml（含1mg BCⅡ）。第21天同法0.3ml加强注射。
2.2分组及处理
将造模成功的大鼠随机分为模型组，乌龙丹高、中、低剂量组4个组，每组10只。乌龙丹高、中、低剂量组分别给予14g、7g、3.5g生药·kg-1，每次1ml，每日灌胃1次；正常组与模型组予等容量蒸馏水；各组均于造模第10天开始给药，共给药28天。给药第28天，脱颈法处死大鼠，由眼眶取血，离心分离血清。
2.3关节炎指数积分
采用Wood氏关节炎评估标准，4只足爪中每只足爪的损害都分为0~4级，计算四肢的总积分，其最高的分数为16分，给药后每7天评估积分一次，并进行记录。
2.4关节肿胀率测定
造模后用水溶积置换法测定大鼠致炎侧即左踝关节毛际以下容积。以第１天测得的值为基值，给药28天后测得的值与之相比所得比值得关节肿胀率。
2.5酶联免疫吸附法测定
将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl，置37℃，4h，或4℃，24h；弃去孔中液体。PBS洗3次，每次3分钟。加入待检测样品，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品加双孔，每孔100μl，置于37℃，40-60min。PBS洗3次，每次3分钟。加入酶标抗体，PBS洗3次，每次3分钟。加入底物液TMB使用液，底物加入量每孔100μl（TMB空白显色孔除外），置37℃避光放置20-25分钟。每孔加入终止液50μl终止反应，此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。
2.6统计学处理
采用SPSS软件20.0 版本对各组指标数据进检验分析，均以表示。对各组数据进行正态检验，各组正态分布且方差齐性的采用单因素方差分析，非正态分布资料采用非参数检验。P <0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 关节肿胀情况
本实验中我们观察到Wistar大鼠在皮下注射BCⅡ乳剂后，于第14天时可见关节肿胀明显，以后肢远端显著，至20天时关节肿胀达到了最高峰。
4 讨论
RA基本病机为禀赋不足、外感风寒之热之邪、痹阻经络、气机失调、痰瘀内生、郁久化毒，损害筋骨关节[4][5][6][7][8]。经多年临床总结发现，多数RA患者病程中具有“正气不足、寒热错杂，痰瘀毒壅阻”的病理特点，以此理论总结出以乌龙丹为基础方剂，在缓解RA症状、控制疾病进展以及在骨关节炎、抗骨质疏松等方面取得了很好的疗效。乌龙丹由乌骨藤、穿山龙、秦艽、杜仲、白芍、川断、木瓜、威灵仙、延胡索、粉萆薢等组成。方中乌骨藤祛风湿、活血、解毒，穿山龙祛风除湿、活血通络，两药相合共奏祛风湿、活血通络，为君药。臣以杜仲补肝肾，强筋骨，川续断补肝肾，续筋骨，调血脉，共奏补肝肾、强筋骨，助君药强筋骨除痹痛。佐以白芍养血、止痛、敛阴，木瓜舒筋活络、和胃化湿，秦艽祛风除湿、和血舒筋、清热，威灵仙祛风除湿、通络止痛，延胡索活血散瘀、理气止痛，粉萆薢利湿去浊，祛风通痹。纵观全方散中有收、寓通于补、寒温得宜，共奏祛风除湿、补肾、通络止痛之功效。
RA是一种以关节滑膜慢性炎症病变为主要特征的自身免疫性病变。近年来，临床表现、病理学和免疫机制等方面与人类RA有许多相似特征的动物模型的相继建立。目前佐剂性关节炎和Ⅱ型胶原诱导性关节炎在临床表现、实验室指标和病理机制等方面与人RA有着相似或相近的特点，广泛应用于RA的实验研究。本实验中我们观察到Wistar大鼠在皮下注射BCⅡ乳剂后，第14天时可见关节肿胀明显，以后肢远端显著，至20天时关节肿胀达到了最高峰，与文献报道情况相一致。给予乌龙丹高、中、低剂量干预后，在实验鼠在一般状况、以及关节炎指数积分、关节肿胀率方面，出现了明显改善，与模型组相比具有显著性差异。
TNF-α可以诱导内皮细胞表达粘附分子，促进白细胞与血管内皮粘附渗透导致局部炎症；增加滑膜及内皮细胞、成纤维细胞生长因子的释放而促进血管翳的形成。IL-1β具有诱导其它细胞因子表达的作用，是控制RA骨侵蚀和软骨破坏的关键因子，可抑制其修复，与关节软骨的损伤程度呈正相关。IL-1β比TNF-α有更强的刺激MMPs产生及抑制胶原和糖蛋白合成，从而加重骨损伤的作用。IL-6是在免疫应答中产生的重要炎症介质，在自身免疫疾病中起到诱发和维持免疫炎性反应的功能，是RA滑膜炎症及关节损伤的重要介质之一[9][10][11]。研究发现模型组血清及滑液中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α均有明显升高，与正常组比较具有显著性差异；各治疗组均有不同程度的改善，与假手术组相比仍显著升高，具有显著性差异，其中以乌龙丹高、中剂量组最具有显著性差异。通过本研究可见乌龙丹能够调节NF-κB活化相关的多个细胞因子，如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8，这可能是其治疗类风湿关节炎的机制之一。
参考文献：
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注基金项目：课题来源：黑龙江自然科学基金（No.D201277）
黑龙江省教育厅重点项目（No.051367）
作者简介：隋雨桐（1988-），男，30岁，博士，住院医师，研究方向：中西医结合治疗风湿病。
#通讯作者：李泽光（1964-），男，主任医师，教授，医学博士，硕士研究生导师，研究方向：中西医结合治疗风湿病。
论文作者:隋雨桐,黄吉峰,李泽光（通讯作者）
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年6月18期
论文发表时间:2018/8/24
标签：关节炎论文; 乌龙论文; 类风湿论文; 关节论文; 大鼠论文; 胶原论文; 模型论文; 《中国误诊学杂志》2018年6月18期论文;