（1徐州医科大学附属医院麻醉科 江苏徐州 221002）
（2徐州医科大学 江苏徐州 221002）
【摘要】目的：在动物模型中探讨吗啡耐受过程中，Hedgehog 信号通路在脊髓水平表达的时空变化规律的影响。方法：建立吗啡耐受的动物模型，采用随机数字表法分为7组：组A：生理盐水+吗啡组，组B：生理盐水对照组，组C：空白对照组，组D：cyclopamine+吗啡组，组E：vismodegib+吗啡组，组F:Robotnikinin+吗啡组，组G:Shh-IgG+吗啡组。在不同时间点检测Hedgehog信号通路相关分子的表达。结果：与对照组相比，吗啡耐受组注射结束后1～5d脊髓SHH、Ptch1和Smo表达上调，而Gli1在吗啡注射结束后7d时表达上调；在不同位点抑制Hh信号通路后，TWT均较吗啡耐受组延长；激活Hh信号通路后，TWT均较吗啡耐受组缩短。结论：Hedgehog信号通路与吗啡耐受密切相关，抑制Hh信号通路后，能够抑制或延迟吗啡耐受。
【关键词】Hedgehog信号通路；吗啡；耐受；动物模型
【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2019）01-0095-02
慢性疼痛主要由炎症、组织或神经损伤引起。其他诸如躯体感觉系统损伤、癌症和遗传疾病等事件也会导致慢性疼痛[1]。吗啡是临床上有效的阿片类镇痛药物，对于中到重度的慢性顽固性疼痛有很好的疗效。用阿片类药物治疗癌症相关疼痛和慢性非恶性疼痛（CNMP）经常会引起诸如吗啡耐受性等副作用，随着时间的推移会加重慢性疼痛[2，3]。而为了达到有效的镇痛作用，临床上不得不逐渐加大药物的剂量，这无疑又增加了药物副作用发生的风险，同时会导致药物成瘾的产生。如何能最大程度的发挥阿片类药物的镇痛效能，同时又避免产生药物耐受、成瘾等严重副作用，近年来成为科研工作者和临床医生关注的热点问题。本研究将通过构建吗啡耐受动物模型进一步阐明吗啡耐受过程中，Hedgehog信号通路在脊髓水平表达的时空变化规律以及对耐受的行为学影响
1.方法
1.1 实验动物喂养及分组
将42只健康成年SD雄性小鼠本院临床研究所中动物房，分笼饲养，每笼6只，25℃恒温，给予裸鼠饲料和食用水。
实验动物健康成年SD雄性小鼠30只，8周龄，体重18～21g，随机分为7组，每组6只。组A：生理盐水+吗啡组，组B：生理盐水对照组，组C：空白对照组，组D：cyclopamine+吗啡组，组E：vismodegib+吗啡组，组F：Robotnikinin+吗啡组，组G：Shh-IgG+吗啡组。分别选择三种针对Hh信号通路不同位点的小分子化合物：cyclopamine（抑制Smo的作用）、vismodegib （GDC-0449）（抑制Ptch与Shh的结合），Robotnikinin（与Shh的氨基端结合，阻断Shh的活性）作为抑制Hh信号通路的抑制剂，分别于吗啡耐受出现之前进行鞘内注射，每天1次，连续3天。
1.2 免疫印迹（western blot，WB）
取L4～L5脊髓节段，按1:20（质量：体积）加入裂解液与上样缓冲液1:1配制的混合液，冰浴超声匀浆，15000rpm×15 min，4℃离心，取上清，-70℃保存。电泳前，加入等体积的1×上样缓冲液，沸水中变性10min。30～50μg/泳道的样品以10% SDS-PAGE电泳分离，5%蛋白质干粉-TBST室温封闭1h，加入一抗4℃过夜。TBST漂洗后，继以辣根过氧化酶标记的二抗室温下孵育2h。ECL发光底物显色1min后进行结果分析。
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1.3 统计学分析
采用SPSS17.0统计软件进行分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，重复测量设计的计量资料比较采用重复测量设计的方差分析，随机区组设计的计量资料比较采用单因素方差分析，当P＜0.05，则认为有显著性差异。
2.结果
2.1 吗啡耐受过程中Hedgehog信号通路的表达
在注药的不同时间点检测Hedgehog信号通路相关分子的表达水平，结果显示：与对照组相比，吗啡耐受组注射结束后1～5d脊髓SHH、Ptch1和Smo表达上调，而Gli1在吗啡注射结束后7d时表达上调（P＜0.05）。
2.2 利用小分子抑制剂抑制Hh信号通路的不同水平检测不同时间点TWT变化，外源性给予Hh信号通路的激动剂检测不同时间点TWT变化
分别选择三种针对Hh信号通路不同位点的小分子化合物：cyclopamine（抑制Smo的作用）、vismodegib（GDC-0449）（抑制Ptch与Shh的结合），Robotnikinin（与Shh的氨基端结合，阻断Shh的活性）作为抑制Hh信号通路的抑制剂，检测不同时间点TWT变化，结果显示，在不同位点抑制Hh信号通路后，TWT均较吗啡耐受组延长（P＜0.05）。鞘内注射外源性的Hh信号通路的激动剂（Shh-IgG）来激活Hh信号通路，通过行为学方法检测Hh信号通路激动剂对实验动物痛觉过敏的影响，结果显示：激活Hh信号通路后，TWT均较吗啡耐受组缩短（P＜0.05）。见表1。
3.讨论
Hedgehog信号通路是机体早期发育过程中一条非常重要的信号通路，广泛参与神经细胞的增殖、分化，轴突导向，神经管的发育以及脑亚区的形成等过程。当机体发育成熟后，Hh信号通路在体内的表达显著下降，并处于沉默状态（silence in post-natal life）[4]。但当机体处于病理状态下时，特别是在组织损伤修复过程中（如骨折、脑卒中，脊髓损伤等），Hh信号通路会被再次激活，发挥其重要的调控作用。
最近有学者报道，Hh信号通路参与了伤害性信息的调控。他们通过突变果蝇的Hh 基因发现，伤害性神经元中Hh信号通路的活化是痛觉过敏形成的必要因素。鞘内注射Hh信号通路抑制剂cyclopamine能显著抑制炎性痛和神经病理性痛大鼠的痛敏行为[5]；而外源性给予Shh信号通路激动剂，则能导致明显的热痛敏和机械痛敏表现，提示Hh信号通路对伤害性神经元的敏化起着重要的调控作用。同时，他们还证实，在成年动物中阻断Hh信号通路不会影响正常神经元的功能，也不会产生明显的副作用，这提示阻断通过Hh信号通路来治疗慢性疼痛是一个安全有效的方法[6]。
在本研究中，我们发现在吗啡耐受的过程中，Hh信号通路相关分子表达升高，抑制Hh信号通路后，能够抑制或延迟吗啡耐受。结合已知的Hh信号通路的作用和功能，我们推测，Hh-Ptch-Smo-Gli信号轴可能通过调节感觉神经元的兴奋性和脊髓背角突触可塑性变化参与对吗啡耐受、成瘾的调控，本研究结果提示干预Hh信号通路，不仅能起到抗癌的作用，同时又能抑制吗啡耐受、成瘾的产生，为后续进一步开展针对性的研究奠定基础，同时为后续的临床治疗和药物开发提供新的思路和治疗靶点。
【参考文献】
[1] Dworkin R H, O'Connor A B, Kent J, et al: Interventional management of neuropathic pain: NeuPSIG recommendations, Pain, 2013,154(11):2249-2261.
[2] Rosenblum A, Marsch L A, Joseph H, et al: Opioids and the treatment of chronic pain: controversies, current status, and future directions, Exp Clin Psychopharmacol, 2008,16(5):405-416.
[3] Mercadante S: Intravenous morphine for management of cancer pain, Lancet Oncol, 2010, 11(5): 484-489.
[4] Teglund S, Toftgard R: Hedgehog beyond medulloblastoma and basal cell carcinoma, Biochim Biophys Acta, 2010, 1805(2):181-208.
[5] Iovine V, Mori M, Calcaterra A, et al: One Hundred Faces of Cyclopamine, Curr Pharm Des, 2016,22(12):1658-1681.
[6] Alfaro A C, Roberts B, Kwong L, et al: Ptch2 mediates the Shh response in Ptch1-/- cells, Development, 2014, 141(17):3331-3339.
基金项目：徐州市科技创新项目社会发展，KC16SH117.
论文作者:张茂银,王丙武,刘苏
论文发表刊物:《心理医生》2019年第1期
论文发表时间:2019/1/21
标签：吗啡论文; 信号论文; 抑制论文; 脊髓论文; 激动剂论文; 生理盐水论文; 神经元论文; 《心理医生》2019年第1期论文;