摘要：目的：维生素K3抗癌作用机制是诱导活性氧的产生同时激活碱性核酸酶，但缺乏足够的肿瘤靶向性，且水中溶解度很低，难以静脉给药。采用聚乙二醇（PEG）修饰的毫微乳运载维生素K3，有可能解决上述问题。方法：采用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（PEG2000-DSPE）、油酸制备维生素K3微乳，建立动物S-180实体肿瘤和艾氏腹水癌模型，评价维生素K3微乳的抗肿瘤作用。结果：维生素K3微乳静脉给药具有显著的抗肿瘤作用并能显著延长荷瘤动物的生命（P<0.01）。结论：维生素K3微乳有可能成为一种可以静脉注射的抗癌药物。
关键词：维生素K3；微乳；抗肿瘤作用
维生素K3（Vitamin K3）是一种人工合成的维生素K，能够抑制多种肿瘤细胞的生长[1-5]。维生素K3参与人体细胞的氧化还原循环，通过产生活性氧自由基发挥抗癌作用，其机制包括：谷胱甘肽耗竭，NADPH氧化，大分子损伤和破坏细胞内钙离子平衡，同时还能激活碱性核酸酶。但是，维生素K3水溶性差，缺乏肿瘤靶向性，不利于其发挥抗肿瘤作用。采用聚乙二醇（PEG）修饰的微乳具有一定程度的肿瘤靶向性，特别适用于运载水不溶性的抗癌药物[6]。因此，我们研制了维生素K3微乳，并对其体内抗肿瘤作用进行了评价。
1. 实验材料
1.1 药品与仪器
维生素K3，美国Sigma公司；油酸，美国Sigma公司，纯度>99.0%；聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 (PEG2000-DSPE) ，美国Polylipid Co., Ltd.；JSM-T200电子显微镜(日本电子公司)。
1.2 动物与瘤原
昆明种小白鼠, 18-20 g, 体质健康, 雌雄各半, 由沈阳医学院动物实验中心提供，许可证：
SYXK(辽)2003-0026）；S180实体瘤，艾氏腹水癌，由天津医药科学研究院提供。
2.维生素K3微乳的制备及其理化性质
在我们以前报道的实验方法基础上, 结合维生素K3的特点, 制备了维生素K3微乳(VK3-M)[7]。取1mL油酸、0.25g维生素K3、0.25gPEG2000-DSPE、50mL无水乙醇, 置入100mL旋转蒸发瓶，50℃水浴加热溶解，然后在氮气流中减压蒸发除乙醇至无乙醇味，与50mL5%葡萄糖混合,高速匀浆。在超净工作台中，无菌100 nm 微孔滤膜过滤，充氮气后封装与安瓶，即得维生素K3微乳。采用冰冻蚀刻技术制备维生素K3微乳断面，采用电子显微镜观察维生素K3微乳的形态。采用5%葡萄糖稀释维生素K3微乳100倍，用激光粒度测定仪测定维生素K3微乳的粒度分布。
3. 动物肿瘤模型的建立
在无菌条件下, 取第10-14天生长良好的S180瘤原, 剥去包膜及中心坏死组织, 选取边缘部分生长旺盛的粉白色肿瘤组织，用生理盐水洗净, 制备肿瘤组织的生理盐水匀浆（1g肿瘤组织加10mL生理盐水）。在动物右前肢腋下进行碘酒、乙醇消毒, 接种S180肉瘤生理盐水匀浆0.2mL/小白鼠，建立实体型动物肿瘤模型。在无菌条件下，选择艾氏腹水癌细胞复苏、传代三次，生长10天左右的艾氏腹水癌小白鼠，用无菌注射器抽取乳白色艾氏腹水癌细胞，生理盐水稀释10倍，用于腹水癌接种，每只小白鼠下腹部、左后肢与腹中线之间作为接种部位，每只小白鼠接种0.2mLl艾氏腹水癌细胞悬液，即得到艾氏腹水癌动物模型。
4. 维生素K3抗肿瘤作用评价
接种之日记为第0天，于接种后第1天，按体重差最小原则, 将动物分为7组（每组10只, 雌雄各半）, 分别为：空白对照，空白微乳对照组，以及维生素K3的高、中、低剂量组。根据预备试验，可制定如下给药方案: 维生素K3浓度为5mg/mL，高、中、低剂量分别为10、20、30（mg?kg?1）（实体瘤，尾静脉给药），2、4、8（mg?kg?1）（艾氏腹水癌，腹腔注射给药）。于肿瘤接种后第7天开始尾静脉给药, 共5次。实体瘤组于肿瘤接种后第20天, 处死动物, 解剖剥离S180瘤块,称瘤重, 计算肿瘤生长抑制率(TIR), 计算公式如下:
TIR (%) = [(对照组平均瘤重 ? 实验组平均瘤重) / 对照组平均瘤重] × 100%。腹水型肿瘤，记录动物存活时间，按如下公式计算生命延长率（LER）：
LER（%）= [(对照组平均存活时间 ? 实验组平均存活时间) / 对照组平均瘤重] × 100%。
5. 试验结果
5.1 维生素K3的形态和大小
维生素K3微乳的平均粒径为110 ± 12.26（nm），其冰冻蚀刻照片如图1所示。
图1 维生素K3冰冻蚀刻照片（10,0000×）
5.2 维生素K3微乳的抗肿瘤作用
尾静脉注射给药，维生素K3微乳对皮下接种的S180肉瘤的抑制作用如表1所示。腹腔注射给药，维生素K3微乳对艾氏腹水癌的抑制作用如表2所示。
表1 尾静脉注射维生素K3微乳（VK3-M）对昆明种小白鼠的S180肉瘤的抑制作用
*:空白微乳与空白对照比较，其它与空白微乳比较
6.讨论
实验结果表明，采用PEG2000-DSPE和油酸制备的维生素K3微乳，平均粒径在100nm左右，对实体型S180肉瘤和艾氏腹水癌可以具有非常显著的抑制作用，P<0.01。
PEG2000-DSPE修饰微乳表面，有可能避免网状内皮系统对微乳的吞噬和破坏作用，有助于提高维生素K3的血药浓度。肿瘤血管通透性比较高，甚至会出血，而正常组织血管通透性很低，因此维生素K3微乳有可能蓄积到肿瘤组织中，而较少进入正常组织。因此，维生素K3微乳有可能具有一定程度的靶向抗肿瘤作用，有关问题尚待进一步研究。
参考文献
[1] Gong X, Gutala R, Jaiswal AK. Quinone oxidoreductases and vitamin K metabolism. In: Gerald L, editor. Vitamins and Hormones, Academic Press. 2008，85–101.
[2] Chlebowski RT, Akman SA, Block JB. Vitamin K in the treatment of cancer. Cancer Treat Rev. 1985，12:49–63.
[3] Monteiro JP, Martins AF, Nunes C, Morais CM, Lucio M, Reis S, et al. A biophysical approach to menadione membrane interactions: relevance for menadione-induced mitochondria dysfunction and related deleterious/ therapeutic effects. Biochim Biophy Acta. 2013，1828:1899–908.
论文作者:任立震,, 陈雪娇,李佳凌,严娇 王俊平
论文发表刊物:《医师在线》2017年4月下第8期
论文发表时间:2017/6/15
标签：维生素论文; 腹水论文; 肿瘤论文; 作用论文; 动物论文; 生理盐水论文; 抗肿瘤论文; 《医师在线》2017年4月下第8期论文;