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国家自然科学基金项目:低剂量辐射对树突状细胞迁移能力影响及其分子机制研究，课题编号:81202151
[摘要] 目的：阐释胃癌中miR-638 对胃癌细胞侵袭和迁移的影响，并证明它可能是通过影响细胞骨架调节蛋白VASP 的表达水平来抑制胃癌细胞侵袭和迁移的分子机制。
方法：通过Westernblot 检测VASP 蛋白表达水平；划痕损伤修复实验检测胃癌细胞迁移能力；构建PcDNA6.2-miR-638 的真核表达载体，转染入胃癌细胞BGC-823，过表达miR-638，通过划痕损伤修复实验检测胃癌细胞迁移能力.结果：与对照组相比，过表达VASP3’UTR 使VASP 蛋白水平增加（P<0.05）；过表达VASP3’UTR 能促进胃癌细胞迁移（P<0.05）；与对照组相比，过表达miR-638 抑制胃癌细胞的迁移（P<0.05）；结论：过表达VASP3’UTR 增加VASP 蛋白水平，促进胃癌细胞的迁移；过表达miR-638 能抑制胃癌细胞的迁移；miR-638 直接靶向VASP3’UTR抑制胃癌细胞的迁移。
[关键词] 胃癌；miR-638；血管扩张刺激磷蛋白；迁移；侵袭
本文用芯片筛选胃癌和癌旁组织的microRNA 差异表达谱1-2，发现miR-610、miR-638 下调倍数分别为0.522 和0.283；生物信息学软件分析发现miR-610、miR-638 可以与VASP mRNA 3’非翻译区不完全互补配对；本实验以miR-638 为契入点，培养胃癌细胞BGC-823，利用western blot、PCR、划痕损伤修复实验、luciferase 报告基因实验等实验技术，证实外源性过表达VASP3’UTR能促进胃癌细胞侵袭转移3。
1 材料与方法
1.1 材料
主要试剂：DMEM 培养基；胎牛血清；胰蛋白酶；EDTA-Na2.2H2O；十二烷基磺酸钠 Sigma；N，N，-亚甲双丙烯酰胺 Fluka；丙烯酰胺 Amresco；TEMED Sigma；单克隆鼠抗人VASP 抗体 Alexis Biochemicals；兔抗人GAPDH 抗体 Santa cruze；HRP 或AP 标记的羊抗鼠IgG Santa cruze；HRP 或AP 标记的羊抗兔IgG Santa cruze；BCA 蛋白浓度测定试剂盒 北京普利莱公司；DAB 显色试剂盒 北京天根公司；其余试剂均为国产或进口分析纯。
主要仪器：显微镜：XDS-1B 倒置显微镜，北京顺杰欣隆有限公司；DMBRI 倒置相差荧光显微镜：LEICA，Germany；BIO-1D 凝胶成像系统: 法国Vilber Lourmat 公司；超声破碎仪：美国Sonics＆Materials 公司；凝胶成像分析系统：Syngene；PCR 仪：Eppendorf；SpectraMax M2 多功能酶标仪：Molecular Devices, USA；其余仪器均为国产。
胃癌细胞BGC-823：BGC-823细胞由我院保存。质粒：pcDNA6.2-miR-GW/EmGFP vector 购自invitrogen。菌株：DH5α，本实验室保存。引物：定购自invitrogen 公司。
1.2 实验方法
真核表达载体 pcDNA6.2-VASP 3’UTR 的构建：参考文献[4-5]方法制备载体 pcDNA6.2 大片段；以质粒pCMVSPORT-VASP-cDNA 为模板，扩增大小为803bp 的VASP3’UTR 目的片段；用DNA 纯化试剂盒回收目的基因酶切后产物。挑取单克隆菌落，37℃摇床振荡培养12～16hr（250rpm），次日提取质粒pcDNA6.2-VASP 3’UTR，送英骏公司（Invitrogen）测序。测序结果回来后，取测序结果正确的pcDNA6.2-VASP 3’UTR 质粒做转化，然后使用北京天根公司的质粒小提试剂盒提质粒。
真核表达载体 pcDNA6.2-miR-638 的构建：步骤同上。
细胞培养：细胞的换液和传代：胃癌细胞MKN-28 和BGC-823 用1640 培养基+10%的胎牛血清+1%的双抗的完全培养基培养，每次换液用无菌PBS 洗细胞一到两次，再加入培养基培养；待细胞长至80%~90%满时，用胰蛋白酶消化传代。细胞的冻存：先制备细胞冻存液，选对数生长期的细胞，用胰酶消化细胞，制成细胞悬液，移入冻存管，放入冻存盒至-80℃冰箱，24 小时后取出，放入盒子-80℃保存。
脂质体法将重组的质粒瞬时转染入胃癌细胞：细胞铺六孔板：六孔板每孔铺5×105 细胞，加入2ml 无抗生素的培养基，37℃，5%CO2 培养24 小时，待细胞生长融合至70%～80%开始转染。准备复合物：将4ug 质粒DNA 加入至250μl Opti-MEM 培养基中稀释，轻轻混匀；将10μl 的Lipofectamine 2000 加入至250μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀，置于室温孵育5 分钟。将质粒DNA 稀释液和Lipofectamine 2000 稀释液轻轻混匀，室温孵育20 分钟。（3） 将上述混合物加入六孔板各孔中，再加Opti-MEM 培养基2ml，轻轻混匀，37℃，5% CO2 培养6～8 小时后换完全培养基，共孵育24 ~48 小时后，检测目的基因表达或生物学效应。
绿色荧光蛋白表达的检测：构建的pcDNA6.2-VASP-3’UTR 表达载体中含有EmGEP 绿色荧光蛋白，可以用倒置荧光显微镜观察其转染效率。
RT-PCR 检测VASP mRNA 表达水平及Western blot 检测VASP 蛋白表达水平：均严格按照相应试剂盒说明进行操作。
损伤修复实验：在六孔板常规培养胃癌细胞。细胞同步化后，用200μl 枪头在各孔中划痕，用PBS 冲洗刮掉的细胞。转染对应质粒和或对照，继续培养细胞。分别于细胞培养的0、24、48 小时拍照。在不同的时间点，用ImageJ 软件测量划痕两侧细胞中间的间距（μm）。
1.3 统计分析
所有指标均采用Prism GrapHPad Software 统计软件进行统计分析，所有数据均来自至少三次独立实验数据，均以均数±标准差（）表示，组间两两比较采用t 检验。P<0.05 为具有统计学差异。
2 结果
2.1 构建 pcDNA6.2-VASP3′UTR 真核表达载体
以pCMVSPORT-VASP-cDNA 为模板，扩增大小为803bp 的VASP3’UTR 目的片段，插入其相应的表达载体pcDNA6.2 内，成功构建pcDNA6.2-VASP3′UTR 真核表达载体，并最终测序鉴定（图1）
2.3 VASP3’UTR 过表达对VASP 蛋白质水平的影响
在胃癌细胞中，转染pcDNA6.2-VASP3′UTR 载体，使用westren blot 检测VASP 蛋白水平。（图3，表1）BGC-823 转染入pcDNA6.2-VASP3′UTR 或control vector（pcDNA6.2-GW/EmGFP），westren blot 检测VASP 及GAPDH，VASP3′UTR组与control 组比较，差异具有显著性*P<0.05。
2.4 VASP3’UTR 过表达对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响
在胃癌细胞中，转染pcDNA6.2-VASP3′UTR 载体，用损伤修复实验检测BGC-823 细胞的迁移能力，结果显示VASP3′UTR 过表达组细胞迁移能力较阴性对照组显著增强。miR-638 过表达对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。同样的，在胃癌细胞BGC-823 中，转染pcDNA6.2-miR-638 真核表达载体，用损伤修复实验检测BGC-823 细胞的迁移能力，结果显示miR-638 过表达组细胞迁移能力较阴性对照组显著增强（图4，表2）。
3 讨论
本文认为microRNA很有可能参与调控VASP 的异常表达。在人类中，miRNA 基因被转录成长链初级转录物（pri-microRNA），它不但具有超过1kb 的较长序列，还具有序列5′端的帽子结构、3′端Poly(A)尾的特征。pri-microRNA 经过两次剪切产生成熟的miRNA。，第一次剪切在细胞核内，生成为70 个核苷酸左右大小的miRNA 前体，是具有茎-环结构的（pre-microRNA）[6]。第二次剪切位于细胞质中， pre- microRNA 被剪切成不完全互补配对的双链RNA 双体（microRNA：microRNA*），即成熟microRNA 和其互补序列所组成的二聚体。其中的成熟microRNA 链会被整合入RISC（RNAinduced silencing complex）中，而另一条链microRNA*随后会快速降解，同时成熟的miRNA 分子引导RISC 复合体结合到与其互补的mRNA 的位点通过碱基配对调控基因表达。
同时，本文还需miR-638 能直接靶向VASP3’UTR 的实验证据。这些都是本实验的不足之处，后期还要进一步完善。而且胃癌中是否还有其他的miRNA 起关键作用，miR-638 是否在胃癌中还有其他关键的靶基因，VASP 是否还受其他miRNA 的调控，都需要进一步的证明。全面阐明miR-638 和VASP 在肿瘤发展和转移中的作用，还需要动物实验和胃癌组织标本的相关性分析。
参考文献
[1] Liu K, Li L, Nisson PE, Gruber C, Jessee J, Cohen SN. Reversible tumorigenesis induced by deficiency of vasodilator-stimulated pHospHoprotein. Mol Cell Biol 1999,19:3696-3703.
[2] Lee Y, Kim M, Han J, Yeom KH, Lee S, Baek SH, et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J 2004,23:4051-4060.
论文作者:石国梁1,王利营2
论文发表刊物:《中华急诊医学杂志》2016年6月
论文发表时间:2016/12/9
标签：胃癌论文; 细胞论文; 质粒论文; 转染论文; 培养基论文; 载体论文; 蛋白论文; 《中华急诊医学杂志》2016年6月论文;