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【摘要】目的：探讨丙酮酸激酶缺乏症和ABO亚型鉴定诊断中运用PCR测序技术的临床效果。方法：选择ABO血型正反定型不符和丙酮酸激酶缺乏症患儿各1例为研究对象，通过提取外周血DNA，设计引物进行PCR测序、扩增，运用生物信息学软件分析先证者基因型，对PCR测序技术的临床价值进行分析。结果：在1例丙酮酸激酶缺乏症患儿中，发现先证者PKLR基因的7号和9号外显子区分别存在2处杂合突变，通过蛋白预测软件分析，提示两个突变导致酶活力降低和蛋白结构改变；而1例B（A）亚型患儿存在ABO基因多个变异，其第6和7外显子区分别存在2处和11处杂合变异，根据A101等位基因标准，将其血型判断为B（A）04/O06血型。结论：临床上将PCR测序技术运用在丙酮酸激酶缺乏症和ABO亚型鉴定诊断中可以使诊断的灵敏度和特异性提高。
【关键词】丙酮酸激酶缺乏症、ABO亚型、PCR测序技术
丙酮酸激酶缺乏症是比较常见的一种红细胞酶缺陷性疾病，以慢性溶血为主要表现，容易出现诸多并发症如“溶血危象”、胆红素脑病以及胆石症等，严重危害患者健康[1]。而在临床移植医学和输血医学中，ABO血型系统是比较重要的一个血型系统，但是ABO血型的亚型较多，容易增加血型鉴定难度，影响患者器官移植或输血治疗，严重的情况下，甚至导致患者死亡。因此，本文对ABO亚型鉴定和丙酮酸激酶缺乏症诊断中运用PCR测序技术的临床价值进行了探讨，如下报道。
1.资料和方法
1.1一般资料
本次研究的 1例ABO血型正反定型不符患儿，年龄10个月，女，血培养阴性；1例丙酮酸激酶缺乏症患儿，孕39周分娩，出生后出现黄疸、水肿症状，男，血型为B型，母亲为O型。
1.2方法
1.2.1试剂与仪器
选择WADiana/8XT全自动血型仪、DG Gel Neutral卡和DG Gel Confirm卡，选择上海血液生物医药有限公司提供的抗体筛查细胞、ABO细胞、单克隆抗B细胞、单克隆抗A抗体以及抗球蛋白试剂，根据NCBI GenBank基因序列设计引物，并且选择TaKaRa公司的PCR扩增试剂。
1.2.2PCR扩增与测序
运用EDTA抗凝管采集5ml外周静脉血，在600μl Buffer TBP中加入300μl抗凝全血，均匀混合后，在室内温度下放置1min直到红细胞裂解，然后以8000r/min转速进行1min离心处理，对上层血清进行分离，将Buffer PR60μl加入，均匀混合后，在-20°C条件下放置5min，将75%乙醇1ml加入，经过1-3in颠倒漂洗后，离心2min，弃上清，重复操作，将液体倒掉后再离心，运用移液器吸出残液。同时，运用DNA抽提试剂盒进行PCR扩增反应，运用ABI 3730 DNA测序仪进行测序，其所需引物见表1。
1.2.3基因分析
根据NCBI GenBank设计PCR引物，PCR引物位于内含子区，确保可以扩增出PKLR基因11个外显子的剪接位点和编码区，扩增体系见表2。
2.结果
在1例丙酮酸激酶缺乏症患儿中，发现先证者PKLR基因的7号和9号外显子区分别存在2处杂合突变，通过蛋白预测软件分析，提示两个突变导致酶活力降低和蛋白结构改变；而1例B（A）亚型患儿存在ABO基因多个变异，其第6和7外显子区分别存在2处和11处杂合变异，根据A101等位基因标准，将其血型判断为B（A）04/O06血型。
3.讨论
ABO血型通常存在O、B以及A三个等位基因，包含6个内含子和7个外显子，其长度不一，而ABO亚型的出现是因为糖基转移酶第6和7外显子基因位点出现了突变，使酶的活性发生了改变，使红细胞上表达的B或A抗原的数量或种类出现改变，从而导致血型血清学正反定型不符[2-3]。而丙酮酸激酶缺乏症（PKD）作为导致慢性非球形红细胞溶血性贫血的一个重要因素，当缺乏PK时，会减少ATP生成，使红细胞出现不可逆的膜损失，诱发红细胞脱水、僵硬以及畸变，并且这些红细胞从脾脏和肝脏通过时就会被清除，从而出现贫血症状[4]。聚合酶链式反应（PCR）作为扩增特定DNA片段的一种分子生物学技术，能够大幅增加微量DNA，能够实现相对快速的DNA测序[5]。本次研究结果显示，因为PKD和ABO亚型鉴别诊断的难度较高，通过运用PCR测序技术，能够对ABO血型正反定型不符患儿进行明确诊断，并且提高PKD诊断的准确性和特异性。
综上所述，临床上将PCR测序技术运用在丙酮酸激酶缺乏症和ABO亚型诊断中，不仅具有检测快、无创性等优点，还具有较高的准确率，可以为临床诊断和治疗提供有效依据，值得推广。
参考文献：
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[5]王凤敏,章旭,李剑平.ABO变异型A102Bw33血型基因亚型遗传学鉴定[J].中国实验血液学杂志,2016,24(01):225-228.
论文作者:张思维
论文发表刊物:《总装备部医学学报》2019年第03期
论文发表时间:2019/5/23
标签：丙酮酸论文; 激酶论文; 血型论文; 亚型论文; 子区论文; 基因论文; 红细胞论文; 《总装备部医学学报》2019年第03期论文;