汤富彬[1]2002年在《精喹禾灵的土壤微生物降解》文中认为本研究建立了除草剂精喹禾灵((RS)-2-[4-(6-氯-2-喹哑啉氧基)苯氧基]丙酸乙酯)及其代谢物残留的HPLC分析方法。在同一色谱分析条件下，可同步检测精喹禾灵及其代谢物，土壤、芝麻植株和芝麻籽粒样品进行方法添加回收率试验，均得到了较高的回收率及良好的重现性。所建立的分析方法快速简便、准确可靠。 土壤微生物对精喹禾灵在土壤环境中的降解发挥了重要的作用。起始浓度为50mg／kg的精喹禾灵在未灭菌、灭菌处理青紫泥中的降解半衰期(T1c2)分别为9.9和29.8d，在红壤中降解半衰期分别为15.7和37.5d。 供试土样(青紫泥)经精喹禾灵处理(2～50mg／kg)后培养，微生物的种群数量发生了明显改变。土壤中的细菌(Bacteria)种群数量在70d培养期内与对照组相比均有不同程度增加，其中芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞杆菌(Pseudomonas)的生长最快，弧菌属(Staphylococcus)、埃希氏菌属(Hibrio)和葡萄球菌属(Escherichia)的生长速度次之。放线菌(Actinomyce)和真菌(Fungi)的生长均受到一定的抑制，真菌受抑制的作用尤其明显。 试验筛选了对精喹禾灵具有降解作用的优势菌株NYA2(鲍氏不动杆菌Acinetobacter lcoaceticus-baumanni complex)、NYB1(巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium)NYB4(坚实芽孢杆菌Bacillus cereus)3个。在精喹禾灵添加浓度为50mg／L的基础培养基中，分别加入液量为总体积5～20％NYB1和NYB4菌株的培养液，降解试验结果表明两种菌株均对精哇禾灵的降解作用明显。并将菌株NYB1和NYB4培养液各以2mL的菌液量(OD460=0.40)分别添加到20g未灭菌的青紫泥样品中，其降解速度较未加菌液的对照处理为快。表明通过增加土壤中优势降解菌可加速精喹禾灵的代谢和分解。 田间残留试验结果显示：精喹禾灵在芝麻地土壤和芝麻植株中降解迅速，半衰期分别为1.35和1.18d，其主要降解产物精喹禾灵丙酸在土壤和植株中的半衰期则较长。芝麻收获时，精喹禾灵在芝麻籽粒中的最终残留量低于0.02mg／kg(FA0颁布的精喹禾灵在花生中的MPL值)。表明在芝麻作物上使用精喹禾灵对芝麻的食用是安全的。
吕欣[2]2012年在《叁种新型农药对土壤细菌群落结构的影响及其降解菌的筛选》文中研究表明随着传统农药纷纷被禁用,新型农药成为农民的首选。虽然新型农药与传统农药相比具有活性高、毒性小、单位用量少等优势,但是施用的农药,只有很少部分作用于靶标,而大部分残留于土壤中,造成了生态环境的严重破坏。目前国内外对于新型农药降解菌的分离、筛选及其降解能力、降解机理的研究还处于初级阶段,因此从土壤中分离新型农药降解菌,并分析其降解效果,可以为治理环境污染,发展绿色农业提供理论依据,具有重要意义。本文首先利用PCR-DGGE技术分别分析了精喹禾灵、氟虫腈和氟磺胺草醚胁迫下土壤细菌群落结构及多样性的变化。结果表明,在叁种农药分别胁迫下,土壤细菌群落结构均发生了明显的改变。其中,精喹禾灵使细菌多样性呈现出先减少后增加的趋势,氟虫腈和氟磺胺草醚使细菌多样性呈现出先增加后减少的趋势。根据DGGE图谱条带的测序结果分别推断出了对精喹禾灵、氟虫腈和氟磺胺草醚具有耐受性,或具有降解它们潜力的微生物类群,这些类群可作为减少农药残留的土着微生物资源进行分离筛选。从自然环境中分离到的可降解农药的土着微生物,因其对环境的友好性及原位修复的可行性,受到了高度关注。因此本研究将现代分子生物学中菌落原位杂交技术与传统平板培养的方法相结合,利用DGGE图谱中条带的测序结果,合成DIG标记的探针,有针对性地从上壤微生物中筛选降解菌,得到了1株可降解精喹禾灵的菌株,命名为L1,生理生化鉴定及16S rRNA基因测序结果表明该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。该菌株能以精喹禾灵作为唯一碳源生长,培养7天后,精喹禾灵的含量减少了近50%。这一结果为今后研究L1降解精喹禾灵的机理、功能基因等奠定了基础。
汤富彬, 朱国念[3]2006年在《土壤中精喹禾灵残留测定及微生物降解研究》文中认为建立了高效液相色谱法对土壤中除草剂精喹禾灵残留的测定方法,并研究了其微生物降解特性。结果表明,采用C18柱和DAD检测器,以甲醇和0.2%磷酸水溶液(274∶,V/V)为流动相,在波长234 nm进行检测,土壤中精喹禾灵的回收率为88.4%～90.4%,相对标准偏差低于6.75%。未灭菌土壤中精喹禾灵的降解速率比灭菌土壤中快,接种优势微生物后精喹禾灵的降解速率明显加快,表明微生物是土壤中精喹禾灵降解的主要因素。
侯颖, 李静泉, 尤晓颜, 王维宇, 裴韬[4]2018年在《精喹禾灵降解菌株Bacillus subtilis H的分离鉴定及降解特性》文中研究指明以精喹禾灵为唯一碳源,从长期受精喹禾灵污染土壤中分离筛选出一株精喹禾灵降解菌株H.通过形态观察、生理生化试验和16S r RNA基因序列分析,将菌株H鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).菌株H在温度为30~42℃和pH值7~9范围内,72h内对100mg/L精喹禾灵的降解率均可达95%以上.利用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)鉴定菌株H降解精喹禾灵的产物为精喹禾灵酸.这是首次报道枯草芽孢杆菌对精喹禾灵的降解.
吕欣, 彭霞薇, 呼庆, 马安周, 江泽平[5]2013年在《利用DGGE-菌落原位杂交法分离土壤中精喹禾灵降解菌》文中认为从自然环境中分离到的可降解农药的土着微生物,因其对环境的友好性及原位修复的可行性,受到了高度关注.为从土壤中筛选精喹禾灵降解菌株,首先利用PCR-DGGE技术分析了除草剂精喹禾灵胁迫下土壤细菌群落结构及多样性的变化.结果表明,添加精喹禾灵后,土壤细菌群落结构发生了明显的改变.精喹禾灵使细菌多样性呈现出增加-减少-增加的变化趋势,其中第9 d变化最大,后期趋于稳定.根据DGGE图谱条带的测序结果推断,Pseudomonas、Massilia、Burkholderia等属中的细菌对精喹禾灵具有耐受性或降解潜力,这些微生物类群可作为减少农药残留的土着微生物资源进行分离筛选.根据条带的测序结果,合成了地高辛(Digoxigenin)标记的探针,并进行了菌落原位杂交,筛选到了3株具有降解潜力的菌株,其中L1可以利用精喹禾灵作为唯一碳源生长,经16S rRNA基因鉴定该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.).利用高效液相色谱法测定了菌株L1在无机盐培养基中降解精喹禾灵的效果.结果表明,培养7 d后,精喹禾灵的含量减少了近50%,且随着精喹禾灵含量的降低,L1菌体数量增加,证实了菌株L1具有降解精喹禾灵的能力.这一结果为今后研究菌株L1降解精喹禾灵的机制、功能基因等奠定了基础.
李梦雅[6]2017年在《精喹禾灵降解菌株的分离、鉴定及其降解关键酶的基因克隆与表达》文中进行了进一步梳理精喹禾灵是一种高选择性的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂,主要应用于棉花、大豆、油菜等阔叶作物田中一年生或多年生禾本科杂草出苗后的防治。其作用机制是通过抑制乙酰Co A羧化酶,破坏分生组织生长,使杂草坏死。精喹禾灵的广泛使用及其在环境中的残留和积累造成了全球性的环境污染和生态破坏。除了直接对土壤环境、水环境和大气环境造成污染,精喹禾灵还能通过食物链在生物体内富集,对生物特别是人类的健康造成危害。因此解决其在环境中的残留问题已经成为世界各国研究的热点。精喹禾灵在环境中可以通过物理、化学和生物的方法进行降解。其中,微生物降解因其投入少,避免二次污染等特点正日益受到人们的重视。本研究的意义在于,筛选高效精喹禾灵降解菌株,研究其降解特性,以期为精喹禾灵污染环境的修复提供理论依据;同时克隆精喹禾灵降解关键酶的基因,实现其高效表达,从而进一步研究降解关键酶的酶学特性和催化机理。本研究采用富集培养法从安徽境内精喹禾灵生产厂家的污水处理系统中分离到一株高效精喹禾灵降解菌株QE-9。根据表型特征、生理生化特征以及16S r RNA系统发育分析,将其鉴定为Ochrobactrum sp.QE-9。菌株QE-9在温度20-42℃范围内生长良好,最适生长温度为30℃,最适生长p H为7.0;最适生长碳氮源为葡萄糖和酵母粉;氯霉素抗性。菌株QE-9的最适降解温度为30℃;最适降解p H为8.0;降解速率与接种量成正相关;能够在以精喹禾灵为唯一碳源的无机盐培养基中生长,并在6 d内对0.5 mmol?L-1的精喹禾灵降解率达到98%以上。采用SDS高盐法从精喹禾灵降解菌株Ochrobactrum sp.QE-9中提取高质量基因组DNA,通过鸟枪法构建基因组DNA文库,以透明圈为筛选标记从大约12000个转化子中筛选到一个阳性克隆子。通过序列测定和分析发现阳性克隆子的外源片段共有叁个阅读框(orf1-orf3),分别编码β-内酰胺酶、吡哆醇5’-磷酸氧化酶和膜蛋白。其中,orf1被命名为基因estqe,该基因长1149 bp,编码382个氨基酸,在起始密码子GTG的上游找到了﹣35区(TTCCCC)、﹣10区(TGCAAGAAT)以及距起始密码子上游8 bp处的核糖体结合位点(AAGAGG)。基因estqe编码的Est QE蛋白氨基酸序列与来自Pseudomonas stutzeriβ-内酰胺酶的氨基酸序列(AHY43609)具有99%的同源性。进一步对Est QE氨基酸序列进行比对分析发现,该序列中含有酯酶第八家族以及C类β-内酰胺酶典型的保守序列SCTK(S-X-X-K)以及另外两个在酯酶第八家族成员中常见的L-L-X-H-X-X-G和YSN序列,但是在Est QE氨基酸序列中并没有发现传统酯酶家族的保守序列G-X-S-X-G,这一现象在其他酯酶第八家族成员的研究中也发现过。菌株QE-9不能在含有100 mg?L-1 Amp或PCN等β-内酰胺类抗生素的LB平板上生长,说明Est QE并没有β-内酰胺酶活性,猜测是由于蛋白演化过程中叁维结构发生变化导致空间位阻使得蛋白活性的改变。Est QE氨基酸序列的系统发育结果表明关键酶Est QE与来自Pseudomonas fluorescens的酯酶第八家族成员Est C(AAC60471)有最高的同源性(68%),属于酯酶第八家族。另外,Est QE与其他AOPP类除草剂水解酶,精恶唑禾草灵水解酶Fe H(JF970231,KF601763,KP307927)、氰氟草酯水解酶Chb H(ADW65729)的同源性分别为34.7%、34.9%、12.5%和16.4%。PCR扩增基因estqe连接到表达载体p ET-29a(+)上构建重组表达质粒,实现了estqe在E.coli BL21(DE3)中的高效表达,通过镍离子亲和层析的方法对表达产物进行纯化研究其酶学特性。纯化后Est QE等电点约为6.5,自然状态下的分子量为43 k Da与理论数值基本一致,说明Est QE是一个单体酶。LC-MS鉴定结果表明Est QE可以通过酯键的水解将精喹禾灵转化为精喹禾灵酸,从而进一步证明Est QE是一个酯酶。以精喹禾灵为底物对Est QE的酶学特性进行研究。结果显示,其在25-55℃范围内其有很高的酶活力,最适反应温度为45℃;4℃保存2个月仍能保持93%的酶活力,50℃处理1 h酶活力也能保持在40%以上,说明其具有很高的热稳定性。在p H 5.0-9.0范围内Est QE都表现出较高的酶活力,p H 8.0时酶活力最高,p H 7.0到p H 9.0范围内较为稳定。1.0 mmol?L-1的Cu2+能严重抑制酶活性,而1.0 mmol?L-1的Ca2+和Mg2+则能分别将酶活力显着提高至142%和122%;10mmol?L-1的蛋白抑制剂PMSF、p CMB、DEPC和1%的表面活性剂SDS能强烈抑制Est QE的活性。此外,Est QE能够广泛水解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂,对各底物的催化效率为:精喹禾灵﹥精恶唑禾草灵﹥炔草酯﹥氰氟草酯﹥喹禾糠酯﹥高效氟吡甲禾灵。Est QE水解精喹禾灵的Km为142.6μM,Kcat值为48.2 s-1,催化效率值(Kcat/Km)为338s-1?m M-1。以上结果表明Est QE在芳氧苯氧丙酸酯类除草剂污染环境的修复方面具有巨大的应用前景。
李梦雅, 李杰, 戴纯, 张辉, 王光利[7]2017年在《一株高效精喹禾灵降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究》文中指出为解决精喹禾灵在环境中的残留,本实验以精喹禾灵为唯一碳源,采用富集培养法,从安徽省内受精喹禾灵污染土壤中分离到一株高效精喹禾灵降解菌(J-3),通过形态观察和16S rDNA序列分析,初步鉴定该菌株为红球菌属(Rhodococcus sp.)。菌株J-3在接种到LB液体培养基后,6 h进入对数生长期,18 h达到稳定生长期,48 h进入衰亡期。采用摇瓶振荡培养法,研究了温度、pH以及底物浓度对菌株生长能力和降解能力的影响,结果表明:菌株J-3生长和降解的最适温度为35℃,最适pH为8;在最适条件(精喹禾灵浓度100 mg/L,温度35℃,p H 8.0,接种量1%)下培养2 d可以达到98%以上的降解率。这也是首次报道红球菌属细菌对精喹禾灵降解特性的研究。通过LC-MS对降解产物进行鉴定,结果表明产物为精喹禾灵酸。基于以上研究认为,菌株J-3在精喹禾灵污染环境的生物修复方面具有潜在应用价值。
辛顺佳, 杨虹琦, 熊伟, 杨俊兴, 杨红武[8]2018年在《不同除草剂对3株土壤细菌蛋白酶活性的影响》文中进行了进一步梳理为验证不同除草剂对土壤微生物分泌蛋白酶活性的影响,以高有机质土壤中分离出的3种产蛋白酶细菌为材料,采用干酪素平板透明圈法研究二甲戊灵、异丙甲草胺和精喹禾灵3种除草剂对3种细菌蛋白酶活性的影响。结果表明,从土壤中分离的3种产蛋白酶活性高的细菌均为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)细菌,其中以蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的蛋白酶活性最高;二甲戊灵浓度低于0.198 mg/m L时不能抑制蜡样芽孢杆菌和NX-3菌株的蛋白酶活性,但能抑制短小芽孢杆菌(B.pumilus)的蛋白酶活性;异丙甲草胺浓度低于0.36 mg/m L时不能抑制蜡样芽孢杆菌的蛋白酶活性;低浓度的精喹禾灵对3种芽孢杆菌的蛋白酶活性都有很强的抑制作用。综上,二甲戊灵、异丙甲草胺和精喹禾灵3种除草剂对这3种芽孢杆菌的蛋白酶活性均有影响,且除草剂浓度越高,抑制作用越强。
参考文献：
[1]. 精喹禾灵的土壤微生物降解[D]. 汤富彬. 浙江大学. 2002
[2]. 叁种新型农药对土壤细菌群落结构的影响及其降解菌的筛选[D]. 吕欣. 北京林业大学. 2012
[3]. 土壤中精喹禾灵残留测定及微生物降解研究[J]. 汤富彬, 朱国念. 农业环境科学学报. 2006
[4]. 精喹禾灵降解菌株Bacillus subtilis H的分离鉴定及降解特性[J]. 侯颖, 李静泉, 尤晓颜, 王维宇, 裴韬. 中国环境科学. 2018
[5]. 利用DGGE-菌落原位杂交法分离土壤中精喹禾灵降解菌[J]. 吕欣, 彭霞薇, 呼庆, 马安周, 江泽平. 环境科学. 2013
[6]. 精喹禾灵降解菌株的分离、鉴定及其降解关键酶的基因克隆与表达[D]. 李梦雅. 淮北师范大学. 2017
[7]. 一株高效精喹禾灵降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究[J]. 李梦雅, 李杰, 戴纯, 张辉, 王光利. 基因组学与应用生物学. 2017
[8]. 不同除草剂对3株土壤细菌蛋白酶活性的影响[J]. 辛顺佳, 杨虹琦, 熊伟, 杨俊兴, 杨红武. 江苏农业科学. 2018
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