许丽娜[1]2003年在《鸭Ⅰ型干扰素基因的克隆及原核表达》文中指出Ⅰ型干扰素是由病毒诱导的外周血单核细胞(PBMC)和成纤维细胞产生的一种糖蛋白，具有显着的抗病毒作用。它能干扰病毒的合成与复制，是机体抗病毒感染的第一道防御系统。在1995年，Schultz等首先克隆出鸭干扰素(DuIFN)，并分别在大肠杆菌(E．coli)和COS7细胞中高效表达，发现重组的DuIFN对一些RNA病毒有很强的抗病毒能力，对原代鸭胚肝细胞中DHBV的复制有强烈抑制作用。 本实验参考GenBank发表的DuIFN全序列，应用Oligo 4.1设计一对引物，采用RT-PCR方法扩增得到一段大约600bp的DNA片段。将这个片段克隆至pMD18-T载体，序列分析结果表明，克隆的鸭Ⅰ型干扰素(DuIFN-1)基因的开放阅读框包括576bp，编码蛋白为191个氨基酸，N末端的30个疏水性氨基酸是信号肽，成熟的多肽由161个氨基酸组成。同GenBank上公布的DuIFN基因进行序列比较分析表明，在核苷酸水平上的同源性为99.65％，在氨基酸水平上的同源性为98.95％。但是，DuIFN-Ⅰ与DuIFN-Ⅱ相比，核苷酸水平的同源性仅为31.73％，氨基酸水平的同源性为7.58％。与鸡、犬和人的Ⅰ型干扰素基因进行同源性比较，在核苷酸水平分别为71.82％、42.86％和39.21％，在氨基酸水平分别为46.88％、16.36％和16.50％。 将DuIFN-Ⅰ基因特异性的亚克隆到表达载体pGEX-6p的BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点上，重组质粒转化大肠杆菌TGI和BL21(DE_3)PlysS，经1.0mmol／L IPTG诱导表达，表达产物用SDS-PAGE检测，得到大约47ku的融合蛋白，与预期的相符。 用Antheprot 5.0软件对DuIFN-Ⅰ和DuIFN的二硫键、二级结构进行预测及比较，表明二者的二硫键、二级结构无明显差异。故推断DuIFN-Ⅰ也有生物学活性。 本研究为了解国内外鸭Ⅰ型干扰素核苷酸序列演化上的关系提供了理论依据，同时也为抗鸭病毒性疾病提供了一种新型的治疗制剂。
秘晶玮[2]2004年在《鹅干扰素基因的克隆及原核表达》文中进行了进一步梳理干扰素能干扰病毒的合成与复制,是机体抗病毒感染的第一道防御系统。干扰素在哺乳动物中已进行了深入的研究,禽类干扰素的研究也已经取得了很大的进展。尤其在鸡和鸭干扰素的研究领域,但鹅干扰素的研究在国内外尚未见相关报道。 本实验参考GenBank发表的鸭α干扰素(DuIFN-α)及鸭γ干扰素(DuIFN-γ)全序列,应用Oligo 4.1及Primer Premier 5软件在其完整的阅读框架外设计上、下游引物及反转录引物,采用RT-PCR方法扩增得到一段大约600bp的IFN-α DNA片段;一段大约500bp的IFN-γ DNA片段。将两个片段分别克隆至pMD18-T载体,进行序列测定和分析,结果表明:克隆的鹅α干扰素(GoIFN-α)基因开放阅读框包括576bp,编码蛋白为191个氨基酸,N末端的30个疏水性氨基酸是信号肽,成熟的多肽由161个氨基酸组成,同GenBank上公布的鸭α干扰素(DuIFN-α)基因在核苷酸水平上的同源性为96.70%,氨基酸序列的同源性为93.72%。鹅γ干扰素(GoIFN-γ)基因的开放阅读框包括495bp,编码含有164个氨基酸的多肽,其中N末端的19个氨基酸残基可能为信号肽序列,成熟多肽为145个氨基酸。将克隆的GoIFN-γ的基因序列与GenBank上已公布的鸭γ干扰素(DuIFN-γ)基因序列相比较,核苷酸序列同源性为94.95%,氨基酸序列的同源性为93.29%。GoIFN-α与GoIFN-γ相比,核苷酸水平的同源性仅为31.26%,氨基酸水平的同源性为6.22%。将两段基因序列分别与鸡、犬和人的α及γ干扰素基因进行同源性比较,在核苷酸及氨基酸的同源性都很低。 将两种GoIFN基因特异性的亚克隆到表达载体pGEX-6p-1上,重组质粒转化大肠杆菌TGI和BL21(DE_3)PlysS,经1.0mmol/L IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE检测,得到大约44ku和40ku的融合蛋白,与预期的相符。将GoIFN-γ基因特异性的亚克隆到表达载体pET-30a的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点上,重组质粒转化大肠杆菌TGⅠ和BL21(DE_3)PlysS,也经1.0mmol/L IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE检测,得到大约18ku的融合蛋白,与预期的相符。 本实验结果为进行鹅干扰素生物制剂的研究奠定了基础,同时也为禽类干扰素的研究开辟了一个新领域。
陈斌[3]2008年在《鸭α干扰素原（真）核表达及其生物学活性研究》文中提出本文对四川省内地方品种四川麻鸭的干扰素进行如下系列研究:对四川麻鸭Ⅰ型干扰素基因IFN-αORF进行克隆、鉴定和序列分析;构建IFN-αORF基因原核表达载体和真核表达载体;IFN-α原核表达及其生物学活性研究;利用雏鸭为模型,应用免疫组织化学方法研究pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒在鸭体内的动态表达分布规律;同时对作为免疫佐剂的pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒免疫调节活性进行研究,获得以下结果:1.四川麻鸭IFN-αORF基因克隆、序列比对分析和蛋白结构预测应用Oligo6.0软件设计了两对加入EcoRI和BamHI两个酶切位点的特异性引物对,采用PCR和nest-PCR的方法,从鸭肝脏组织基因组DNA扩增得到大小两个完全包含麻鸭α干扰素ORF基因的DNA片段。其中小片段更适合用于表达,并将其进行pGEM-T载体克隆与测序,对测序结果采用ClustalX软件进行序列分析以及与北京鸭、鸡、鹅等NCBI上序列进行了比较。结果显示四川麻鸭与北京鸭ORF基因序列十分相似,其核苷酸同源性达到99.13%,氨基酸同源性为98.96%。与鸡的核苷酸及氨基酸同源性分别为71.8%、49.97-50.47%,与鹅的核苷酸同源性为96%。同时用BioEdit、NetNGlyc、TreeView软件对该基因所推测的蛋白进行了分析,结果表明四川麻鸭有2个潜在糖基化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点(Protein kinase C phosphorylation)和1个酪蛋白激酶Ⅲ磷酸化位点(Casein kinaseⅢphosphorylation site),信号肽切割位点28-29位ANA和FS氨基酸之间,成熟的鸭α干扰素有5个疏水区,无跨膜区。2.SDIFN-αORF基因原核表达载体pBV220-SDIFN-α的构建及表达产物的抗病毒活性采用BamHI和EcoRI酶切,通过定向粘末段连接法,构建了原核表达载体pBV220-SDIFN-α质粒。并将质粒转化到原核表达菌株DH5α中进行表达,采用温度诱导的方式,对诱导后的菌液进行SDS-PAGE检测。结果显示工程菌进行了表达,产生的包涵体蛋白分子量为40KD左右。对纯化后的包涵体采用稀释复性的方法复性,采用VSV/DEF系统初步检测抗病毒活性,干扰素的抗病毒活性约为150U/ml,比活力为440U/mg。应用FQ-PCR检测方法,动态监测体内抑制DHBV和体外抑制DPV病毒核酸。结果发现,表达的干扰素具有强烈的病毒复制抑制作用,具有明显的生物学活性。3.SDIFN-αORF基因真核表达载体pcDNA-SDIFN-α的构建及鉴定利用合成在引物两端的EcoRI、BamHI酶切位点,将目的基因成功地从pGEM-T载体克隆重组体中切下,并通过粘端连接的方法,连接到pUC18定向位置上,然后用EcoRI和XbaI双酶切真核表达载体pcDNA3.1(+)和pUC18-SDIFN-α,实现了SDIFN-α定向克隆到pcDNA3.1(+)载体上。四川麻鸭IFN-α真核表达重组质粒pcDNA-SDIFN-α经BamHI、EcoRI和XbaI叁种酶切验证,并测序证明四川麻鸭IFN-α的真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α构建正确。4.免疫组织化学检测真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α在鸭体内表达方法的建立及动态表达规律的研究以pcDNA-SDIFN-α真核质粒免疫鸭,分时间段采集鸭16种不同组织,建立了免疫组织化学检测方法,并应用该方法检测干扰素在体内的动态表达规律。pcDNA-SDIFN-α免疫鸭后,持续表达时间长达9周。能在肺脏细胞、心肌细胞、肝细胞、脾细胞、肠腺和肠绒毛细胞、肌肉细胞、皮肤内检测到表达产物,在14d-35d进行了高峰表达。胸腺、胰腺、法氏囊和哈德氏腺未检测到阳性黄色颗粒,肺脏、免疫部位最早出现阳性颗粒,脑组织细胞中阳性颗粒数量随时间变化较小。其中基因枪免疫鸭后,各组织中的含量和表达量呈现的总体规律为6μg组＞3μg组＞1μg组。肌肉注射免疫鸭后,各组织中的含量和表达量呈现的总体规律为200μg组＞100μg组＞50μg组,都具有一定的剂量相关性。基因枪轰击法较肌肉注射法IFN-α基因表达出现的时间早,3h就可以检测到表达产物。同时,相对于肌肉注射法免疫,基因枪轰击法所用的表达质粒用量更少。5.真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α在鸭体内免疫调节剂活性的初步研究以pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒为免疫调节剂,研究对DPV/DVH弱毒苗免疫活性调节作用。分不同时间段采血,采用MTT法测定鸭外周血T淋巴细胞转化效果、CD3+T淋巴细胞数量变化和特异性DPV中和抗体IgG水平。结果表明,一定剂量的pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒作为免疫调节剂在一定时间内能促进和提高细胞免疫和体液免疫应答,发挥着有效的正向免疫调节作用。
王岑[4]2014年在《扬州鹅α-干扰素的克隆表达及其生物学活性研究》文中研究表明干扰素是一类重要的细胞因子,具有广谱的抗病毒活性,良好的抑制细胞分裂、抗肿瘤活性以及高效的免疫调节等功能。近来,禽类相关的干扰素研究正不断地深入,尤其是就鸡和鸭干扰素而言,但鹅干扰素的相关研究报道还尚少。本实验选择抗病毒活性较强的Ⅰ型α干扰素,参考GenBank上发表的鹅IFN-a基因序列(HQ115583)设计引物,以地方品种扬州鹅(Yangzhou goose)为实验动物。采用RT-PCR的方法成功扩增出扬州鹅IFN-a全基因与成熟基因片段,大小分别为576bp、486bp。将IFN-a全长基因克隆至pGEM-T载体中,将重组质粒pGEM-T-GoIFN-a送至测序,结果表明扩增出的扬州鹅IFN-a全长基因与HQ115583在核苷酸水平上同源性达99.6%。将IFN-a成熟基因克隆至pET32a(+)载体中,构建了原核表达载体pET32a-mGoIFN-α。转化至大肠杆菌DH5a(DE3)后经IPTG诱导表达得到大小为36.3kDa的重组融合蛋白。对上述包涵体蛋白进行纯化,基本上能够得到单一的特异性条带,并通过Western Blotting检测纯化后蛋白,结果与预期一致。用重组蛋白pET32a-mGoIFN-a免疫BALB/c小鼠,获得鼠抗mGoIFN-a多克隆抗体,ELISA法测得抗体效价为1：16000。通过、Vestern Blotting对高免血清进行特异性检测,结果在36.3kDa位置出现了特异性条带,说明其具有良好的特异性与反应原性。将扬州鹅全长IFN-a基因克隆至pcDNA3.1(-)载体,成功构建了真核表达体系pcDNA3.1-GoIFN-α,并经间接免疫荧光证实了GoIFN-α在鹅胚成纤维细胞中的表达。对表达产物GoIFN-α用细胞病变抑制法测其抗VSV病毒活性,结果证明其能较好的帮助鹅胚成纤维细胞对抗VSV病毒的感染。
韩清林[5]2010年在《天府肉鸭α干扰素的原核表达及抗病毒活性研究》文中提出本文对天府肉鸭的干扰素进行如下系列研究：对天府肉鸭Ⅰ型干扰素基因IFN-αORF进行克隆、鉴定和序列分析；构建IFN-αORF基因原核表达载体；IFN-α原核表达及其生物学活性研究；利用DEF-VSV系统,对稀释复性后的天府肉鸭IFN-α成熟蛋白抗病毒活性进行了研究,获得以下结果：1.天府肉鸭IFN-αORF基因克隆、序列比对分析和蛋白结构预测应用Oligo6.0软件设计了两对加入EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点的特异性引物,从经过5μg/ml PHA诱导培养的天府肉鸭外周血单核细胞中提取RNA,采用RT-PCR的方法,扩增得到天府肉鸭α干扰素ORF基因的DNA片段。构建了pMD18-T-DuIFNα克隆载体并测序,对测序结果采用DNAStar7.0软件进行序列分析以及与鸭、鸡、鹅等GenBank上α干扰素序列进行了比较。结果显示天府肉鸭与鸭(X84764)ORF基因序列十分相似,其核苷酸同源性达到99.5%,氨基酸同源性为98.4%。与鹅(AY524422)核苷酸及氨基酸同源性分别为96.2%,92.15%；与鸡(NM_205427)的核苷酸及氨基酸同源性分别为73.4%、51.3%。同时对该基因所推测的蛋白进行了分析,结果表明天府肉鸭干扰素有2个潜在糖基化位点,8个潜在的磷酸化位点,信号肽切割位点28-29位ANA和FS氨基酸之间,存在跨膜区。2.天府肉鸭IFN-α成熟蛋白基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备构建天府肉鸭IFN-α成熟蛋白基因的重组原核表达载体pET-32a(+)-mDuIFNα,将其转化入大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS表达菌株,利用IPTG进行诱导表达,得到大小约为35 kDa的重组融合蛋白,与预期表达的蛋白大小相一致,主要以包涵体的形式存在。最佳表达优化条件为0.2 mmol/L的IPTG,37℃下诱导3～4 h。利用纯化的重组蛋白制备兔抗高免血清,琼脂糖扩散试验效价为1：32。兔抗鸭IFN-α成熟蛋白IgG经硫酸铵盐析和High-Q阴离子交换层析纯化具特异性强的优点。3.天府肉鸭α干扰素成熟蛋白基因原核表达产物的复性及抗病毒活性研究对纯化后的天府肉鸭IFN-α成熟蛋白包涵体采用稀释复性的方法复性,采用DEF-VSV系统初步检测抗病毒活性,干扰素的抗病毒活性约为256U/ml,比活力为646.4U/mg。结果发现,表达的干扰素具有抑制病毒增殖的生物学活性。
龚永强[6]2007年在《鸭α-干扰素基因的原核表达及抗病毒活性研究》文中提出鸭α-干扰素成熟蛋白基因原核表达载体的构建、表达及生物活性研究根据本课题组克隆、构建的PBV220-IFN(ORF)序列，利用permer5．0设计引物扩增出成熟蛋白基因并克隆到PMD18-T载体，测序鉴定后将其连接到原核表达载体pET32a~+，转化宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后获得高效表达。表达的重组蛋白分子量大小约37 KDa，以包涵体形式存在，占菌体总蛋白的30％。重组蛋白经镍金属螯合介质填料(Ni-MIAC)后得到纯化。利用稀释复性和柱上复性两种方法对包涵体进行复性，以在DEF上抗VSV的生物学活性效价检测其效价。稀释复性中，通过添加L-Arg使鸭α-干扰素成熟蛋白得到初步复性，表现出800U／mg的抗VSV活性，对柱上复性的鸭α-干扰素成熟蛋白，得到比活力为12800U／mg的DuIFN-α成熟蛋白。利用定量PCR的方法对受30U(15U／ml)DuIFN-α成熟蛋白保护的鸭胚层纤维细胞(DEF)中的DPV强毒进行抗病毒活性检测。结果显示：在DPV感染后15 h内，重组鸭α-IFN抗DPV组的病毒核酸拷贝数与不加鸭α-IFN的阳性对照组之间差异不显着(P＞0.05)；从23h开始鸭α-IFN保护组的核酸拷贝数低于阳性对照组并在感染后47h-55h其拷贝数差异达到最大，差异显着(P＜0.05)；与阳性对照组的DPV拷贝数相比，鸭α-IFN保护组在55h时能减少病毒10~(8.83)个核酸拷贝数，相对抑制率为80％。表明重组鸭α-IFN能明显抑制对数期的DPV复制，具有进一步临床应用的潜力。鸭α-干扰素ORF序列的原核表达及生物活性研究根据本课题组克隆、构建的PBV220-IFN ORF序列，利用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切其ORF后连接到原核表达载体pET32a~+，转化宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后获得表达。表达的重组蛋白分子量大小约42 KDa，以包涵体形式存在。利用镍金属螯合介质填料对表达产物进行纯化和柱上复性。对复性的鸭α-干扰素ORF，利用鸭α-干扰素ORF在DEF上抗VSV的效价检测其生物学活性。结果表明：经Ni-MIAC纯化-复性后得到比活力为450U／mg的DuIFN-αORF蛋白。比较经Ni-MIAC复性后鸭α-干扰素ORF和鸭α-干扰素成熟蛋白抗VSV的活性，表明鸭α-干扰素ORF上的信号肽序列不利于该蛋白的复性。
张颖[7]2013年在《表达延边饲养鹅α干扰素基因重组禽痘病毒的构建及表达产物对鹅细小病毒活性影响的初步研究》文中研究说明干扰素(Interferon,IFN)是由机体细胞产生的一类具有抗肿瘤、抗病毒、调节免疫功能等多种生物活性的糖蛋白,是机体防御系统的重要组成部分。在众多干扰素类型中,a干扰素具有广谱的抗病毒活性和良好的免疫调节作用,能够增强机体的免疫力。为了开展延边饲养鹅a干扰素基因及其重组载体疫苗的研究,本试验应用植物血凝素(PHA)刺激延边饲养鹅外周血单核细胞,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增编码鹅α干扰素的基因,将目的基因经TA克隆后进行序列测定分析,将测序正确的经双酶切,构建重组原核表达质粒pET-30a-IFN-α,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,对表达融合蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定,将蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗延边饲养鹅a干扰素成熟蛋白多克隆抗体,通过琼脂糖扩散试验经行效价检测。结果表明,扩增的鹅α干扰素基因全长576bp,编码192个氨基酸；成功构建了重组原核表达载体pET-30a-IFN-a,表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western-blot检测,分子质量大小约为29ku,并具有良好的反应原性;成功制备鼠抗鹅a干扰素成熟蛋白多克隆抗体,琼脂糖扩散试验检测效价为1：32。为了研究表达延边饲养鹅α干扰素基因重组活载体疫苗的抗病毒活性,本试验通过RT-PCR技术扩增得到延边饲养鹅α干扰素基因,利用基因重组技术构建了pSY681-LP2EP2-IFN-α-Lac转移载体,采用脂质体转染方法将该重组质粒与禽痘病毒FPV-017共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行蓝白斑筛选,收获纯化的重组病毒,并进行重组病毒α干扰素基因的PCR鉴定及重组病毒的间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测,通过细胞病变分析干扰素的抗病毒活性。结果显示,成功制备了重组禽痘病毒rFPV-IFN-α,PCR结果显示成功将延边饲养鹅a干扰素基因亚克隆到禽痘病毒载体,间接免疫荧光和Western blot检测表明延边饲养鹅α干扰素基因在CEF中成功获得表达,且具有良好的反应原性;表达产物α干扰素对鹅细小病毒(GPV)在鹅胚成纤维细胞中的复制具有抑制作用。本研究为进一步开展延边饲养鹅α干扰素基因重组活载体疫苗的体内试验和鹅α干扰素免疫调节作用奠定了基础。
包晶晶[8]2006年在《重组鸭α、γ干扰素的研制及其抗病毒作用研究》文中研究指明近几年随着养殖规模的扩大和集约化程度的不断提高，鸭病的种类也越来越多，其危害也越来越严重，目前流行严重的鸭病毒性疾病主要有鸭病毒性肝炎、鸭瘟、鸭流感等。干扰素系统是机体对抗病毒感染的重要防御系统。由于抗体、补体仅存在于血清和细胞外液中，故它们对在细胞内繁殖的病毒无作用。而当干扰素系统被激活后，血清干扰素可以在几分钟之内散布到身体的各种器官中，而细胞接触干扰素只需几分钟，就产生抗病毒状态。并且，动物可以在1～3周时间内对其它病毒的重复感染也有抵抗作用。根据干扰素的氨基酸序列、抗原性和细胞来源的不同可将其分为2个型：Ⅰ型干扰素的主要成员为α-干扰素和β-干扰素，Ⅱ型干扰素为γ干扰素。Ⅰ型干扰素具有较强的抗病毒功能，Ⅱ型干扰素抗病毒功能稍弱，但免疫调节功能较强。自1986年以来，各型重组干扰素相继投放市场，在医学临床治疗过程中发挥了巨大的作用，特别是对病毒性肝炎等的治疗效果明显，而且副作用较轻。相对而言，动物干扰素的研究滞后许多，目前仍主要停留在基础研究和临床试验阶段，且大多数集中在猪、鸡、鱼等少数动物，但近年来也取得了不小的进步，目前已有商品化的猪、犬、鸡等重组干扰素产品面市。近年来，鸭干扰素(Duck interferon，DuIFN)的抗病毒和疫苗佐剂功能也在更多的试验中被发现和证实。本研究的目的就是应用基因工程和蛋白质工程技术研制出具有自主知识产权的重组鸭α和γ干扰素并研究其抗病毒功能，为我国重组鸭干扰素的工程化生产及其在养鸭业中的应用奠定基础。研究主要从以下几个方面展开： 1．经Con A刺激诱导鸭外周血单核细胞(PBMC)，应用RT-PCR法扩增出鸭α干扰素(DuIFN α)基因并克隆到pMD 18-T载体，测序结果表明：扩增片段是含有信号肽的鸭α干扰素完整基因，与NCBI上登录的DuIFN-α基因序列(accession number X84764)同源性为100％。亚克隆鸭α干扰素成熟蛋白编码基因，将特异性片段连接至原核表达载体pET28a(+)，构建原核表达载体pET28a-DuA，并进行表达，经SDS-PAGE分析，原核表达产物为约28kD的融合蛋白，表达产物约占菌体总蛋白的22.8％。表达产物以包涵体形式存在。
韩春来[9]2005年在《鸡干扰素与干扰素受体重组蛋白的生物学特性及其相互作用》文中研究指明干扰素是一种具有抗病毒、抑制细胞增殖和免疫调节活性的细胞因子,干扰素与干扰素受体结合后启动信号传导和干扰素基因的转录。本文克隆并表达了惠阳胡须鸡IFN-α、IFN-β、IFNAR1、IFNAR2基因;首次克隆了鸡IFNGR2全长cDNA;分析了干扰素受体在外周血淋巴细胞和各器官组织中的分布;并对IFN-α、IFN-β与其受体在体外的相互作用和重组蛋白的二级结构进行了研究。 以肝脏DNA为模板,克隆了惠刚胡须鸡IFN-α基因,与Genbank上IFN-α的同源性为96.9%～97.9%,是一个新的亚型;克隆了惠阳胡须鸡IFN-β和AA肉鸡IFN-β基因,与白色来亨鸡IFN-β的核苷酸序列同源性分别为99.84%、100%,目前鸡IFN-β尚未发现亚型的存在。构建了鸡IFN-α/pGEX-6P-1和IFN-β/pGEX-6P-1重组质粒,在BL21中诱导表达,可溶性蛋白通过亲和层析得到纯化并采用Western-blot得到了鉴定。IFN-α、IFN-β重组蛋白具有较高的生物学活性,在CEF/VSV系统中的抗病毒活性为7.9×10~5U/mg和6.4×10~4U/mg。 从惠阳胡须鸡肝脏总RNA中扩增了Ⅰ型干扰素受体的两个亚基:IFNAR1、IFNAR2。惠阳胡须鸡IFNAR1、IFNAR2分别与红色原鸡的IFNAR1、IFNAR2的氨基酸序列同源性为99.47%和98.82%,均为新的亚型。在IFNAR1氨基酸序列的35-133、134-237、240-319和341-447处有四个典型的干扰素受体家族的保守性motif:Fibronectin Ⅲ型分子,123-129和302-321处有两个典型的linker;在IFNAR2氨基酸序列的37-93处和129-240处有两个Fibronectin Ⅲ型分子,在94-105和157-166处有两个典型的linker。构建了鸡IFNAR1EC/pGEX-6P-1、IFNAR2EC/pGEX-6P-1重组质粒并转化到BL21中诱导表达,可溶性蛋白通过亲和层析得到纯化并采用Western-blot得到了鉴定。 以惠阳胡须鸡脾脏总RNA为模板,采用5′RACE和3′RACE的方法首次克隆了IFN-γ受体β链全长cDNA序列,共2221bp。这一基因编码334个氨基酸,与小鼠、大鼠和人IFNGR2氨基酸的同源性分别为29%、28%和30%;在氨基酸序列的31-119和126-217处含有两个Fibronectin Ⅲ型分子,在96-115和115-131处有两个linker。将采用RACE克隆的这一基因命名为惠阳胡须鸡IFNGR2(HuiYang chicken IFNGR2)。Genome BLAST的结果显示IFNGR2与IFNAR1、IFNAR2、IL-10R2串联排列于鸡的1号染色体上。 采用Northern杂交和RT-PCR的方法,分析了鸡IFN-α、IFN-β、IFNAR1EC、IFNAR2EC和IFNGR2EC基因在脾脏、胸腺、法式囊、胸肌、心肌、肾脏、肝脏、盲肠扁桃体、未刺激外周血淋巴细胞(PBL)和ConA刺激PBL中的表达水平。IFN-α、IFN-β基因在组织和未刺激的PBL中呈关闭状态,在ConA刺激的PBL中表达水平很高。未刺激的PBL中IFNAR1、IFNGR2的表达水平很高,IFNAR2的表达水平较低,ConA刺激后IFNAR1、IFNAR2和IFNGR2的表达水平没有明显上升。在脾脏、胸腺、法氏囊和盲肠扁桃体中均可检测到IFNAR1、IFNAR2和IFNGR2的表达;IFNGR2在胸肌、心肌、肝脏和肾脏中表达水平也较高。RT-PCR的结果与Northern杂交的结果基本一致。鸡IFNAR1、IFNAR2和IFNGR2在免疫器官中的表达量较高,表明其参与机体的抗病毒和免疫调节过程。
赵婷婷[10]2011年在《鹅干扰素-α在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性研究》文中指出干扰素(interferons, IFNs)是一种可诱导细胞因子的多基因家族,其主要作用是抵抗病毒感染的免疫防御以及抗增殖和免疫调节作用,作为生物药剂和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。为了更好的探讨基因工程技术来开发重组鹅IFN-α制剂的可能性,本研究将去除信号肽的鹅α干扰素基因置于毕赤酵母α因子分泌信号肽后,构建能分泌表达goIFN-α蛋白的重组表达质粒pPICZaA-goIFN-α,将其转化到毕赤酵母宿主菌X33中,实现了其在毕赤酵母中的高效表达。并采用微量细胞病变抑制法分析研究了goIFN-α生物活性,为进一步的研究与开发鹅干扰素类制剂打下基础。其主要结果如下：1、根据NCBI上本课题组已提交的天府肉鹅基因序列(序列号为HQ115583),设计并合成一对引物,应用PCR技术从含有天府肉鹅IFN-α完整基因的重组质粒pMD18-T-goIFN-α中扩增鹅α干扰素的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,克隆到pMD18-T载体上。将DNA序列测定正确的克隆质粒pMDT-IFNa用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后与同样经EcoRⅠ和XbcⅠ双酶切的pPICZαA连接过夜,转化大肠杆菌感受态DH5a,得到重组表达质粒pPICZaA-goIFN-a,并对重组表达质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定以及序列测定。2.将验证正确的重组表达质粒用sacⅠ进行单酶切,采用电转化法将线性化的重组质粒电穿孔导入毕赤酵母宿主菌X33,涂布YPDS+Zeocin选择性培养基,置30。C温箱培养3-5天,结果获得多个白色的菌落。分别挑选生长良好的3株不同的白色单菌落,先用BMGY培养基激活培养,离心后用BMMY培养基重悬菌体,每隔24小时添加1%的甲醇进行诱导表达72小时后,离心收集菌液。冻干法浓缩后的菌液,经斑点杂交筛选出高拷贝的转化子。将筛选出的高拷贝菌落重新进行诱导表达,并用Elisa法确定最佳的表达时间和甲醇浓度。重组子经最佳表达方法诱导表达后,离心收集菌液,用TCA浓缩后的蛋白,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,结果表明分泌于胞外的鹅IFN-α蛋白分子量大约为22 kDa,比理论值(18.7 kDa)略大,估计是表达产物在表达过程中发生一定的糖基化所致。3.采用微量细胞病变抑制法评价了表达的重组鹅IFN-α的抗病毒活性。制备鹅胚成纤维细胞,采用TCID50法测定VSV病毒株的鹅胚成纤维细胞的半数感染量。表达的蛋白经透析、过滤除菌处理后,分析研究其生物活性,结果显示鹅IFN-α对水泡型口炎病毒在鹅胚成纤维细胞中可起抑制作用,抗病毒活性为1.79×103U/ml。综上所述,本研究成功的克隆了天府肉鹅干扰素-α基因,成功构建了鹅IFN-α的真核表达质粒,实现了其在毕赤酵母中的高效表达,表达产物并具有明显的抗病毒活性。
参考文献：
[1]. 鸭Ⅰ型干扰素基因的克隆及原核表达[D]. 许丽娜. 东北农业大学. 2003
[2]. 鹅干扰素基因的克隆及原核表达[D]. 秘晶玮. 东北农业大学. 2004
[3]. 鸭α干扰素原（真）核表达及其生物学活性研究[D]. 陈斌. 四川农业大学. 2008
[4]. 扬州鹅α-干扰素的克隆表达及其生物学活性研究[D]. 王岑. 南京师范大学. 2014
[5]. 天府肉鸭α干扰素的原核表达及抗病毒活性研究[D]. 韩清林. 四川农业大学. 2010
[6]. 鸭α-干扰素基因的原核表达及抗病毒活性研究[D]. 龚永强. 四川农业大学. 2007
[7]. 表达延边饲养鹅α干扰素基因重组禽痘病毒的构建及表达产物对鹅细小病毒活性影响的初步研究[D]. 张颖. 延边大学. 2013
[8]. 重组鸭α、γ干扰素的研制及其抗病毒作用研究[D]. 包晶晶. 南京农业大学. 2006
[9]. 鸡干扰素与干扰素受体重组蛋白的生物学特性及其相互作用[D]. 韩春来. 中国农业大学. 2005
[10]. 鹅干扰素-α在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性研究[D]. 赵婷婷. 四川农业大学. 2011
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