赵晶[1]2002年在《重组抗体/granzyme B分子对肿瘤细胞特异性杀伤的研究》文中认为恶性肿瘤的基因治疗是新兴的研究领域，具有广阔的发展前景。以诱导细胞死亡作为肿瘤基因治疗的手段，必须解决诱导方法的特异、高效、持续、低毒副作用等问题。 granzyme B(粒酶B，GrB)是丝氨酸蛋白酶家族的成员，是CTL(细胞毒性T淋巴细胞)和NK(自然杀伤)细胞产生的主要杀伤性分子。GrB介导的死亡途径是多层次、多水平的，GrB基因可以作为杀伤肿瘤细胞的有力工具。 本文首先证实了活性型GrBa基因异位表达具有细胞致死效应。胞浆中过表达的GrBa蛋白通过自身的丝氨酸蛋白酶活性，切割细胞内重要的结构和功能蛋白，介导转染细胞死亡。形态异常的多核巨细胞是GrBa介导的死亡途径中特殊的现象，由细胞骨架和有丝分裂异常所致。 将针对肿瘤抗原HER-2的单链抗体基因与活性型GrBa基因用绿脓杆菌外毒素(PE)的转位肽序列相连接，形成Ab-PE Ⅱ-GrBa(immunoGrB)基因。表达的immunoGrB蛋白进入肿瘤靶细胞的内吞小体后，发生Arg279和Gly280之间肽键的定点裂解，裂解后的PE Ⅱ-GrBa被转位到细胞质中。本文比较了不同长度转位肽(PE253-364aa和253-358aa)的作用效果。一方面， 男 曰 旱 匡 大 学 忆 士 学 位 论 丈 从瞬时表达、可诱导表达和组成性表达叁方面研究证明，N端部分PE 11序 列①E 280习64。和280上58 aa）的存在基本不影响GrBa诱导转染细胞死 亡的作用。其中N端融合有较短肽段（PE 280－358 aa）的重组GrBa蛋白具 有较强的蛋白酶活性和细胞生长抑制率，与单独活性型GrBa的作用程度接 近。另一方面，从瞬时转染和稳定转染角度研究证实，immunoGrB分子不具 有杀伤活性，它只有当特异性内化入HER－2阳性肿瘤细胞后才转变为活性形 式。初步的动物实验结果表明，immunoGrB分子具有体内抗HER－2阳性肿 瘤活性，能特异性杀伤HER－2阳性肿瘤细胞。 将immunoGrB基因稳定转染Jurkat细胞，观察到修饰的淋巴细胞能产 生和分泌inuntmoGrB分子，并且淋巴细胞能正常生长和建株。共培养实验 表明，分泌immunoGrB蛋白的淋巴细胞特异性杀伤HER－2阳性肿瘤细胞， 而对HER－2阴性的肿瘤细胞和正常细胞没有杀伤作用。含有较短转位序列 OE 11 253习58 aa）的 nununoGrB修饰的淋巴细胞杀伤作用最强，杀伤率可 达到70％以上。上述结果为基因修饰的自体淋巴细胞回输策略提供了体外实 验依据。 综上所述，用l’－－－－－－tinoGrB基因修饰的淋巴细胞杀伤HER－2阳性肿瘤， 可以特异性地在肿瘤细胞内部引发死亡。irnmunoGrB分子对肿瘤细胞的杀伤 作用具有特异性和高效性，并且分子本身对人体为低免疫原性，有利于长期 使用，这对于肿瘤的治疗具有重要的理论意义和实用价值。
汤旭东[2]2007年在《小鼠肝素酶H-2K～b限制性CTL表位的预测、鉴定及其体内抗肿瘤免疫效应研究》文中认为研究背景和目的恶性肿瘤是严重影响人类健康的重要疾病之一,目前对恶性肿瘤的治疗仍然以手术切除、放射治疗、化学治疗为主要手段。手术治疗对早期肿瘤具有良好的治疗效果,但中晚期患者由于多发生局部侵润和远处转移,已失去手术治疗的指针,而放化疗由于其毒副作用大而往往不为患者所接受。因此,有必要寻找一种新的、特异性强的、主要针对于中晚期肿瘤患者的治疗方式,以尽可能地减轻患者的痛苦,延长患者的生命。近年来,以树突状细胞(Dendritic cells, DC)为基础的肿瘤免疫治疗因毒副作用小、特异性强而越来越受到学者们的重视。肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen, TAA)与DC的结合是目前以DC为基础的肿瘤免疫治疗的主要方式。目前已发现并克隆了许多肿瘤相关抗原,但这些TAA的组织特异性太强,如AFP来源于肝癌、PSA来源于前列腺癌、CEA来源于消化道及呼吸道肿瘤,以这些抗原为靶位的免疫治疗只能针对表达这些抗原的肿瘤细胞,因此治疗窗太小。因此有必要寻找一种广谱的肿瘤相关抗原用于肿瘤的免疫治疗。理想的肿瘤相关抗原应该具备:(1)在绝大多数肿瘤组织中表达从而可以广泛应用;(2)只表达于肿瘤细胞以避免自身免疫反应;(3)不表达于正常成熟组织以避免免疫耐受;(4)在肿瘤的发生发展过程中具有不可替代的作用,以避免抗原缺失;(5)能诱导足够强度的免疫反应并导致肿瘤消退;(6)同时包含有MHCⅠ和MHCⅡ类分子,从而可诱导CD4+和CD8+ T细胞反应。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)介导的特异性细胞免疫在机体抗肿瘤中起着非常重要的作用,能有效激发特异性CTL应答是目前肿瘤免疫治疗的重要研究目标。随着对机体抗肿瘤免疫机制的深入研究,人们已经认识到诱发体内细胞毒T淋巴细胞发挥抗瘤作用的并不是整个肿瘤抗原分子而是与MHC分子结合的短肽即CTL表位(epitopes),因此,寻找特异性肿瘤抗原及其相应的CTL表位成为肿瘤免疫治疗的热点。肝素酶(Heparanase, Hpa)是目前发现的唯一能够降解细胞外基质(Extracellular matrix ,ECM)及基底膜(Basal membrane, BM)中硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPG)的内源性糖苷内切酶,在正常组织中除淋巴细胞、骨髓等少有表达外,在正常成熟的非免疫组织中(如心、肺、肝脏、骨骼肌及胰腺等)均不表达,但在几乎所有的转移性恶性肿瘤细胞中普遍存在,抑制肝素酶的表达可以明显抑制肿瘤的增殖及转移。由于Hpa的活化,肿瘤细胞不仅可以突破ECM及BM屏障,而且还可以释放多种因子,促进肿瘤新生血管的生成及肿瘤细胞的局部定殖,Hpa的活化是肿瘤细胞发生转移的一个重要因素。某些肿瘤细胞为逃避免疫监视而下调肿瘤相关抗原的表达,但如果为逃避免疫监视而下调Hpa的表达,其本身就足以抑制肿瘤细胞的增殖及转移。因此,Hpa可以作为一种广谱的肿瘤转移相关抗原用于中晚期肿瘤的免疫治疗。我们既往的研究也发现负载了Hpa全长基因的DC可以诱导肝素酶特异性CTL反应,对Hpa阳性的且HLA匹配的胃癌细胞具有明显的免疫杀伤效应,对于Hpa阳性但HLA不匹配的胃癌细胞则不具有杀伤效应。该结果不仅提示Hpa是肿瘤免疫治疗的一个新的靶点,而且提示其氨基酸全长序列中肯定存在CTL抗原表位,这种表位经DC递呈后可以激活CTL,从而发挥抗肿瘤效应。基于以上分析,本研究拟在国家自然科学基金的资助下,从小鼠肝素酶(mHpa)抗原表位的预测和鉴定开始,系统研究mHpa抗原表位能否在动物体内诱导mHpa特异性的CTL反应,为肝素酶抗原表位的临床应用提供理论依据。方法1.应用表位预测的超基序、量化基序结合人工神经网络方案,在互联网上对小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL表位进行预测;根据预测结果,应用固相合成法正确地合成了高纯度的候选表位肽;使用小鼠TAP缺陷的RMA-S细胞在体外对合成的候选表位肽进行肽与H-2K~b分子的亲和力分析;采用标准~(51)Cr释放试放实验检测候选表位诱导的CTL对同来源的鼠源性肿瘤细胞的免疫杀伤效应,初步筛选出能诱导mHpa特异性的抗原表位。2.分离培养C57BL/6(H-2K~b)小鼠骨髓来源的树突状细胞(mDC) ,联合rmGM-CSF、rmIL-4及rmTNF-α诱导mDC成熟,利用光镜及电镜技术从形态学上进行鉴定,并结合流式细胞术从细胞表面CD分子进行鉴定;用上述筛选的候选表位负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠叁次,然后取其脾淋巴细胞作为效应细胞,采用标准51Cr释放试验检测肝素酶特异性CTL对B16黑色素瘤细胞(mHpa~+, H-2K~(b+))、Lewis肺癌细胞(mHpa~+, H-2K~(b+))、EL-4淋巴瘤细胞(mHpa~+, H-2K~(b+))以及P815肥大细胞瘤细胞(mHpa~+, H-2K~(d+))的免疫杀伤效应;采用H-2K~b单克隆抗体封闭上述靶细胞的H-2K~b位点后再用肝素酶表位特异性CTL杀伤上述靶细胞,以研究筛选的肝素酶表位是否受H-2K~b限制;采用标准~(51)Cr释放试验研究了肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞和mDC的免疫杀伤活性,以研究肝素酶特异性CTL可能产生的毒负作用;采用ELISPOT法检测了肝素酶特异的效应细胞的IFN-γ释放情况。3.为研究上述筛选的表位肽对实验动物的免疫保护效应,先用候选表位负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠叁次,再将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一月后处死,观察肿瘤大小的变化;为研究上述筛选的表位肽对实验动物的免疫治疗效应,先将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一周后待肿瘤长至1mm时,再用候选表位肽负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠,一月后处死荷瘤鼠,观察肿瘤大小的变化。结果1.采用生物信息学技术利用互联网上提供的表位预测程序预测出5条肝素酶候选表位肽,即mHpa386-393(VDENFEPL)、mHpa351-358(FAAGFMWL)、mHpa 398- 405 (LSLLFKKL)、mHpa234-241(LGEDFVEL)、mHpa519-526 (FSYGFFVI);亲和力分析发现预测的5条多肽均能与RMA-S细胞表达的H-2K~b分子有效结合;采用标准51Cr释放实验检测上述肝素酶表位肽负载mDC后诱导的肝素酶特异性CTL对B16黑色素瘤细胞、Lewis肺癌细胞的免疫杀伤效应,结果表明,mHpa398-405、mHpa519-526诱导的CTL对靶细胞具有明显的杀伤效应,而mHpa386-393、mHpa351-358和mHpa234-241诱导的CTL对靶细胞的杀伤效应较弱,提示mHpa398-405、mHpa519-526可以作为小鼠肝素酶候选表位用于下一步的实验研究。2.分离培养C57BL/6(H-2K~b)小鼠骨髓来源的树突状细胞(mDC),用重组小鼠细胞因子(rmGM-CSF、rmIL-4及rmTNF-α)联合诱导扩增,经形态学及细胞表面CD分子鉴定,成功制备小鼠骨髓来源的成熟DC;用mHpa398-405、mHpa519-526负载骨髓源的mDC,于皮下注射免疫C57BL/6小鼠叁次,取其脾淋巴细胞作为效应细胞,采用标准51Cr释放实验检测肝素酶抗原表位特异性CTL对不同的鼠源性肿瘤细胞的免疫杀伤效应,结果表明,肝素酶特异性CTL对肝素酶阳性且H-2K~b阳性的B16黑色素瘤细胞、Lewis肺癌细胞以及EL-4淋巴瘤细胞具有明显的杀伤效应,而对肝素酶阳性但H-2K~b阴性的P815肥大细胞瘤细胞不具有杀伤效应,我们还发现,肝素酶特异性CTL对表达肝素酶的自体淋巴细胞和mDC没有明显的杀伤效应;用H-2K~b封闭靶细胞表面的H-2K~b标记,再用肝素酶特异性CTL对靶细胞进行杀伤研究,结果表明,肝素酶抗原表位特异性CTL对封闭了H-2K~b的靶细胞无明显杀伤效应,提示上述CTL反应是肝素酶特异、且受H-2K~b限制的;采用ELISPORT检测肝素酶特异性效应细胞IFN-γ的分泌能力,结果表明,肝素酶抗原表位能明显促进效应细胞IFN-γ的分泌。3.为在体研究mHpa398-405、mHpa519-526肝素酶表位肽对小鼠的免疫保护及免疫治疗效应,我们先将mHpa398-405、mHpa519-526负载的mDC疫苗分别免疫C57BL/6小鼠,每周一次,共免疫叁次后,再将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一月后处死,观察肿瘤大小的变化,结果表明,mHpa398-405、mHpa519-526免疫保护组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽及未保护组,提示mHpa398-405、mHpa519-526对荷瘤小鼠具有明显的免疫保护效应;进一步我们先将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,一周后待肿瘤长至1mm时,再用mHpa398-405、mHpa519-526肽负载的mDC疫苗分别免疫C57BL/6小鼠,一月后处死荷瘤鼠,观察肿瘤大小的变化,结果表明,mHpa398-405、mHpa519-526免疫治疗组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽及未治疗组,提示mHpa398-405、mHpa519-526对荷瘤小鼠具有明显的免疫治疗效应。结论1.采用生物信息学并结合实验技术首次从小鼠肝素酶全长氨基酸序列中筛选出2条受H-2K~b限制的CTL表位,即mHpa398-405 (LSLLFKKL)和mHpa519-526 (FSYGFFVI)2.动物实验表明mHpa398-405、mHpa519-526可以诱导产生肝素酶特异性CTL,对肝素酶阳性且H-2K~b相匹配的肿瘤细胞具有明显的免疫杀伤活性,对H-2K~b阴性的肿瘤细胞不具有杀伤效应,对封闭了H-2K~b的靶细胞亦无明显杀伤效应,提示小鼠肝素酶抗原表位诱导的CTL反应是肝素酶特异且受H-2K~b限制;小鼠肝素酶特异性CTL对表达肝素酶的自体淋巴细胞和mDC无免疫杀伤活性,提示小鼠肝素酶抗原表位的安全性;小鼠肝素酶抗原表位mHpa398-405、mHpa519-526负载的mDC可以促进效应细胞IFN-γ释放,提示小鼠肝素酶抗原表位可以促进非特异性的抗肿瘤免疫效应。3. mHpa398-405、mHpa519-526对荷瘤小鼠具有明显的免疫保护及治疗作用。以上研究表明,小鼠肝素酶特异性抗原表位mHpa398-405、mHpa519-526不仅能激发机体特异性的抗肿瘤效应,而且还能诱导一个非特异性抗肿瘤的良性循环,这种小鼠肝素酶多肽疫苗具有广谱、高效、特异、安全的优点。本研究从动物在体实验初步证实了肝素酶抗原表位多肽疫苗临床应用的可能性。
张莉, 赵晶, 王智, 温伟红, 张盈华[3]2003年在《截短型转位肽重组抗体/颗粒酶B基因的构建及表达》文中认为目的 :构建携带截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因的真核表达载体 ,并将其在HER2阳性SKBR 3肿瘤细胞及HER2阴性Hela肿瘤细胞中表达。方法 :用PCR法获得截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因片段 ,并克隆构建真核表达载体 ,以脂质体法转染SKBR 3细胞及Hela细胞 ,用免疫细胞化学染色检测其在不同细胞中的表达及对细胞形态的影响。结果 :成功构建了编码截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因的真核表达载体pCMV e2 3sFv FSD GrB ,用免疫细胞化学检测发现 ,绝大多数Hela细胞可高表达e2 3sFv FSD GrB蛋白 ,且细胞形态正常 ,而表达e2 3sFv FSD GrB蛋白的SKBR 3细胞形态发生变化 ,出现固缩细胞。结论 :截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因真核表达体系的建立 ,为确定PE转位肽的最小转位功能区段奠定了基础。
黄香[4]2011年在《预处理化疗增强细胞因子诱导的杀伤细胞的抗肿瘤作用及其机制研究》文中认为[背景与目的]传统化疗药物的免疫调节作用已逐渐受到人们的重视,特定剂量特定模式的给药方式可通过多种机制重建机体免疫内环境,调变肿瘤细胞免疫原性。将其作为预处理方案联合后续的过继性细胞免疫治疗,可有效动员机体的免疫系统发挥抗肿瘤作用。本研究旨在观察预处理化疗在小鼠动物肿瘤模型(Lewis(?)市癌、CT-26结肠癌、B16黑色素瘤)中对细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK cells)的抗肿瘤活性的增强作用,并从机体免疫内环境的调节以及肿瘤细胞免疫原性的调变两方面探讨介导预处理化疗增效作用的机制。[材料与方法]1.建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型,选用紫杉醇(Paclitaxel, PTX)联合顺铂(Cisplatin, DDP)作为预处理方案(TP方案),荷瘤小鼠随机分为六组：对照组(给予生理盐水,Normal Saline, NS)、NS-3-CIK组(NS后3天给予CIK细胞)、NS-7-CIK组(NS后7天给予CIK细胞)、TP组(给予TP方案)、TP-3-CIK组(TP方案预处理后3天联合CIK细胞)及TP-7-CIK组(TP方案预处理后7天联合CIK细胞)。隔日测量肿瘤长短径监测肿瘤体积,观察各组治疗方案对Lewis肿瘤的抑制作用。2.分别建立BALB/c野生鼠或BALB/c nu/nu裸鼠CT-26结肠癌模型,随机分为四组：NS组(给予NS)、CIK组(给予CIK细胞)、DDP组(给予DDP)、DDP-CIK组(DDP预处理3天后联合CIK细胞)。隔日测量肿瘤长短径监测肿瘤体积,观察各组治疗方案对CT-26结肠癌的抑制作用,并比较联合方案在两种动物模型中的抗肿瘤作用。3.建立C57BL/6小鼠B16黑色素瘤模型,随机分为四组：NS组(给予NS)、CIK组(给予CIK细胞)、DDP组(给予DDP)、DDP-CIK组(DDP预处理3天后联合CIK细胞)。隔日测量肿瘤长短径监测肿瘤体积,观察各组治疗方案对B16黑色素瘤的抑制作用。4.利用绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein, GFP)转基因小鼠制备GFP+CIK细胞,荧光显微镜追踪其体内迁移分布,观察预处理化疗对CIK细胞体内归巢功能的影响。5.分离Lewis(?)市癌模型及CT-26结肠癌模型中的肿瘤组织,分别行CD3、FoxP3(Forkhead boxP3)、CD31分子免疫组化染色以评估肿瘤组织局灶T淋巴细胞、Treg细胞的浸润情况以及肿瘤微血管密度的变化。6.流式细胞术观察预处理化疗后荷瘤鼠各组织中内源性T淋巴细胞、树突状细胞(Dendritic cells, DCs)、髓系来源抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)、调节性T细胞(Regulatory T cells, Treg cells)的动态变化。7.MTT法筛选化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)、DDP、PTX、多西紫杉醇(Docetaxel,DTX)的体外高、中、低毒性浓度,将这些浓度的化疗药物处理人肺腺癌细胞(A549、SPC-A1、SPC-A1/DTX), WST-1法比较肿瘤细胞在化疗药物预处理前后对CIK细胞体外杀伤作用的敏感性。8.RT-PCR检测肿瘤细胞经化疗药物处理后各时间点免疫原性分子mRNA水平表达的改变：NKG2D配体(Natural killer group 2, member D ligands, NKG2DL)、Fas受体分子、细胞间黏附分子-1 (Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、高迁移率族蛋白1 (High-mobility group box-1, HMGB-1)、钙网织蛋白(Calreticulin, CRT)、DNAM分子(DNAX accessory molecule-1)、Clr-b分子(C-type lectin-related molecule b)。[结果]1.在C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型中,TP预处理化疗后不同时间点给予CIK细胞免疫治疗均能明显抑制(?)Lewis肺癌的生长(P<0.05),且两时间点间无统计学差异；而单独CIK免疫治疗或TP化疗均不能抑制Lewis肿瘤的生长(P>0.05)。实验结束时两联合治疗组肿瘤体积分别为3377.82±1603.43mm3 (TP-3-CIK组),3183.38±806.08mm3 (TP-7-CIK组);单独CIK治疗组及TP化疗组肿瘤体积分别为5997.46±1372.90mm3 (NS-3-CIK组),6206.70±1700.61mm3 (NS-7-CIK组)及6387.09±1019.48mm3 (TP组),NS对照组肿瘤体积为7087.57±1103.37mm3。2.在BALB/c野生鼠CT-26结肠癌模型中,单独CIK免疫治疗或DDP化疗均可明显抑制CT-26结肠癌的生长(P<0.05),而DDP预处理化疗联合CIK细胞免疫治疗与单独治疗组相比,则可诱导更为显着的抗肿瘤作用(P<0.05)。实验结束时DDP-CIK组肿瘤体积为2115.62±436.61mm3,CIK组肿瘤体积为2937.44±773.78mm3,DDP组肿瘤体积为2885.26±318.88mm3,NS对照组肿瘤体积为3867.55±207.56mm3。在BALB/c裸鼠CT-26结肠癌模型中,DDP预处理化疗联合CIK细胞免疫治疗、单独CIK治疗及单独DDP化疗均不能抑制CT-26结肠癌的生长(P>0.05)。实验结束时DDP-CIK组肿瘤体积为3198.15±863.57mm3,CIK组肿瘤体积为3445.42±786.73mm3,DDP组肿瘤体积为3298.26±788.13mm3,NS对照组肿瘤体积为3778.65±819.22mm3。3.在C57BL/6小鼠B16黑色素瘤模型中,DDP预处理化疗联合CIK细胞免疫治疗可显着抑制B16黑色素瘤的生长(P<0.05),单独的CIK免疫治疗或单独的DDP化疗均不能抑制B16黑色素瘤的生长。实验结束时DDP-CIK组肿瘤体积为2644.41±910.8mm3,CIK组肿瘤体积为5634.08±486.89mm3,DDP组肿瘤体积为5215.31±1118.87mm3,NS对照组肿瘤体积为5587.62±1390.01mm3。4. Lewis(?)市癌模型中的TP预处理化疗可促进过继性输注的CIK细胞至肿瘤局灶及脾脏组织的归巢。5. Lewis(?)市癌模型中的TP预处理化疗及CT-26结肠癌模型中的DDP预处理化疗均可促进CD3+T淋巴细胞至肿瘤局灶的浸润,而对肿瘤组织的微血管密度无明显作用。6.预处理化疗可以诱导肿瘤引流淋巴结(Tumor-draining lymph nodes, TDLNs)及肿瘤组织中内源性T淋巴细胞比例的一过性升高；增加骨髓、外周血及脾脏组织中DCs的比例；降低外周血、骨髓、脾脏组织及TDLNs中MDSCs的比例；下调肿瘤局灶及脾脏组织中Treg细胞的比例。7.化疗药物预处理可增加人肺腺癌细胞对CIK细胞体外杀伤作用的敏感性。8.化疗药物预处理可上调人肺腺癌细胞ULBP、Fas、ICAM-1及DNAM分子1mRNA水平的表达,下调Clr-b分子mRNA水平的表达。[结论与意义]1.预处理化疗可在多种动物肿瘤模型中增强CIK细胞免疫治疗的疗效,且此种增效作用与宿主的内源性T淋巴细胞相关。2.预处理化疗可通过调节机体的免疫内环境以促进CIK细胞至肿瘤及脾脏组织的归巢,增强CIK细胞免疫治疗的疗效。3.预处理化疗可能通过调节肿瘤细胞免疫原性相关分子的表达以调变肿瘤细胞的免疫原性,进而增加肿瘤细胞对CIK细胞体外杀伤作用的敏感性。4.综上所述,本研究首次证实预处理化疗可增强CIK细胞免疫治疗在多种动物肿瘤模型中的抗肿瘤作用,并发现这种增强作用与预处理化疗可调节机体免疫微环境及增强肿瘤细胞的免疫原性有关。5.上述结果为预处理化疗联合CIK细胞免疫治疗的临床应用提供了实验基础与理论依据,也为晚期恶性肿瘤的临床治疗提供了一种安全有效的联合治疗模式。
丁筱[5]2016年在《肺癌患者免疫状态的综合评估及细胞免疫治疗与化疗联合治疗肺癌的临床疗效分析》文中研究表明研究背景与目的:肺癌在全世界恶性肿瘤发病率和死亡率中均高居首位。尽管手术、化疗、放疗等传统治疗方法有所改进及分子靶向药物的应用,患者的5年生存率仅有17%,寻找肺癌治疗的新策略成为当今研究的焦点。既往学者们认为肺癌是一种免疫原性较弱的肿瘤。近年来,随着程序性死亡蛋白-1(programmed cell death protein-1,PD-1)、其配体PD-L1及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4)等免疫检查点分子的发现,肺癌免疫治疗取得新的突破,提示免疫治疗将开启肺癌治疗的新时代。研究表明,肺癌患者的免疫状态与其预后密切相关。肺癌细胞存在MHC-I类分子的表达下调、PD-L1的表达上调,继而逃避T细胞的免疫监视,导致肿瘤免疫逃逸的发生。肺癌细胞出现主要组织相容性复合体I相关分子A(major histocompatibility complex class I-related chain A,MICA)及主要组织相容性复合体I相关分子B(major histocompatibility complex class I-related chain B,MICB)的表达上调,MICA、MICB可从肿瘤细胞中脱落,形成血清可溶性MICA(soluble MICA,s MICA)、血清可溶性MICB(soluble MICB,s MICB),抑制免疫细胞功能。此外,肺癌发生时,肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)成分发生改变。另外,肿瘤细胞及免疫细胞可释放一些细胞因子,抑制机体免疫应答。免疫治疗可有效打破机体免疫抑制发挥抗肿瘤作用。研究表明,肺癌患者存在免疫细胞的功能异常,因此应用体外活化扩增淋巴细胞的细胞免疫治疗(cellular immunotherapy,CIT)可能改善患者预后。目前少数研究表明应用CIT可能改善肺癌患者的预后,但CIT具体应用时间、与化疗的联合治疗模式仍需进一步探讨。此外,目前尚缺乏评判CIT对免疫状态影响的相关指标。我们通过以下实验对肺癌患者免疫状态及CIT治疗肺癌的效果进行评价。实验方法:1、收集我院病理学诊断为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的患者的组织标本,通过免疫组化的方法检测肺癌组织中肺癌表面分子MHC-I类分子、PD-L1、MICA/B及肿瘤浸润CD8+淋巴细胞的表达,并分析肺癌表面分子及肿瘤浸润CD8+淋巴细胞与患者临床特征及预后的相关性。2.收集我院初治肺癌患者的血清标本,通过Luminex方法检测血清中细胞因子如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等的含量,通过ELISA法检测血清中s MICA、s MICB的含量,分析血清中细胞因子及s MICA、s MICB的含量与患者临床特征及预后的相关性。3.通过流式细胞术,检测顺铂处理A549及H446细胞后,A549及H446细胞表面NKG2D配体(MICA、MICB)、CD226配体(CD112、CD155)及TRAIL受体(DR4、DR5)等表面分子表达的变化,探讨顺铂增强NK细胞杀伤活性可能的机制。通过钙黄绿素释放法,明确顺铂联合NK细胞对A549及H446细胞是否存在协同杀伤效应。4.回顾性分析我院CIT与化疗联合及单纯化疗的NSCLC患者的临床数据,对两组患者的无进展生存期(progression free survival,PFS)及总体生存期(overall survival,OS)进行评估,明确CIT与化疗联合与单纯化疗相比是否改善NSCLC患者的预后。并通过流式细胞术检测CIT患者CIT前后外周血淋巴细胞比例的变化,通过Luminex法检测CIT治疗前后血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等的含量变化,寻找评判CIT对免疫状态影响的相关指标。结果:1、肺癌组织存在MHC-I类分子表达下调;COX回归分析显示MHC-I类分子的表达与患者性别、吸烟指数、病理类型、TNM分期及肿瘤分化程度相关,男性患者、吸烟指数≥400、鳞癌患者MHC-I类分子下调明显,且TNM分期越晚、肿瘤分化程度越差,其MHC-I类分子表达下调越明显;MHC-I类分子高表达组的PFS及OS均优于MHC-I低表达组(P<0.05)。肺癌组织存在PD-L1表达上调;PD-L1表达水平与患者吸烟指数及病理类型相关,吸烟指数≥400及鳞癌患者其PD-L1表达水平增高;PD-L1低表达组的PFS优于PD-L1高表达组(P<0.05),PD-L1低表达组OS较PD-L1高表达组有延长趋势,但差异无显着性(P>0.05)。肺癌组织中存在MICA/B的表达上调;MICA/B表达水平与患者临床特征及预后无明显相关性。肺癌基质及癌巢中存在CD8+细胞浸润,且基质中CD8+细胞数高于癌巢中细胞数;基质与癌巢中CD8+细胞数与患者病理类型相关,鳞癌患者基质与癌巢中CD8+细胞高于腺癌中CD8+细胞数;基质中CD8+细胞高表达组的PFS优于低表达组(P<0.05),其OS也有延长趋势,但无统计学差异(P>0.05);癌巢中CD8+细胞高表达组与低表达组的PFS及OS无明显差异(P>0.05)。2、肺癌患者存在TNF-α及IFN-γ水平下调,IL-6水平上调,且差异有显着性(P<0.05);肺癌患者IL-2有降低趋势,IL-10有增加趋势,但无统计学差异(P>0.05)。COX多因素回归分析,各细胞因子的表达水平与患者临床特征及预后无明显相关性(P>0.05)。肺癌患者s MICA水平高于健康志愿者(P<0.05),肺癌患者s MICB水平较健康志愿者有升高趋势,但无统计学差异(P>0.05)。患者s MICA及s MICB水平与患者临床特征无相关性。s MICA低水平患者的PFS较高水平患者明显延长(P<0.05)。而s MICB表达水平与患者预后无相关性(P>0.05)。3、顺铂可上调肺癌细胞表面MICA、MICB、CD112、CD155、DR4、DR5的表达,且与顺铂处理时间呈时间依赖性。顺铂联合NK细胞对A549及H446细胞均有协同杀伤作用,且杀伤活性与顺铂预处理时间呈时间依赖性。4、CIT与化疗联合组与单纯化疗组相比PFS与OS明显延长(P<0.05)。亚组分析显示I-IIIA期患者,CIT与化疗联合组与单纯化疗组相比PFS无明显差异(P>0.05),其OS有延长趋势,但无统计学差异(P>0.05)。IIIB-IV期患者CIT与化疗联合治疗组与单纯化疗组相比PFS与OS均明显延长(P<0.05)。CIT治疗后患者外周血中CD3+CD8+T细胞明显增加,Treg细胞明显减少,差异有显着性(P<0.05),CD3+CD4+、CD3-CD56+、CD3+CD56+细胞无明显差异。CIT治疗前后血清中细胞因子水平无明显变化(P>0.05)。结论:1、肺癌细胞存在MHC-I类分子的表达下调、PD-L1及MICA/B分子的表达上调,MHC-I类分子的表达下调及PD-L1的表达上调与患者不良预后相关。MICA/B的表达与患者预后无明显相关性。肺癌基质及癌巢中存在CD8+细胞表达,基质中CD8+细胞数高于癌巢中细胞数。基质中CD8+细胞的表达与预后相关,而癌巢中CD8+细胞的表达与预后无明显相关性。2、肺癌患者TNF-α及IFN-γ水平较健康志愿者明显降低,IL-6水平较健康志愿者明显升高,但各细胞因子表达水平与预后无明显相关性。肺癌患者s MICA水平较健康人表达增高,且s MICA高表达与肺癌预后不良有关。3、顺铂可通过促进肺癌细胞表面MICA、MICB、CD112、CD155、DR4、DR5的表达,与NK细胞产生协同杀伤作用。4、CIT与化疗联合可改善肺癌患者预后。CIT后外周血中CD3+CD8+细胞增加,Treg细胞减少,CD3+CD8+及Treg细胞可作为判断CIT对免疫状态影响的指标。本研究中我们发现肺癌患者免疫状态与预后有相关性,细胞免疫治疗与化疗联合可改善肺癌患者预后。本研究结果将为CIT与化疗联合在临床患者中的应用提供理论依据。化疗与CIT联合可能将成为肺癌患者的新治疗模式。
刘岩[6]2007年在《选择性阻断KIRs抑制性受体调节NK细胞杀伤功能的实验研究》文中研究指明自然杀伤细胞(natural killer cells，NK cells)属非特异性免疫细胞，是人体细胞免疫的重要组成部分。特别是对病毒及肿瘤细胞具有杀伤活性，而对宿主本身的正常细胞不具有杀伤作用。NK细胞主要通过对“自我”和“非我”的准确识别发挥免疫保护作用。近年来研究发现NK细胞活化是通过其表面功能不同的受体发挥作用：(1)杀伤细胞活化受体；(2)杀伤细胞抑制受体。表面的杀伤抑制性受体(Killer cells inhibitory receptors，KIRs)是调节其杀伤活性的关键分子，为NK细胞的优势受体。目的：本课题初步探讨NK细胞通过抑制性受体与配体之间的相容性调节其细胞杀伤活性调节的作用和机理；封闭NK细胞的抑制性受体KIRs对于肿瘤细胞的体外杀伤活性的影响。方法：用单克隆抗体CD158a、CD158b封闭处理NK-92MI细胞后，与体外培养的K562细胞(NK细胞敏感细胞株)及Raji细胞(NK细胞不敏感细胞株)按不同的效靶比混合共同孵育。效靶比分别为5:1、10:1、20:1。同时每组效靶细胞均加设不使用CD158a、CD158b抗体封闭的对照组。应用流式细胞仪检测不同效靶比情况下NK-92MI细胞对靶细胞的体外杀伤活性。结果：实验所得，共同孵育4小时后的杀伤结果为最佳。NK-92MI杀伤作用随效靶比的增高而增强。经单克隆抗体CD158处理过的NK-92MI对K562和Raji细胞的杀伤活性均高于不应用单克隆抗体CD158处理过的对照组，且差异显着(P＜0.05)。用抗体封闭处理以后，NK-92MI细胞平均杀伤率提高了7％～8％。结论：KIRs受体封闭后的NK-92MI细胞与未处理的NK-92MI细胞比较，对肿瘤细胞的杀伤效果明显增强。
刘希春[7]2006年在《DC负载抗原诱导CIK特异性杀伤NDV修饰抗原的胃癌细胞》文中指出目的:近年来肿瘤生物治疗成为肿瘤治疗的新趋势。由于肿瘤细胞抗原隐含,使肿瘤杀伤细胞的作用降低,所以肿瘤生物治疗的关键是使肿瘤细胞隐含的抗原显露出来,从而使肿瘤杀伤细胞有的放矢,提高对肿瘤的杀伤效果。本研究将探讨用NDV修饰SGC-7901细胞,使其抗原显露后,再用负载SGC-7901细胞抗原的DC-CIK细胞对该SGC-7901细胞进行杀伤,同时与常规化疗药物(5-FU,DDP)进行比较。探索新的治疗方法治疗胃癌,为胃癌的临床生物治疗奠定基础。方法:取健康成人外周血分离单个核细胞(PBMC),用于诱导培养DC细胞及CIK细胞,用流式细胞仪测定它们的表型,证实细胞性质。用反复冻融法制备胃癌细胞SGC-7901抗原,以用于致敏DC细胞。部分CIK细胞与负载SGC-7901细胞抗原的DC共培养,制备DC-CIK(负载胃癌抗原的CIK)。部分CIK细胞单独培养。部分胃癌细胞SGC-7901用NDV修饰抗原,使其抗原显露。部分胃癌细胞SGC-7901单独培养。然后分为以下四组进行杀伤试验。①CIK组:CIK+SGC-7901细胞。②DC-CIK组:DC-CIK细胞+SGC-7901细胞。③CIK+NDV组:CIK+SGC-7901细胞+NDV。④DC-CIK+NDV组:DC-CIK细胞+SGC-7901细胞+NDV。同时设单独的靶细胞对照组(SGC-7901细胞组)和效应细胞对照组(CIK,NDV,DC-CIK)。并同化疗药(5-FU,DDP)对SGC-7901细胞的杀伤作用比较。用MTT法测定杀伤率。进行统计学处理,比较各组的杀伤差异。结果:1、CIK组:随着效靶比的增加,CIK细胞对胃癌细胞SGC-7901的杀伤作用增强。效靶比20:1时杀伤作用达(46.4%),高于效靶比5:1时的杀伤作用(42.9%,p<0.01)。2、在同一效靶比下,DC-CIK细胞对胃癌细胞SGC-7901的杀伤率明显高于CIK组的杀伤率(p<0.01)。3、NDV本身对胃癌细胞SGC-7901也有杀伤作用,杀伤率在19.3%,对胃癌细胞SGC-7901的杀伤能力低于CIK组。4、用NDV修饰胃癌细胞SGC-7901抗原后,无论是CIK细胞还是DC-CIK细胞对胃癌细胞SGC-7901的杀伤率均增加。其中DC-CIK细胞杀伤率最高,效靶比为20:1时,达到83.4%。5、化疗药物组:5-FU、DDP在一定范围内,随浓度增加对SGC-7901细胞杀伤作用增强。二者合用时对SGC-7901细胞的杀伤有协同作用,明显增加杀伤效果。
杨雪[8]2017年在《新型介孔二氧化硅的构建及细胞内刺激响应控制释放研究》文中研究指明细胞内源刺激响应纳米药物载体是指通过对细胞内源性物质特异性响应,实现特定部位药物转运、提高药物利用率及降低药物对周围组织和细胞毒副作用的一类纳米药物载体,是目前纳米生物医学领域研究的重点方向。作为其中最具发展潜力的载体之一,介孔二氧化硅纳米药物载体因具有丰富的介孔结构、较大的孔体积、超高的比表面积、可调的孔径尺寸和形貌、较低的生物毒性、较高的生物相容性等物理化学性质,在细胞内源性物质刺激响应控制释放领域及肿瘤治疗方面拥有较高的研究价值和广阔的应用前景。本论文紧紧围读如何合理利用细胞内源性物质设计刺激响应门控、如何提高介孔二氧化硅纳米药物载体的载药能力和生物相容性以及如何合理构建多功能治疗体系叁个方面问题,以介孔二氧化硅为载体,选用肿瘤细胞过表达的生物内源性物质为刺激响应手段,分别构建了基于谷胱甘肽、多巴胺、转录因子刺激响应的且具有不同形貌的控制释放系统。同时结合金纳米棒的近红外光热转换优势,发展了一种用于肿瘤耐药性细胞治疗的可逆化学-光热协同治疗体系。主要开展了以下研究工作:一、基于MnO2包裹介孔二氧化硅纳米颗粒的细胞内谷胱甘肽刺激响应药物转运研究为了充分利用肿瘤细胞中过表达的谷胱甘肽(GSH,2-10 mM)及最大程度上简化纳米药物载体的合成步骤,本章结合二氧化锰(MnO2)纳米材料可GSH降解,廉价易合成,生物相容性好等优良特性,发展一种基于MnO2包裹介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)的新型药物转运体系,并用于细胞内GSH刺激响应药物控制释放。在此体系中,通过2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES,pH 6.0)对高锰酸钾的原位氧化还原反应在MSN表面包裹一层MnO2。在不存在GSH时,MnO2纳米层可以有效的封堵介孔,防止药物分子的泄露。而在存在GSH时,GSH可以快速降解MnO2纳米层,从而打开介孔,释放装载的药物分子。我们以抗肿瘤药物阿霉素(DOX)为模式药物,将其负载入介孔孔道内,以MnO2封堵介孔,考察该体系在缓冲液以及细胞内的GSH刺激响应控制释放行为。实验结果表明该体系具有较大的药物装载能力及较好的GSH刺激响应性,且在GSH高表达的细胞(如肝癌细胞)中有明显的药物控制释放行为,并能有效地杀伤肿瘤细胞。因此,应用该GSH刺激响应型药物转运体系,有望进一步推进药物转运载体在肿瘤治疗领域中的发展。二、基于银纳米颗粒功能化介孔二氧化硅的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞内多巴胺刺激响应药物转运研究神经递质多巴胺(DA)可以通过银-邻苯二酚键和银纳米颗粒(AgNPs)特异性结合,是一种理想的刺激响应门控。本章以DA过表达的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12细胞)为研究对象,结合以富胞嘧啶寡核苷酸链为模板合成的AgNPs,发展一种基于DA刺激响应的MSN药物转运系统用于PC-12细胞内的药物转运。在该体系中,首先将一条5'端炔基化的富胞嘧啶寡核苷酸链通过点击化学交联到迭氮化的MSN表面。随后以富胞嘧啶寡核苷酸链为模板,通过NaBH4对Ag+的还原作用在MSN表面形成一层AgNPs,封堵介孔,阻止药物分子的泄露。在存在DA时,DA可以和AgNPs形成稳定的银邻苯二酚键,并将AgNPs从介孔表面竞争走,从而打开介孔,释放装载的药物分子。本工作选取具有稳定荧光性质的DOX分子为药物分子,考察了该控制释放体系在PC-12细胞中的DOX释放行为及对该细胞的专一性杀伤作用。细胞实验结果表明该体系对PC-12细胞具有最优的细胞杀伤效果,有望推进纳米药物载体在肾上腺嗜铬细胞瘤治疗中的发展。叁、尺寸可调中空介孔二氧化硅纳米棒的合成及其细胞内转录因子刺激响应药物转运研究为了提高介孔二氧化硅纳米药物载体的生物相容性及药物装载能力,在本章研究中,我们发展了 一种模板-包裹-刻蚀策略制备尺寸可调的中空介孔二氧化硅纳米棒(hMSR)材料,并用于细胞内转录因子刺激响应控制释放。在该工作中,首先以尺寸可调的,酸可降解的镍肼棒(NHCT)为模板,通过凝胶溶胶法及酸刻蚀作用合成中空二氧化硅纳米棒(SNR)。随后以CTAB为模板在SNR表面包裹一层介孔二氧化硅,并在表面保护水热刻蚀的作用下,将致密的二氧化硅层刻蚀掉,最终得到hMSR。通过调节NHCT合成过程中NiC12和水合肼的比例,最终得到具有不同长宽比的(2.5、5.3、8.1、9.0)hMSR。实验结果表明,所得的hMSR具有较强的稳定性、较大的药物负载能力及较好的生物相容性,这使得hMSR可以作为理想的药物载体进行药物转运。作为示范,我们选取hMSR8.1为药物载体,以Ag+稳定的、转录因子特异性识别的叁链DNA(TDNA)为分子门控,发展了转录因子响应型药物控释系统用于细胞内药物控制释放。在存在转录因子时,转录因子可以特异性地将TDNA中的双链DNA竞争走,从而打开介孔,释放装载的药物分子。本工作选用肿瘤细胞过表达的转录因子NF-kB p50为细胞内源性刺激物,分别考察了该药物载体在缓冲液及细胞中的NF-KBBp50刺激响应控制释放行为。细胞实验表明,该药物载体在人子宫颈癌细胞(HeLa细胞)中有明显的NF-κB p50刺激响应药物释放行为。我们相信这些研究成果将为纳米药物载体在肿瘤治疗中的应用打开新的视野。四、发卡结构DNA功能化AuNRs@hMSR的耐药细胞NIR光响应可逆药物转运及化学-光热协同治疗研究在上一个工作的基础上,为了进一步提高纳米药物载体的治疗效果,并对肿瘤耐药性细胞进行有效的治疗,本章继续选用长宽比为8.1的hMSR为载体,发展了一种发卡结构DNA功能化AuNRs@hMSR的中空介孔二氧化硅纳米棒,并用于肿瘤耐药性细胞内近红外(NIR)刺激响应药物转运及化学-光热协同治疗。在该体系中,首先通过对HAuC14的还原作用在hMSR8.1内部部分形成金纳米棒(AuNRs)。通过对反应时间的调节,得到具有最佳光热性能及负载能力的体系(AuNRs@hMSR)。随后,以Tm值为51.3 °C的发卡结构DNA为门控分子,通过迭氮与炔基之间的点击化学反应将发卡结构DNA共价交联到介孔表面,封堵介孔。在NIR光刺激下,AuNRs产生的热使发卡结构DNA变为单链,从而打开介孔,释放包载的DOX。而当关闭NIR光时,体系温度降低,发卡结构DNA又重新形成,从而再次封堵介孔,实现了可逆控制释放效果。实验结果表明,该体系在NIR光刺激下具有较好的可逆控制释放行为,且对不同肿瘤细胞(尤其对肿瘤耐药性细胞)具有较理想的化学-光热协同治疗效果。我们相信该方法将为多功能纳米药物载体在协同肿瘤治疗及肿瘤耐药性细胞治疗的发展中提供新的思路。
王娜[9]2017年在《IRAK1激酶在结肠癌中作为西妥昔单抗协同作用靶标机制的研究》文中研究说明【背景】EGFR靶向治疗的出现给结直肠癌患者带来了新的希望,但是由于原发或继发性耐药的存在,导致其作用效果往往不能持久。目前已知结肠癌患者对西妥昔单抗耐药的主要原因是KRAS基因的突变,然而对于KRAS野生型结直肠癌细胞的耐药机制尚未完全阐明。前期研究中我们通过对西妥昔处理的体外培养结肠癌组织进行基因芯片分析和细胞高内涵筛选实验发现IRAK1激酶具有协同克服结肠癌对西妥昔单抗耐药的作用。回顾文献发现,IRAK1激酶可激活下游NF-κB、PI3K/Akt等与结直肠癌细胞对西妥昔单抗耐药密切相关的信号通路。因此我们猜想西妥昔单抗激活肿瘤细胞内IRAK1介导的信号通路导致对耐药现象的出现,靶向抑制IRAK1可协同西妥昔单抗的抗肿瘤作用。本研究将在前期工作基础通过体内外实验来验证这一假说。本项目对于揭示KRAS野生型结直肠癌细胞耐EGFR靶向治疗的新机制,对于开发新的靶向药物和治疗方案具有重要意义。【目的】研究IRAK1与结肠癌对西妥昔单抗耐药之间的关系;探索IRAK抑制剂提高西妥昔单抗对肿瘤抑制作用的具体机制。【方法】1.通过q RT-PCR及Western blot技术检测IRAK1及其磷酸化分子p-IRAK1在正常结肠上皮细胞及叁种RAS野生型结肠癌细胞系中的表达水平,通过WST-1法及平板克隆法检测该分子表达水平与肿瘤细胞增殖之间的关系,利用A nexxin V法检测使用IRAK抑制剂后对细胞凋亡的影响;2.在高表达结肠癌细胞系中单独或联合使用IRAK抑制剂和西妥昔单抗,利用WST-1法检测各组细胞增殖水平,接着利用Western blot技术观察IRAK1及其下游可能相关的分子的变化从而筛选出下游靶分子;3.利用组织芯片及普通组织切片检测IRAK1在结肠癌患者的癌组织及癌旁组织中的表达是否有差异,并分析该分子的表达与患者的预后之间是否有相关性;4.通过裸鼠成瘤实验验证IRAK抑制剂与西妥昔单抗对肿瘤细胞活性及细胞内部分子表达水平的影响。【结果】一、IRAK1分子在结肠癌细胞中呈高表达且与肿瘤细胞的增殖、凋亡相关。我们分别从RNA和蛋白水平检测了正常结肠上皮细胞和叁种RAS野生型结肠癌细胞中IRAK1及p-IRAK1分子的表达水平,发现它们在正常上皮细胞中表达量很低,在叁种结肠癌细胞中HT-29和RKO细胞中的表达水平明显高于Di Fi细胞,西妥昔单抗药敏试验发现HT-29及RKO对其敏感性明显低于Di Fi细胞,提示IRAK分子与结肠癌细胞对西妥昔单抗的敏感性相关。我们对HT-29和RKO细胞同时进行西妥昔单抗和IRAK抑制剂处理后发现西妥昔单抗对肿瘤细胞的抑制作用明显提高。对这两种细胞系进行抑制剂处理后可以发现肿瘤细胞的凋亡水平明显升高,细胞周期的静止期明显延长。二、TRAF6是IRAK1的直接底物分子,IRAK1抑制剂可以通过影响NF-κB及ERK活化过程而抑制肿瘤细胞的增殖。在对耐药细胞系HT-29、RKO进行西妥昔单抗处理后发现IRAK1及p-IRAK1明显升高的同时伴随着p-ERK及p-p65升高,对它们进行IRAK抑制剂或者si IRAK1处理后发现p-ERK及p-p65明显降低,说明这两个分子可能是IRAK的下游作用分子。为了从基因水平研究IRAK1分子改变后对细胞内信号通路分子的影响,我们分别设计了该分子的上下调慢病毒,在HT-29细胞系转染IRAK1的下调病毒后我们发现肿瘤细胞的增殖水平明显降低,且下游分子改变与IRAK1抑制剂及si IRAK1处理后的结果一致。在Di Fi细胞系转染上调病毒sh IRAK1后,细胞的增殖水平略有升高,且伴随p-ERK及p-p65升高。在对耐药细胞系进行西妥昔单抗处理后发现p-EGFR降低的同时TLR4被明显激活,进而导致下游的IRAK1表达升高,从而抑制了其抗肿瘤的作用。叁、IRAK1分子表达水平与结肠癌患者的预后相关,在癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。我们从上海芯超公司购买了带5年预后及90例患者信息的结肠癌组织芯片,免疫组化实验发现IRAK1分子在癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,且与患者的预后呈负相关。四、裸鼠成瘤实验显示IRAK抑制剂可以明显提高西妥昔单抗的肿瘤抑制作用。裸鼠成瘤后待肿瘤组织长到一定大小后随机分为4组,分别进行DMSO、IRAK抑制剂、西妥昔单抗、IRAK抑制剂联合西妥昔单抗。2周左右之后取肿瘤组织测量大小发现联合使用IRAK抑制剂及西妥昔单抗可以明显抑制肿瘤的生长。提取肿瘤组织的蛋白及RNA后进行检测发现相关分子改变与体外的细胞实验一致。且我们发现p-IRAK1分子在结肠癌细胞中的定位与其总分子不同,IRAK1主要位于细胞浆中,而磷酸化后则主要位于细胞核之中。【结论】1.西妥昔单抗可诱导结肠癌耐药细胞系中IRAK1分子的升高继而出现耐药。2.IRAK1的表达水平与结肠癌细胞的增殖能力呈正相关,与细胞凋亡水平呈现负相关。3.TRAF6是IRAK1的直接底物,IRAK抑制剂通过抑制下游ERK及NF-κB的活化而发挥抗肿瘤作用。4.在结肠癌耐药细胞系中西妥昔单抗作用于EGFR的同时激活了TLR4进而活化IRAK1,从而消弱了其抗肿瘤作用。
杨华[10]2014年在《组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肿瘤相关基因的表观遗传调控及抗肿瘤作用分子机制研究》文中研究说明研究目的：组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)作为一种高效低毒的靶向抗肿瘤药物正日益引起人们的广泛关注。目前已知HDAC抑制剂通过抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化水平,从而达到调控基因表达的目的,以逆转变异细胞表型、抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和/或凋亡。一方面,HDACi可通过对核心组蛋白的乙酰化,调整染色质结构来实现对全基因表达的影响,即：染色质重塑；另一方面,HDACi通过对参与信号转导和转录的非组蛋白的乙酰化来影响基因的表达,进行其特有的“肿瘤转录治疗”。体内体外试验均表明很多HDACi具有低毒强抗癌作用,目前已有HDACi(SAHA和FK228)作为药物在临床得到了应用。更多的HDACi(MS275、LBH589和PXD101等)则处在相应的药物研发阶段。HDACi选择性作用于变异细胞,除了诱导靶细胞周期阻滞、促分化、诱导凋亡外,还诱导机体的抗肿瘤免疫反应。与传统的化疗药物相比,用HDAC抑制剂对血液和实体肿瘤进行治疗,显示了良好的疗效,副作用很少,具有较大的优势。然而,HDAC抑制剂作为一种新型的靶向抗癌药,其机制尚待进一步阐明。随着分子生物学研究的深入,对各种HDACi抗肿瘤作用机制的深入研究将对更好地认识肿瘤发生机制,选择潜在的药物治疗靶点具有重要价值,并为未来寻找和发现活性更好的抗癌药物奠定基础。本论文主要从两个大的方面探讨HDACi的抗肿瘤机制。一方面,我们发现SAHA(首个被美国FDA批准上市的HDAC抑制剂),通过增强肝癌细胞NK细胞活化受体NKG2D之配体MICA/B分子的表达而提高肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性,并在研究SAHA上调MICA/B的过程中,发现了miR-17-92基因簇的参与,并对SAHA对MICA和miR-17-92的表观遗传调控机制进行了深入研究。另一方面,我们与山东大学药学院药物化学研究所合作,根据已上市的羟肟酸类HDACi药效团模型全新设计合成了以四氢异喹啉为基础的新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂ZYJ-34,并且通过对ZYJ-34进行结构改造,获得了ZYJ-34的衍生物ZYJ-34a、ZYJ-34b和ZYJ-34c,其中ZYJ-34c表现出很好的抗肿瘤活性,特别是在乳腺癌和结肠癌,其酶抑制活性和体外、体内抑制细胞增殖活性均优于已上市的SAHA,具有重要研究开发价值。本课题在此基础上进一步评估了ZYJ-34c对血液系统肿瘤的抑制活性,并探索其具体的抗癌作用分子机制。研究方法：第一部分SAHA通过表观调控miR-17-92及MICA增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)掺入实验发现肝癌细胞经SAHA预处理后对NK细胞的杀伤敏感性增强,流式细胞术证实经SAHA作用后肝癌细胞表面杀伤分子相关配体(MICA/B)的表达增加。利用实时定量PCR方法检测SAHA作用后,肝癌细胞中MICA/B相关miRNA(miR-20a、miR-93、miR-106b)的变化,发现SAHA作用后,这些miRNAs的表达降低,并伴有时间剂量依赖关系；继续用定量PCR方法验证了SAHA对miR-17、miR-18a、miR-19a、pri-miR-17-92以及MCM7的抑制,提示这些miRNAs与它们的宿主基因可能受控于相同的启动子。随后,通过流式细胞术观察分别转染miR-20a、miR-93、miR-106b的模拟物对肝癌细胞表面MICA表达的影响。先用Western Blotting验证SAHA对HDAC的抑制活性。进一步,利用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术检测SAHA对MICA、miR-17-92和MCM7基因启动子相关染色质乙酰化组蛋白的影响。利用生物分析工具,根据Promoter2.0预测的miR-17-92启动子序列,构建了miR-17-92启动子萤光素酶报告载体。使用JASPAR数据库和TFSEARCH网站,对miR-17-92启动子区的序列进行转录因子结合位点分析。通过构建p-EGFP-GATA-2过表达载体观察GATA-2对miR-17-92转录的影响。最后,通过Western Blotting检测SAHA对肝癌细胞磷酸化STAT3的影响,定量PCR观察IL-6体外刺激对肝癌细胞miR-20a和pri-miR-17-92表达的影响,ChIP技术证实p-STAT3能够直接结合miR-17-92的启动子,并且SAHA作用后结合减弱,介导了SAHA对miR-17-92簇的抑制。第二部分新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂(ZYJ-34c)诱导白血病细胞周期阻滞及相关机制的研究在体外用WST-1法检测了ZYJ-34c对各种白血病细胞(K562,HL-60和原代分离的急性髓系白血病人骨髓白血病细胞)的增殖抑制活性。流式细胞术检测ZYJ-34c对白血病细胞凋亡和周期的影响。RT-PCR和Western Blotting检测周期凋亡相关分子。Western Blotting检测乙酰化组蛋白H3和H4,以鉴定ZYJ-34c的HDAC抑制活性。染色质免疫共沉淀(ChIP)检测p21WAF1启动子相关染色质区组蛋白的乙酰化水平。构建p21shRNA载体,K562细胞电转后培养48h,再加药,24h后检测细胞周期,以观察沉默p21WAF1对药物诱导的细胞周期阻滞的影响。研究结果：结果一：SAHA通过表观调控miR-17-92及MICA增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性1. SAHA预处理增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性经SAHA作用后,两种肝癌细胞株(HepG2, H7402)表面NK细胞活化性配体MICA/B表达升高,并且NKL细胞对SAHA预处理的两种肝癌细胞株杀伤效率明显高于对照组。2. SAHA能够以剂量依赖的方式抑制肝癌细胞中靶向MICA/B的miRNAs的表达SAHA作用后,两种肝癌细胞株中靶向MICA/B的]miRNAs(miR-20a、miR-93、 miR-106b)表达降低,并伴有剂量依赖性。鉴于这些miRNAs与肿瘤发生关系密切,又受到组蛋白去乙酰化酶抑制剂的表观遗传调控,引起我们极大的关注。3. SAHA以剂量依赖的方式抑制肝癌细胞中这些miRNAs的宿主基因的表达在两种肝癌细胞株中验证了SAHA对miR-17-92基因簇(miR-20a的宿主基因)中位于miR-20a上游的miR-17,miR-18a,miR-19a和pri-miR-17-92(miR-17-92的原始转录本)以及MCM7(miR-93和miR-106b的宿主基因)的抑制,并且伴有明显的时间、剂量依赖性。提示这些miRNAs与它们的宿主基因可能受控于相同的启动子,为下一步研究SAHA对这些miRNA调控的机制提供研究方向和线索。4. miR-20a, miR-93和miR-106b能够抑制肝癌细胞表面MICA的表达两种肝癌细胞株在分别转染了miR-20a、miR-93和miR-106b的模拟物后,表面MICA的表达显着降低。验证了在肝癌细胞系中这些miRNAs对MICA的靶向关系。5. SAHA诱导MICA基因启动子相关染色质乙酰化组蛋白累积,但抑制MCM7基因启动子组蛋白H4的乙酰化水平Western Blotting验证SAHA对HDAC的抑制活性。ChIP技术证实,SAHA能够通过促进MICA基因启动子相关染色质乙酰化组蛋白累积,促进MICA的表达。SAHA作用后,MCM7基因启动子结合的乙酰化组蛋白H4降低。而miR-17-92基因启动子结合的乙酰化组蛋白没有显着变化。6.转录因子GATA-2不参与SAHA对肝癌细胞miR-17-92基因簇的转录抑制成功构建p-EGFP-GATA-2过表达载体,并在HepG2中转染pEGFP-GATA-2过表达载体,Western blotting验证过表达效果。但是过表达GATA-2后,HepG2中成熟miR-20a的表达没有变化。提示GATA-2可能不参与在肝癌细胞中对miR-17-92的调节。GATA-2是否参与白血病细胞中对miR-17-92的调节的实验尚在进行中。7. SAHA通过阻断STAT3的活化抑制miR-17-92簇的转录SAHA抑制肝癌细胞STAT3的磷酸化水平,IL-6活化STAT3后,miR-20a和pri-miR-17-92表达上调,ChIP技术证实p-STAT3能够直接结合miR-17-92的启动子,并且SAHA作用后,结合减弱。8.成功构建miR-17-92启动子萤光素酶报告载体,SAHA增强哺乳动物细胞中重组质粒的表达在pGL3-basic骨架载体上连入miR-17-92启动子区的序列,测序鉴定成功。为后续研究转录因子对miR-17-92启动子活性的影响提供实验平台。在稳定表达绿色荧光蛋白的HepG2细胞(HepG2细胞中转染pEGFP-N1的质粒,经G418筛选后得到)中证实SAHA作用后,HepG2细胞绿色荧光比对照组强。结果二：新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂(ZYJ-34c)诱导白血病细胞周期阻滞及相关机制的研究1. ZYJ-34c具有明显优于阳性对照药SAHA的体外抑制白血病细胞增殖的作用比较两种HDACi对白血病细胞的增殖抑制活性,分别在K562、HL-60和原代分离的急性髓系白血病人骨髓细胞中证明,ZYC-34c显着抑制白血病细胞的增殖,明显优于SAHA.2. ZYJ-34c和SAHA诱导白血病细胞凋亡的能力无明显差异相同处理条件下,在SAHA组和ZYJ-34c组之间,细胞凋亡诱导率无显着差异；对凋亡相关分子表达的影响无显着差异。排除了凋亡介导ZYJ-34c优越的生长抑制作用。3. ZYJ-34c比SAHA具有更强的引起白血病细胞细胞周期阻滞的作用在K562和HL-60细胞中,相比SAHA, ZYJ-34c更强的诱导白血病细胞周期阻滞在G1期。4. ZYJ-34c比SAHA具有更显着的诱导p21WAF1转录和表达的作用检测了一系列周期相关分子,如p21WAF1、p27、p57、c-myc、p53和bcr-abl, ZYJ-34c的更强的细胞周期阻滞作用主要是由对p21WAF1的上调和对bcr-abl的抑制所介导。5. ZYJ-34c更显着地诱导p21WAF1基因启动子相关染色质乙酰化组蛋白累积相比SAHA,ZYJ-34c具有对HDAC更强的抑制活性,ChIP技术证明ZYJ-34c更显着地提高p21WAF1基因启动子相关染色质组蛋白乙酰化的水平。6. ZYJ-34c或SAHA诱导的G1期细胞周期阻滞是p21WAF1依赖的成功构建p21-shRNA,p21-shRNA沉默K562细胞中p21WAF1后,组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导的细胞周期阻滞被严重削弱。7.选择性下调血液系统肿瘤的Cyclin A,可能是SAHA对血液肿瘤比实体肿瘤更加敏感的机制通过比较实体瘤细胞(H7402细胞系)和白血病细胞(K562细胞系),发现白血病细胞系中Cyclin A高表达,并在SAHA作用后,显着下调；而在H7402细胞中本身Cyclin A表达较弱,并在SAHA作用后没有显着变化。结论：研究内容第一部分：1.在肝癌细胞中,组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA的低剂量预处理,能够显着增强肝癌细胞中“压力诱导”分子MICA的表达,通过其与表达活化性受体NKG2D的NK细胞的相互作用,增强其对NK细胞的杀伤敏感性。NK细胞活化性受体的配体的表达上调,能够逆转肿瘤诱导的NK抑制,增强NK细胞的抗肿瘤作用。2.在肝癌细胞中,miR-93和miR-106b是高表达的。一方面,作为癌基因,通过抑制p21WAF1、PTEN、Bim和Rb等抑癌基因,促进肝癌细胞增殖,抑制肝癌细胞分化；另一方面,还通过抑制肿瘤细胞表面MICA的表达,抑制NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。SAHA作用后,通过抑制这些miRNAs,抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞分化,还利于肿瘤细胞被识别和杀伤。SAHA通过调控这些miRNAs在抗肿瘤中发挥了双重作用。3. SAHA作用于组蛋白,通过诱导MICA基因启动子区组蛋白乙酰化的累积,促进MICA的表达上调；同时抑制MCM7基因启动子区组蛋白H4的乙酰化水平,对miR-17-92基因启动子区组蛋白乙酰化水平没有影响。可见SAHA作用后,虽然组蛋白乙酰化水平总体升高了,但是对于不同基因的调节具有选择性。4.在肝癌细胞中,STAT3处于活化状态,p-STAT3作用于miR-17-92的启动子区,促进miR-17-92的转录,促进肝癌的恶性发展；SAHA作用后,导致STAT3去磷酸化,抑制miR-17-92的转录。5.组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以增强哺乳动物细胞中重组质粒的表达效率。研究内容第二部分：1.本研究鉴定了一种新型的四氢异喹啉类的HDACi,ZYJ-34c,与SAHA相比,ZYJ-34c在白血病细胞中表现出优越的HDACs抑制活性和强有力的生长抑制。2.已知p21WAF1基因转录活性增加与其相关组蛋白的乙酰化状态有关。在人类白血病细胞株中,与SAHA相比,ZYJ-34c更强地诱导p21WAF1基因相关染色质区组蛋白的乙酰化,更显着地诱导p21WAF1的转录和表达,从而引起更强烈的细胞周期阻滞。3.通过转染p21shRNA沉默p21wAF1,证明SAHA或ZYJ-34C诱导的G1期阻滞是p21wAF1依赖的。p21wAF1不仅参与G1期细胞周期阻滞,还参与调控肿瘤细胞的终末分化。此外,ZYJ-34c促进bcr-abl的降解和并抑制其激酶活性。ZYJ-34c不是通过细胞毒作用将白血病细胞直接杀死,而是通过诱导细胞周期阻滞,促进终末分化的方式发挥抗肿瘤作用,是一种对血液系统恶性肿瘤很有前途的高效低毒的新型HDACi。意义：HDACi的免疫调节效应提供了治疗肝癌的一条新的途径,可能通过上调肝癌细胞表面的NK活化性配体(MICA)的表达,使其容易被表达NKG2D的免疫细胞(NK细胞和部分T细胞)识别,并激活相应的免疫效应,从而发挥机体的免疫监视功能,杀伤肿瘤细胞。本研究在肝癌细胞中发现了,组蛋白去乙酰化酶抑制剂引起的组蛋白乙酰化修饰对相关靶蛋白MICA的调控作用。通常认为,组蛋白高乙酰化(Hyper-acetylation)与转录激活相关,而低乙酰化(Hypo-acetylation)则与转录抑制有关。然而在体外细胞实验中,人们发现HDAC抑制剂作用后有不到10%的基因转录活化,与此同时表达增强和表达降低的基因数几乎是相似的,提示非组蛋白的乙酰化在HDACi的基因表达调控中也起着重要的作用。此外,miRNA表观遗传调控的发现开辟了肿瘤治疗的新领域,然而目前人们对miRNA自身调控机制的认识仍较肤浅。本研究探索了组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA在组蛋白高度乙酰化、染色质疏松、活化基因表达的背景下,通过抑制p-STAT3,产生对miR-17-92抑制的机制。这是在探索HDACi对非蛋白编码基因表达调控的确切机制的有益尝试。本研究结合酶活性和肿瘤抑制生长活性,筛选了一系列HDAC活性化合物,针对具有良好抗肿瘤潜力和应用前景的化合物ZYJ-34c,采用多种细胞生物学和分子生物学技术,对其抑制人白血病细胞的作用,阻滞细胞周期和诱导凋亡等细胞生物学效应,进行了分子调控机制探讨。解读了ZYJ-34c引起的组蛋白乙酰化修饰对相关靶蛋白p21WAF1的调控作用。最后,采用构建p21shRNA载体,沉默K562细胞中p21WAF1的表达,证实ZYJ-34c对白血病细胞的周期抑制是p21WAF1介导的。本研究为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂ZYJ-34c,作为抗肿瘤药物的开发和应用奠定理论基础,为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂的研发提供了有意义的实验参考。
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