陈蕤[1]2002年在《一株西北人乳头瘤病毒16型L1基因的克隆、表达及鉴定》文中指出目的 人乳头瘤病毒为广泛感染人类皮肤、生殖道、呼吸道等上皮组织的无囊膜小DNA病毒，至今已发现有100多个型别，而HPV16型是我国妇女宫颈癌感染的主要型别。表达人乳头瘤病毒16(HPV16)晚期基因L1，为HPV感染的检测、诊断和治疗奠定基础。 方法 收集宫颈癌组织标本，设计一对L1基因特异引物，用PCR方法从宫颈癌组织中获得L1基因部分片段，构建入克隆载体pGEM-T，双向测定插入片段序列并进行序列分析；亚克隆入pBV220载体，经酶切鉴定后进行温度诱导表达，所得蛋白再行Western-Blot和ELISA鉴定。 结果 实验结果说明成功将L1基因克隆入非融合表达载体，在55kD处出现了L1重组表达的蛋白条带，经ELISA和Western Blot分析，表达的L1蛋白均具有良好的抗原性。 结论 实验中发现所得到的HPV16 L1 DNA序列与国内报道4处碱基变化又有所不同。即原始序列5892处的C变为T；6337处的核苷酸C变为T；6423处的核苷酸A变为G；6799处的核苷酸T变为C。说明各地区的宫颈癌组织中所获HPV16L1基因有所差异，在针对各地区的HPV感染检测时，应考虑地区因素。重组表达蛋白进行Western-blot分析和ELISA杂交鉴定证实表达的L1蛋白能与商品化的乳头瘤病毒抗体发生抗原抗体反应，提示其可能用于检测HPV感染者的抗体。使今后开发出通用、特异、低成本的HPV诊断试剂成为可能，并为基因疫苗的进一步研究提供了有力的依据。
王丽娜[2]2016年在《新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立》文中进行了进一步梳理宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,而高危型人乳头瘤病毒(High-risk human papillomavirus,HR-HPV)的持续感染与宫颈癌的发生关系最为密切。目前宫颈癌的发生率逐渐升高,并呈年强化趋势发展,这不仅严重影响着妇女的生活质量,也给妇女的生命及健康带来严重的威胁。因此明确某一地区HPV的感染现状以及流行型别,并了解宫颈病变样本中HPV的基因变异状况,这对指导HPV疫苗的应用推广和新一代疫苗的设计研究以及新的检测方法的建立具有重要的意义。新疆处于我国西北地区,其宫颈癌的发生率较高,尤其是在新疆南部少数民族聚集的区域,但目前对于新疆北疆地区HPV的流行状况以及疫苗还没有研究。本实验对新疆北疆部分地区的HPV的流行状况以及宫颈病变样本中HPV基因型的分布以及多重感染与宫颈病变的关系进行了研究。并在此基础上通过对基因变异情况的分析来研究适合该地区的HPV疫苗和和建立。研究方法和实验结果如下:1.新疆北疆部分地区HPV的流行状况HPV的持续感染是宫颈癌发生的主要原因。为了研究新疆北疆部分地区HPV的流行状况,和宫颈病变人群中HPV基因型的分布,以及多重感染情况。我们收集了2010年1月-2014年12月就诊于新疆石河子大学第一附属医院妇产科进行第二代杂交捕获法(Hybrid Capture 2,HC2)检测的7298位病人的病例资料,并收集了2014年1月-2014年12月就诊病人的宫颈脱落细胞样本,筛选出经病理学诊断有宫颈病变病人的宫颈脱落细胞样本,并对其进行分子检测,结果显示:(1)新疆北疆地区人乳头病毒的发生率仍处于一个较高的水平,其中年龄<25岁和≥55岁时出现感染高峰;(2)HR-HPV的检出率随着宫颈病变等级的增加而增加,而低危型人乳头瘤病毒的感染率(Low-risk human papillomavirus,LR-HPV)随宫颈病变程度的变化而变化不大;(3)在新疆北疆部分地区至少存在29种HPV基因型,其中HR-HPV 17种,LR-HPV 12种,其中发生率较高的HR-HPV基因型依次为HPV 16、53、52、58、35;(4)在多重感染检测中,主要以二重感染为主,其中以HPV 16型的合并感染最为常见,还出现了叁重、四重、五重、六重感染,并且多重感染与宫颈病变的严重程度无关。2.HPV流行基因型L1基因的克隆与分析为了研究新疆北疆地区流行的主要HR-HPV L1基因的变异情况,设计了能够扩增HPV 16、52、53、58以及在世界范围内发生率较高且致癌性较强的HPV 18型的L1全长序列的引物,并经过测序、拼接、比对后获得L1基因序列全长。通过与现有的疫苗株和美国株序列进行比对后发现,在核酸水平上均发生了突变,有些碱基突变甚至导致了氨基酸的改变。以HPV 16 L1基因为例,对新疆株与疫苗株进行分子生物信息学分析,发现两者之间存在差异。这为新疆北疆地区疫苗的引进以及多价疫苗的研发提供理论依据。同时本章还参照以往报道,筛选出保守性较好的多肽片段,为下一章节单克隆抗体的制备奠定基础。3.HPV 16型单克隆抗体的检测以及双抗体夹心ELISA检测方法的建立为了建立适合新疆北疆地区自身发展特点的HPV检测方法,本研究在实验二的筛选得出的保守片段基础上,对多肽片段进行合成,并进行KLH偶联,然后免疫小鼠,最终获得15株含有单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清,Western blot检测后,筛选出两株特异性较好的细胞株,并对其进行纯化,其中一株纯化的单抗进行辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记后作为检测抗体,另一株纯化单抗作为捕获抗体,以此为基础建立检测HPV的双抗体夹心ELISA法。通过对抗体稀释液等条件进行优化,确定捕获抗体的最佳浓度为1.69μg/m L,检测抗体的工作效价为1:100,样品反应时间为45 min;酶标抗体作用时间为40 min;显色时间为15 min,用建立的双抗体夹心ELISA方法与TS-PCR(Type-Specific Polymerase Chain Reaction,TS-PCR)方法同时检测66份临床宫颈脱落细胞样本,符合率达到81.8%,结果表明该方法具有较好的特异性及重复性,可初步应用于HPV的检测。
陆剑[3]2014年在《消减免疫法筛选HPV型间杂合颗粒特异单克隆抗体及其表位研究》文中研究表明人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)的持续感染被证实是诱发女性宫颈癌的主要原因。世界范围内,每年由HPV感染所致癌症病例56万例,约占全球全部癌症新发病例的5%,死亡人数约20万；在中国,每年约有10万的妇女因HPV感染而导致宫颈癌,死亡病例约3万。宫颈癌是继乳腺癌之后严重威胁妇女健康的第二大疾病。与宫颈癌密切相关的高危型HPV有15种,要有效控制宫颈癌就必须有预防这15种型别HPV感染的疫苗。目前上市的2种疫苗只能预防HPV16和HPV18这两种高危型的感染,保护率约占70%。因此,开发多价预防疫苗具有重大意义,同时也面临巨大的挑战。本文在实验室前期的研究基础上,通过HPV16L1的C175和HPV52L1的C428位点突变,获得两种突变蛋白,混合组装成均一的、与野生型VLP形态相似的杂合病毒样颗粒(Virus Like Particle, VLP)。通过免疫原性考察,相同剂量的杂合VLP与野生型VLP所诱导的抗体水平相当,表明杂合VLP有作为广谱HPV疫苗的潜力。由于杂合VLP两个相邻五聚体之间只能形成一个二硫键,在空间结构上必然与野生型VLP不同,因此,杂合VLP有可能会产生新的功能表位,甚至可能产生新的广谱表位。因此,筛选出针对杂合VLP特异反应的单抗,同时通过该抗体分析杂合VLP相对于野生型VLP所产生的新表位具有重要意义。本研究首先通过单克隆抗体筛选获得了针对于杂合VLP特异反应的单抗。在常规的免疫方法中,HPV杂合VLP的免疫血清抗体滴度与两种野生型免疫的抗体滴度相当,筛选获得的抗体差异性不大,且没有针对杂合VLP新表位的单抗。因此本研究采用环磷酰胺消减免疫法,环磷酰胺可以抑制非目的抗原的免疫原性,提高免疫系统对目的抗原的应答。本文针对HPV抗原的免疫进行一系列摸索,最后建立的消减免疫方案是：耐受阶段和免疫阶段均不使用佐剂,抗原剂量为20μg,腹腔注射,环磷酰胺剂量为100mg/kg。对消减次数的研究表明,耐受次数不影响免疫抑制的持久性,停止环磷酰胺处理后,免疫抑制状态可以维持4周。本研究中,先使小鼠免疫系统对HPV16和HPV52野生型VLP的免疫无应答,再以杂合VLP免疫小鼠,使少量的五聚体杂合特异的表位免疫应答得到加强,提高特异抗体的阳性率,减少筛选工作量。筛选获得的抗体中,有2株抗体对杂合VLP特异,4株抗体对杂合VLP和野生型VLP的反应差异性在10倍以上。证实了环磷酰胺消减免疫法可以有效地制备差异性抗体。我们接着利用分子模拟方法,对以上抗体识别的表位进行分析。选取杂合VLP的特异性抗体2B3,分别对抗体可变区和HPV16/52相邻五聚体进行同源模建和分子对接,预测出2B3与杂合VLP的相互作用区域在两个五聚体之间,关键氨基酸是HPV16五聚体的Ser170和Lys439, HPV52五聚体的Asn240、Ser255、 Glu378、Lys382和Glu469。综上所述,本研究通过对消减免疫方案的研究,建立了以HPV为抗原的消减免疫方案,由此筛选获得了杂合VLP特异性抗体和与野生型VLP具有较大差异性的抗体。利用生物信息学分子对接技术,进一步研究了特异性抗体识别的杂合VLP的特异表位。本研究获得的杂合VLP特异表位信息,对于了解HPV L1蛋白的分子进化,中和表位型别的特异性,杂合VLP组装的机制以及开发基于杂合VLP的HPV广谱疫苗具有重要的指导意义。
参考文献：
[1]. 一株西北人乳头瘤病毒16型L1基因的克隆、表达及鉴定[D]. 陈蕤. 第叁军医大学. 2002
[2]. 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立[D]. 王丽娜. 石河子大学. 2016
[3]. 消减免疫法筛选HPV型间杂合颗粒特异单克隆抗体及其表位研究[D]. 陆剑. 厦门大学. 2014
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