吉林省松原市长岭县人民医院肿瘤科
摘要：目的 探讨雌二醇对细胞中SLC34A2基因表达和钙、磷转运的影响。方法 以不同浓度雌二醇与A549细胞共同培养24后用RT-PCR检测细胞中SLC34A2mRNA表达情况，试剂盒检测细胞上清中钙、磷的含量。结果 高、中浓度的雌二醇抑制该基因的表达，与对照组比较差异有显著性（P <0.01）；低浓度的雌二醇组促进该基因的表达，与对照组比较差异无显著性（P <0.01）；同时，低浓度雌二醇组细胞上清中钙、磷含量降低最明显，与对照组比较差异均有显著性（P<0.01）。结论 在A549细胞中，低浓度雌二醇促进SLC34A2基因的表达，进而促进细胞外液钙、磷的转运；高浓度的雌二醇则抑制该基因的表达。
关键词：SLC34A2基因；A549细胞；雌二醇；钙；磷
SLC34A2基因编码的磷酸钠协同转运蛋白（NaPi-Ⅱb）表达在人体的多种组织中，调节磷酸盐的代谢，对钙、磷的吸收有重要的调节作用。过去对于SLC34A2基因的研究主要集中在肠道[1]，即研究其对全身钙、磷代谢的影响，而对于局部的钙、磷代谢异常研究较少。所以，本研究利用A549细胞与雌激素共同培养，初步探讨雌激素对细胞中SLC34A2基因的表达和细胞内外钙、磷转运的影响。
材料与方法
药品、试剂与仪器
细胞株A549为本室保存。PCR引物、Primer STARTM HS DNA Polymerase、核酸分子质量标准、购自天根公司；逆转录试剂盒购自Fermentas公司；雌二醇购自为美国Invitregen公司；钙、磷检测试剂盒购自南京建成公司参考Genbank 收录的SLC34A2序列，设计两条引物，上游P1：5’-GCGGATCCTAATGGCTCCCTGGCCTGAAT-3’，下游P2：5'-GCGAATTCCTACAAGGCCGTGCATTCG-3'。上述引物由上海生工公司合成并纯化。
研究方法
1. 细胞培养：含10%胎牛血清的IMDM，37℃、5%CO2湿化培养箱中培养。0.25%的胰蛋白酶消化后分瓶传代。待细胞长到80%时，分组加药。
2. 细胞的干预处理：取指数生长期的A549细胞制成细胞悬液，调整细胞密度，用完全培养基37℃培养细胞。至细胞70%～80%融合，用1×PBS lmL洗细胞2次，无血清RPMI-1640培养液lmL洗细胞1次，加入新鲜的全培基2mL置37℃继续培养过夜。次日加入已经配制好的雌二醇干预细胞24h，分为四组：空白对照组（加入等量的不含血清的RPMI-1640培养液），雌二醇低浓度组（1×10－9?g/mL）；中浓度组（1×10－8?g/mL）；高浓度组（1×10－7?g/mL）。24h之后收集细胞上清，同时消化收集细胞。
3. RT-PCR检测细胞中SLC34A2 mRNA表达水平：24h后弃去细胞上清，Trizol试剂提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒操作。调整cDNA浓度，使各组cDNA浓度在同一水平，以制备好的cDNA为模板，采用引物P1，P2扩增目的片断，同时采用内参引物扩增GAPDH片断。
4. 检测细胞上清中的钙、磷：按南京建成试剂盒操作方法进行检测，钙含量mmol/L=测定管吸光度/标准管吸光度×2.5mmol/L；磷含量mmol/L=（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准管浓度1.29mmol/L。
统计学处理
数据以x?±S表示，采用SPSS13.0统计软件，包括单因素方差分析和多组间两两比较的LSD检验。
结果
1. 雌二醇干预细胞后SLC34A2mRNA表达的结果
中、高浓度雌二醇组SLC34A2表达量明显低于对照组，与对照组比较差异有显著性（Q= 22.2928 P <0.01，Q=23.8244 P <0.01），不同剂量组组间比较差异有显著性（P<0.05）；低剂量的雌二醇组SLC34A2表达量高于对照组，差异无显著性（Q=21.5316 P<0.05）；Bio-Rad凝胶成像系统分析图像光密度比值结果见表1。
2. 雌二醇干预细胞后上清中钙、磷离子的含量检测
低浓度雌二醇组细胞上清中钙、磷含量降低最明显，与对照组比较差异均有显著性（P <0.01），中、高浓度组与对照组比较差异均无有显著性（P >0.05），结果表明（见表2）。
讨论
SLC34是一个溶解物携带家族，包括SLC34A1，SLC34A2和SLC34A3，分别编码蛋白NaPi-Ⅱa、NaPi-Ⅱb、NaPi-Ⅱc，这些蛋白我们称之为磷酸钠协同转运蛋白[2]。NaPi-Ⅱb主要表达在肾脏以外的组织中，调节着肾脏以外的器官中磷的转运。SLC34A2的活性主要由某些激素和细胞因子调控如1，25（OH）2VD3、糖皮质激素、雌激素、IGF-1、EGF、胰岛素样生长因子-1，成纤维细胞生长因子等[3]。肠道内无机磷的代谢主要依靠Na+依赖的磷酸盐协同转运蛋白，SLC34A2 mRNA的表达沿着小肠的 A-P轴明显增加，表达最多在回肠，SLC34A2 mRNA专门表达在小肠绒毛上皮细胞[4]。低磷饮食可以导致小肠中NaPi-Ⅱb的增加，低磷饮食导致肾脏和小肠中NaPi-Ⅱb表达增加，具体机制不清楚[5]。
雌激素作为调节钙离子的代谢，骨密度以及1，25（OH）2VD3的代谢的重要激素，其与磷酸盐代谢方面的研究却很少。国外的研究证明[6]，雌激素对该转运蛋白有正向调节作用，在小肠组织中，雌激素治疗组小肠刷状缘的钠离子依赖的磷的吸收增加了大约45%；Northern blot显示SLC34A2的mRNA表达增加了近50%；该研究认为，雌激素可以促进大鼠的钠离子依赖的磷的转运，雌激素的这种作用很可能源于SLC34A2基因转录活性的激活。我们的研究结果显示在低浓度雌激素组细胞上清中钙、磷含量下降，同时低剂量的雌激素组SLC34A2基因的表达量明显增加，说明小剂量的雌激素可能通过上调SLC34A2基因促进细胞内外钙磷的转运。但同时本研究该证明在A549细胞中，高、中浓度的雌激素抑制SLC34A2基因的表达，这可能与雌激素受体的高选择性有关，需要我们进一步的实验研究证实。
参考文献：
[1] Reining SC，Liesegang A，Betz H，et al. Expression of renal and intestinal Na/Pi cotransporters in the absence of GABARAP [J]. Pflugers Arch，2010，460（1）：207-17.
[2]Ito M，Sakurai A，Hayashi K，et al. .An apical expression signal of the renal type IIc Na+-dependent phosphate cotransporter in renal epithelial cells. Am J Physiol Renal Physiol[J]. 2010，299（1）：243-54.
[3] Brown AJ，Zhang F，Ritter CS. The vitamin D analog ED-71 is a potent regulator of intestinal phosphate absorption and NaPi-IIb. Endocrinology，2012，153（11）：5150-6.
[4] Andrini O，Meinild AK，Ghezzi C，et al. Lithium interactions with Na+-coupled inorganic phosphate cotransporters：insights into the mechanism of sequential cation binding. Am J Physiol Cell Physiol，.2012，302（3）：539-54.
[5] 杨洋，张越，杨光，乔俊华，安继红，马忠森.地塞米松对人肺泡上皮细胞中SLC34A2基因表达和钙、磷转运的影响. <<山东医药>>[J]，2009，49（10）：1-3.
[6] Chen DR，Chien SY，Kuo SJ，et al. SLC34A2 as a novel marker for diagnosis and targeted therapy of breast cancer. Anticancer Res[J]. 2010，30（10）：4135-40.
论文作者:杨光
论文发表刊物:《健康世界》2015年28期供稿
论文发表时间:2016/4/11
标签：细胞论文; 雌激素论文; 基因论文; 光度论文; 引物论文; 小肠论文; 对照组论文; 《健康世界》2015年28期供稿论文;