韩建华
湖南省长沙市第四医院
摘要：本文主要是聚合酶链式反应（PCR技术）进行了相关概述，然后就该技术在微生物检测中的具体应用进行了分析，最后提出了该技术在实际应用过程中所存在的问题以及具体的解决方式，希望能够以此来进一步提高聚合酶链式反应在微生物检测中的价值。
关键词：聚合酶链式反应；微生物检测；应用
引言
聚合酶链式反应（PCR技术）最开始出现在1985年，是由美国人类基因学会（ASHG）在DNA片段扩增这一研究过程中所提出的一个概念，一经提出在各个领域当中都受到了较大的关注。尤其是将聚合酶链式反应应用到微生物检测当中，更是能够有效的提高微生物检测速度、准确度以及灵敏度，此外，这一技术在水处理过程中也能够起到非常显著的效果，能够很好的去除水中所存在的病原原生物、细菌以及病毒等。
1.聚合酶链式反应相关概述
聚合酶链式反应（PCR技术）本身就是一种存在选择性的体外DNA或RAN扩增方式，主要是通过选择某一特定的微生物物种当中一段特异性基因区域，也就是所谓的目标序列来对其进行体外扩增，然后再由凝胶电泳等DNA分析技术来对其含量以及种类进行相关分析。在对PCR技术特异性进行确定的过程中，其主要是由人工合成的引物DNA序列来决定的，这里的引物主要指的是和待扩增核酸片段两端互补的寡核苷酸，也就是ssDNA（单链 DNA）。聚合酶链式反应主要有三个阶段，其分别是目标DNA序列的加热变形、引物退火复性以及在DNA聚合酶作用之下的引物延伸。在实际操作过程中，首先需要对环境水样之中的微生物进行预处理，并且取得DNA样板，并且在变性温度之下对DNA进行变性解旋；然后则需要在复性温度之下两引物分别和两条DNA的两端互补性结合在一起，这个时候引物的3端需要保持相对，而5端则需要保持相背，对于这一现象我们可以将其称之为引物和模板的杂交；之后，在到达适当pH值、离子强度以及延伸温度的情况下，则由TaqDNA聚合酶催化引物引导的 DNA由 5端向3端进行延伸，这样就能完成一个变性-复性-延伸的PCR循环。而我们在实际应用过程中就可以通过不断的循环来促使DNA产量得到扩增，这样就能实现体外扩增特定 DNA序列这一目的。
2.聚合酶链式反应在水体微生物检测中的应用
就目前学者们对于聚合酶链式反应在微生物检测当中的应用研究，研究重点还是在水体微生物检测当中的应用，特别是在近些年来人们对于病原微生物有着较高的关注，就像是贾第虫、军团菌、隐孢子虫等就经常会使用到聚合酶链式反应来进行检测。在应用PCR技术进行水体微生物检测的过程中，其研究内容主要包含了对于样品中PCR抑制物的去除、DNA物质提取方式的改善、扩增产物的分析等等，而笔者也对其具体的应用进行了以下研究：
2.1供水卫生学安全检测
水体细菌学检验最开始出现在1885年，流行病学证据也显示出在过去的60年之中，工业化国家也由之前水煤病原微生物所造成的爆发性流行病发病率已经有了显著的下降，而在这其中供水卫生学检测更是功不可没。相比较于传统的方式而言，聚合酶链式反应在实际应用过程中速度十分的快，灵敏度也十分的高，而且在实际应用过程中有时还能检验出一些依赖于培养法所不能检测出来的微生物种类。目前，PCR技术在病原原生物、军团菌、病原细菌以及病毒等方面已经有了相关研究，而且在这些方面的研究已经较为成熟，取得了较为良好的应用效果。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆就像在王栋等[1]人研究报道中，借助于PCR技术就能直接从DNA样品中特异性地扩增一种现如今平常方式所不能培养出来的菌株固氮基因片段；另外，还有其它学者在研究报道中指出，其分别检测出了饮用水以及污水当中军团菌污染情况，可是在实际监测过程中对于生物污染较为严重污水当中的军团菌是很难使用常规方式来对其进行检测的，而使用PCR技术则能很好的检测出其中的微生物，而且在应用这一方式进行检测的过程中，其所需要花费的时间仅仅只要4h，而应用培养法来对饮用水当中的军团菌进行检测的话，则一般需要7-10d。
2.2在废水生物处理过程中检测
常规检测方式在对微生物进行检测的过程中，因为会受到采样以及条件分析所影响，所以结果准确性十分的低，再加上检测时间也十分的长，有些种类在分离过程中也十分的困难，就像是厌氧菌在分离的时候是十分困难的。可是，应用PCR技术不仅能很好的解决这些问题，还能为水处理工艺自动控制在生物参数中的应用提供可能性。在进行水处理的过程中，生物氧化作用大多是由多菌种共同作用下而产生的结果，所以说不同菌群之间的相互作用也是十分显著的，而PCR技术的发展则在很大程度上促进了多态性技术在微生物生态系统中的研究进展，就比如说PAPD技术、DGGE技术等都可以很好的检测出各种生物反应器当中的微生物种群结构。郭强等[2]人在研究过程中就曾使用编码苯酚单加氧酶 dmpN基因的RT-PCR技术来对处理废水中的SBR反应器当中的降解酚假单胞菌进行检测，其研究调查结果显示出，使用这一方式来进行检测，不仅能够很好的检测出微生物降解酚能力，还能有效的检测出dmpN基因的转录水平，这样就能很好的对该假单胞菌特殊分解活性进行有效的确定。总之，这些组合技术的存在，在很大程度上提高了微生物检测效果和效率，起到了工艺优化以及生物处理的效果。
3.聚合酶链式反应在微生物检测应用中的问题以及措施
在使用聚合酶链式反应进行微生物检测的过程中，PCR技术有时候会被自然界当中的一些物质所抑制，就比如说富里酸、胡敏酸、某些离子还有糖类等物质都会在一定程度上干扰到Taq聚合酶的效果[3]。另外，环境水样在保存、浓缩以及提纯过程中，也有可能会因为环境或者是其它处理过程中所存在的一些因素而受到影响，这个时候就会存在一些潜在的PCR反应抑制剂，就像是十二烷基硫酸钠、EDTA以及胍基化合物等等。而这些抑制剂的存在不仅会抑制PCR反应，还有可能会致使微生物检测出现假的阳性结果。所以说，在使用PCR技术的过程中，需要对环境样品当中待扩增DNA或者是RNA提纯技术进行适当的研究，这样就能在很大程度上减少抑制物对于微生物检测所造成的影响[4]。除此之外，DNA检测本身就不代表必须要使用活性细胞，因为从理论上来分析的话，任何可以提供核酸物质的样品我们都能对其进行PCR扩增，这也就是我们常说的PCR技术不能很好地对活细胞和死细胞进行区分，特别是在水体卫生学检验过程中，更是不能确定我们所检测得到的病毒粒子究竟有没有存在感染能力，这也聚合酶链式反应在微生物检测过程中所存在的一个问题。
4.结语
综上所述，聚合酶链式反应最为显著的特征就是具有较高的灵敏度、准确性，而且速度较快操作也十分的简便，所以相比较于传统手段而言，这一技术在微生物检测当中有着更为显著的价值和效果，能够在很大程度上提高微生物检测水平，同时还能在很大程度上促进水工业的发展和进步。
参考文献：
[1]王栋，王旭. 聚合酶链式反应技术在食品微生物检测中的应用进展[J]. 福建医科大学学报，2016，50（3）：213-216.
[2]郭强. 聚合酶链式反应 在食源性致病菌检测中的应用[J]. 品牌与标准化，2016（10）：77-78.
[3]许伟，戴明忠，杨凯，等. 聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳在环境微生物中的应用[J]. 环境研究与监测，2017（1）：1-6.
[4]王晓东，李凤焕. 荧光定量聚合酶链式反应联合检测性病病原微生物[J]. 中国社区医师：医学专业，2010，12（22）：187-187.
论文作者:韩建华
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年6月18期
论文发表时间:2018/8/24
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