陈凡[1]2004年在《胸膜肺炎放线杆菌血清学分型和基因分型的研究》文中指出胸膜肺炎放线杆菌是猪传染性胸膜肺炎的病原，感染猪出现最急性型、急性型和慢性型等3种临床症状，造成急性死亡或生长缓慢，耐过猪成为未免疫猪群发生感染的传染源，给世界养猪业带来严重经济损失。本病原共有15种血清型，分别属于生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，其中生物Ⅰ型菌株致病力较强。不同血清型的菌株毒力高低不同，引起疾病的严重程度也有差异。通过血清学和病原学流行病学调查，了解当地流行的优势血清型菌株，有助于了解疾病来源动态，研制特异性强的疫苗并推广应用，最终控制该病。然而，我国目前尚无用于胸膜肺炎放线杆菌分离菌株血清型和血清学调查的型特异性血清和型特异性抗原，而这是本病前期研究的基础。为此，开展分型血清及定型抗原的研制和分型方法的研究与应用，显得十分必要。 本试验中，将引进的胸膜肺炎放线杆菌13种血清型标准菌株，在TM／SN培养基上增殖，收获菌体，灭活后用于免疫家兔，制备了分型血清。分别应用玻片凝集试验、琼脂扩散试验和免疫电泳试验，对抗血清的特异性、效价和保存期进行了监测，结果表明，制备的抗血清有较好的特异性，在4℃下保存1个月、-20℃下8个月和-80℃下1年其效价无明显变化。用制备的分型血清采用琼脂扩散试验对PCR阳性的胸膜肺炎放线杆菌地方分离菌株进行了鉴定，分别为血清2、3和8型，说明抗血清可用于分离菌株的鉴定分型。 为了能通过检测送检血清了解动物感染病原的血清型，将增殖并收获的胸膜肺炎放线杆菌13个血清型标准菌株，采用洗涤直接离心、超声波处理和酚抽提等方法，制备不同血清型抗原，通过玻片凝集试验、琼脂扩散试验和对流免疫电泳，以标准抗血清作为参考，评价各种诊断抗原的特异性和灵敏性。分别应用研制的3种抗原对来自湖北、湖南、江西、河南和安徽等五省的155份送检血清进行检测，初步结果表明定型抗原及其检测方法能准确地进行血清学鉴别诊断和血清分型。 基因分型是近几年来用于细菌分型的新技术，能克服经典的血清学分型方法对部分菌株不能进行分型的缺点，已经应用于其它细菌的分型。本研究中，根据胸膜肺炎放线杆菌各血清型之间某些毒力相关因子的基因差异，设计不同的引物，分别对各血清型外毒素(Apx)、外膜蛋白(OmlA)、转铁蛋白B(TbpB)进行PCR扩增，得到不同的特异性片段，可区分胸膜肺炎放线杆菌生物Ⅰ型13个标准菌株血清型中的8个血清型，建立了基因分型方法，常见病原菌如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、波氏杆菌和链球菌在apx-PCR中不能扩增出特异性片段。对分离的12株野生菌用此方法进行分型，其结果与常规的血清学分型结果一致，为血清2、3和10型。将此分型系统用于临床送检的126份肺脏和42份扁桃体检测，结果表明，可直接检测出胸膜肺炎放线杆菌感染，并能判定感染病原的血清型。本方法还可以将一些尚华中农业大学硕士学位论文未定型的菌株进行归类,弥补了血清学方法的不足,而且,缩短了诊断的时间。 总之,本研究制备了13个血清型的胸膜肺炎放线杆菌分型血清和诊断抗原,提出了适用的血清学检测方法:在分子水平上,建立了胸膜肺炎放线杆菌基因分型方法,结果与经典的血清学分型方法相符,同时还弥补了经典的血清学方法对部分分离株不能分型的不足。这些方法为进一步开展病原分离鉴定、血清流行病学和分子流行病学提供了有效的手段。关健词:胸膜肺炎放线杆菌;血清学分型;基因分型;病原学检侧
肖国生[2]2006年在《胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌基因芯片检测与分型研究》文中认为基因芯片技术能在单一检测中从种、亚种、型和亚型水平上同时鉴定多种病原，为多病原联合检测和病原分型提供了一项新技术。基因芯片技术具有敏感性高，特异性强、高通量和平行性的优点。本研究对胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌的检测和分型靶基因进行了设计，以PCR方法扩增出用于叁种细菌联合检测和胸膜肺炎放线杆菌分型的靶基因，并建立了检测叁种细菌和胸膜肺炎放线杆菌基因分型的基因芯片。建立的APP-Mhp-PM检测基因芯片和APP分型基因芯片是一种新的检测技术，将对监测、联合诊断和防治这叁种猪呼吸道细菌病发挥重要作用。 根据胸膜肺炎放线杆菌的16S rDNA、apxⅣA、dsbE、omlA、apx和荚膜多糖(cp)基因，猪肺炎支原体的16S rDNA和P36蛋白基因，多杀性巴氏杆菌的psl和KMT1基因，入噬菌体DNA共设计和选用了23对引物，除选用引物外，其它引物由Arraydesigner 2.0软件设计。用23对引物共扩增出25个不同靶基因，并克隆到pMD18-T载体中。其中7个检测靶基因：胸膜肺炎放线杆菌3个(apxⅣ、dsbE、A16S)，猪肿炎支原体2个(M16S、P36)，多杀性巴氏杆菌2个(psl、KMT1)；17个用于胸膜肺炎放线杆菌分型的靶基因：omlA1、omlA2、omlA3、omlA4、cps1、cps2、cps6、cps7、cps8、cpx3、cpx6、cpx9、apxⅠA、apxⅠD、apxⅡA、apxⅢA和apxⅢD；一个定位靶基因λDNA。对克隆的25个靶基因质粒进行了序列测定和序列比对。结果发现，靶基因A16S与放线杆菌属内所有放线杆菌的16SrRNA的同源性均在95％以上，靶基因M16S与猪肺炎支原体、絮状支原体和猪鼻支原体的16SrRNA的同源性分别为100％、95％和88％；靶基因apxⅣ、dsbE、P36、KMT1和psl与各自不同型或株的相同基因序列的同源性均在92％以上。除分型靶基因apxⅠD和apxⅢD序列间的同源性在75％外，其它分型靶基因序列间的同源性均在67％以下。 用7个检测靶基因制备APP-Mhp-PM检测基因芯片，选用omlA1、omlA2、omlA3、omlA4、cps1、cps2、cps6、cps7、cps8、cpx6、apxⅠA、apxⅠD、apxⅡA、apxⅢA和apxⅢD 15个分型靶基因制备APP分型基因芯片。靶基因A16S、dsbE和apxⅣ联合检测胸膜肺炎放线杆菌；靶基因M16S和36联合检测猪肺炎支原体；靶基因psl和KMT1联合检测多杀性巴氏杆菌。15个分型靶基因的不同组合用于胸膜肺炎放线杆菌的基因分型。用基因芯片点样仪SpotArray 24将异丙醇沉淀法制备的浓度在250～300 ng／μl的
邱索平[3]2006年在《猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测和分型系统的建立及应用》文中研究说明1 胸膜肺炎放线杆菌叁种PCR检测方法的评估 血清学诊断方法是常用的App检测手段，但该法应用受到许多方面的限制。近15年来，App PCR检测方法已有许多报道，本实验通过特异性实验、敏感性实验、样品的直接检测等方面，对从已报道的PCR方法中筛选出的3种即apx-PCR、omlA-PCR、cpx-PCP进行了比较，并确定cpx-PCR作为较适合本实验室的最佳检测方法。 2 胸膜肺炎放线杆菌PCR快速分型系统的建立及初步临床应用 根据外膜蛋白基因中间部分的差异，毒素基因和荚膜基因的型特异性，建立3个多重PCR的分型体系，可将Appl～12型分成11个模式，除9型和11型外完全区分。此分型体系用于临床分离株JS3，ZJ5和JS7的分型，得出的结果和血清学分型一致。对人工发病猪扁桃体和肺脏各12份，鼻拭子8份，-20℃保存一年的人工发病猪扁桃体和肺脏各3份分型结果与已知血清型一致。从20份临床可疑病料中检测出2份阳性，均为7型。从健康猪扁桃体250份中检测出3份阳性，一份为4型，一份为12型，一份为3型。 3 猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ和Ⅲ基因的串连表达及序列分析 参照GenBank中的App血清8型和10型菌株序列分别设计了一对特异性引物，用PcR方法扩增毒素Ⅰ(ApxⅠ)基因5’端部分基因，得到1047bp的片段，毒素Ⅲ(ApxⅢ基因3’端部分基因，得到868bp的片段，然后重迭延伸剪切术(SOE)将两段PCR产物连接，将连接产物(apxⅠ-apxⅢ)克隆到pMD18-T载体中，经测序比较，与GenBank中公布的序列核苷酸同源性分别达99.3％(毒素Ⅰ)和98.5％(毒素Ⅲ)，从T-载体中切下目的片段后，定向克隆到pET32a(+)中，转化BL_(21)(DE3)，经诱导后，进行SDS-PAGE实验，目的基因获得表达，免疫转印鉴定呈阳性。apxⅠ-apxⅢ串联基因片段体外成功表达。
陈凡, 何启盖, 陈焕春, 刘正飞[4]2004年在《猪胸膜肺炎放线杆菌血清型研究进展》文中研究说明猪传染性胸膜肺炎是当前养猪业的主要呼吸系统传染病之一 ,其病原菌是胸膜肺炎放线杆菌 ,血清型多。准确区分此病原菌的不同血清型是研制预防有效疫苗的前提。根据 NAD依赖性 ,本菌可以分为生物 I型和生物 II型 ;采用传统的血清学方法 ,本菌又分为 1 5个血清型。各种血清学方法仍是现阶段对胸膜肺炎放线杆菌开展血清型鉴定的主要手段 ,但不足之处是存在一定程度的交叉反应以及不能对新分离的病原菌进行分型。采用聚合酶链式反应对不同基因进行扩增 ,根据扩增结果进行血清型鉴定的基因分型方法 ,具有准确和特异的优点 ,并可以克服传统血清学方法的不足 ,已经逐渐成为胸膜肺炎放线杆菌研究中的新的分型方法
孙学飞[5]2016年在《猪的叁种常见呼吸道细菌多重PCR检测方法的建立》文中指出猪链球菌(Streptcococcus suis,SS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae,APP)和副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis,HPS)分别是引起猪链球菌病(Swine strepococosis),猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoniae,PCP)和格拉瑟氏病(Glasser's disease)的主要病原,也是养猪业常见的叁种细菌性病原菌。这叁种病原菌均有多个血清型,主要侵害幼龄仔猪和保育猪,均可引起一系列呼吸道症状,导致较高的发病率和死亡率,且在临床上鉴别难度较大,给全球生猪养殖造成了巨大的经济损失。SS、APP和HPS叁重PCR方法的建立:本研究针对猪链球菌谷氨酸脱氢酶(gdh)基因,猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素(Apx Ⅳ)基因,副猪嗜血杆菌16S rRNA基因序列各设计1对特异性引物,分别能扩增出gdh 688bp、Apx Ⅳ 417bp和16S rRNA 822bp的DNA片段,将叁对引物置于25μL体系进行优化。PCR产物经酶切鉴定,确定目的片段得到了正确扩增。重复性、特异性实验表明:该实验具有很好的重复性,对多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、猪放线杆菌、猪葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪沙门氏菌等具有特异性。细菌纯培养物的敏感性实验表明:最低可检测到的细菌含量为:SS 104CFU/mL;APP 103CFU/mL;HPS 103CFU/mL。本研究SS、APP和HPS叁重PCR方法对人工模拟感染实验的SS、APP和HPS的敏感性均为104CFU/mL。对采集的30份疑似病例细菌分离鉴定后,用本研究建立的SS、APP和HPS叁重PCR方法进行检测,结果表明,该方法与常规细菌分离方法符合率达到93%。证明本实验建立的SS、APP和HPS的叁重PCR方法在检测上述叁种疾病方面具有应用价值。SS血清1、2、7、9型四重PCR方法的建立:针对SS血清1、2、7、9型特异性的cps基因序列各设计1对引物,分别能扩增出SS血清1型550bp、SS血清2型675bp、SS血清7型150bp和SS血清9型300bp的DNA片段,将四对引物置于25μL体系进行优化。PCR产物经酶切鉴定,确定目的片段得到了正确扩增。重复性、特异性实验表明:该实验具有良好的重复性,对猪丹毒杆菌、猪大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、葡萄球菌、猪放线杆菌、猪沙门氏菌DNA模板PCR扩增,均无特异性条带。细菌纯培养物的敏感性实验表明:最低可检测到的细菌含量为:SS血清1、2、7、9型皆为APP103CFU/mL。本研究建立的SS血清1、2、7、9型四重PCR方法对人工模拟感染实验的SS、APP和HPS的敏感性均为103CFU/g。对采集的8份疑似病例细菌分离鉴定后,用本研究建立的SS血清1、2、7、9型四重PCR方法进行检测,结果表明,该SS血清1、2、7、9型四重PCR方法与常规细菌分离方法符合率达到100%。本研究建立的SS血清1、2、7、9型四重PCR方法快速有效,可在3小时左右得到检测结果。APP血清1、3、5、7型及Apx Ⅳ五重PCR方法的建立:针对APP血清1、3、5、7型的cps基因及APP种属Apx Ⅳ基因序列各设计1对特异性引物,分别能扩增出APP血清1型959bp、APP血清3型520bp、APP血清5型825bp、APP血清7型600bp和Apx Ⅳ 417bp的DNA片段,将五对引物置于25μL体系进行优化。PCR产物经酶切鉴定,确定目的片段得到了正确扩增。重复性,特异性实验表明:该实验具有良好的重复性,本研究建立的APP血清1、3、5、7型及ApxⅣ五重PCR方法能对同一样品中的APP血清1、3、5、7型及APP种属DNA模板进行扩增,均无交叉反应。对猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪丹毒杆菌、猪沙门氏菌DNA模板PCR扩增,均无特异性条带。对APP血清1-15型DNA模板PCR扩增,所有血清型均可扩增出ApxⅣ的特异性条带,且除APP血清1、3、5、7型可以扩增出相应的特异性条带,其他血清均只能扩增出Apx Ⅳ的特异性条带。本研究建立的多重PCR方法对APP血清1、3、5、7型及Apx Ⅳ的纯培养物的敏感性皆为103CFU/mL。对人工模拟感染实验的APP血清1、3、5、7型及APP的敏感性均为103CFU/g。本研究建立的APP血清1、3、5、7型及Apx Ⅳ五重PCR方法快速有效,可在3小时左右得到检测结果。APP血清2、6、8、12型四重PCR方法的建立:针对APP血清2、6、8、12型具有特异性的cps基因序列各合成1对引物,分别能扩增出APP血清2型247bp、APP 血清 6 型 718bp、APP 血清 8 型 1106bp 和 APP 血清 12 型 347bp 的DNA片段,将四对引物置于25μL的体系进行优化。PCR产物经酶切鉴定,确定目的片段得到了正确扩增。重复性、特异性实验表明:该实验具有良好的重复性,本研究建立的APP血清2、6、8、12型四重PCR方法能对同一样品中的APP血清2、6、8、12型的DNA模板进行扩增,均无交叉反应。猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、DNA模板PCR扩增,均无特异性条带。对APP血清1-15型基因组DNA模板PCR扩增,除APP血清2、6、8、12型可以扩增出相应的特异性条带外均不能扩增出任何特异性条带。本研究建立的APP血清2、6、8、12型四重PCR方法对APP血清2、6、8、12型纯培养物的敏感性皆为103CFU/mL。对人工模拟感染实验的SS、APP、HPS的敏感性均为103CFU/g。本研究建立的APP血清2、6、8、12型四重PCR方法快速有效,可在3小时左右得到检测结果。本研究建立了 4套多重PCR检测方法,可在4.5小时内检测到SS、APP和HPS,可在7.5-8小时内检测出SS主要致病血清型1、2、7、9型,APP国内主要流行血清型1、2、3、5、6、7、8、12型。并对200份临床样品进行了检测,其结果与单一PCR检测结果一致,说明本多重PCR检测结果与单一PCR检测结果并无差异。综上所述,本研究建立的四套多PCR快速、高效,为猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的检测提供了技术支撑。
陈华美[6]2006年在《血清型1，2，6，7胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及应用》文中研究说明胸膜肺炎放线杆菌是引起猪出血性、纤维素性胸膜肺炎的高度传染性致死性病原菌，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。由于胸膜肺炎放线杆菌血清型多且各个血清型交叉保护弱，给本病的预防和控制带来了巨大困难。本试验根据胸膜肺炎放线杆菌种特异性外膜脂蛋白基因(OmlA)和血清型1，2，6，7荚膜多糖生物合成基因(CPS)分别设计引物，建立各单重PCR并优化条件，然后在此基础上建立多重PCR，对其特异性和敏感性进行检测，并应用于临床病料检测。 1 引物设计 参考GenBank中胸膜肺炎放线杆菌OmlA基因和CPS基因序列，分析其同源性，用Array Designer2.0软件针对OmlA两端保守基因，血清型1，2，6，7 CPS特异性区域分别设计引物，并对设计出的引物进行二聚体、同源性，互补性分析，同时对扩增序列进行同源性和互补性分析，确定5对引物，预扩增OmlA 952bp，CPS_1 630bp，CPS_2 504bp，CPS_6 720bp，CPS_7 389bp片段。 2 单重PCR 利用设计的引物分别对OmlA基因，血清型1，2，6，7 CPS基因进行PCR扩增，优化Tm值，引物浓度，Mg~(2+)离子浓度，并对敏感性和特异性进行检测。结果在如下体系10×buffer(Mg~(2+)-Free)5μl，25mM Mg~(2+) 3μl-6μl，2.5mM dNTP4μl，25／2pmol／ul上下游混合引物1.5μl-3μl，5u／μl Taq DNA聚合酶0.4μl，DNA模板5ul，最后用无菌去离子水补至50μl；反应程序为94℃预变性4min，94℃变性45s，52℃-58℃之间复性45s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存中都能扩增出预期的OmlA 952bp，CPS_1 630bp，CPS_2 504bp，CPS_6 720bp，CPS_7 389bp片段。对APP血清型1-4，6-10进行扩增，OmlA-PCR均能扩增出953bp片段，CPS_1，CPS_2，CPS_6，CPS_7 PCR分别只能扩增出预期的相应片段；对猪副嗜血杆菌、猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、肠炎沙门氏菌、猪链球菌、大肠杆菌和猪丹毒杆菌进行扩增，各PCR均不能扩增出任何片段。对各PCR敏感性进行检测，均能扩增出10pg的DNA量。 3 多重PCR 在单重PCR基础上，通过优化退火温度，引物浓度，镁离子浓度，建立即可对APP进行定性检测又同时可对APP血清型1，2，6，7进行定型检测的多重PCR方法。其优化的体系为10×buffer(Mg~(2+)-Free)5μl，25mM Mg~(2+) 4μl，2.5mM dNTP 4μl，25pmol／ul OmlA上下游混合引物2μl，其它型上下游混合引物各1.5ul，5u／μl Taq DNA聚合酶0.3μl，DNA模板5ul，最后用无菌去离子水补至50μl；反应程
李良军[7]2008年在《胸膜肺炎放线杆菌JL03株的全基因组测序与flp操纵子的结构分析》文中认为猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种猪的传染性呼吸道疾病。该病分布广泛,遍布世界各地,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。APP血清型众多,目前已经发现有15种血清型,各个国家和地区有不同的流行血清型,我国主要流行1、2、3和7型。由于不同血清型之间的交叉保护力较低,给对该病的预防控制带来了极大的困难。传统的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗只能对同源血清型菌株感染产生保护力,而不能对异源血清型菌株的感染提供保护,因此全菌灭活疫苗和亚单位疫苗的适用范围有限,不能被广泛应用。但自然感染或试验感染能够诱导抗异源血清型菌株的感染,因此弱毒活疫苗也许是弥补当前疫苗缺点的一种可行方法。要开发合理有效的弱毒活疫苗需要对APP的整个遗传背景有充分的了解,同时需要在APP中进一步寻找和研究潜在的毒力因子。1.胸膜肺炎放线杆菌JL03株基因组测序及初步拼接目前全基因组测序技术已经成熟,在此时开展对APP的全基因组测序能对APP的基础及应用研究产生广泛的影响。由于血清3型APP菌株是我国的流行血清型,因此测序菌株选取从国内临床分离的血清3型菌株JL03。这为研究我国流行菌株的致病发病机理及PCP的预防控制提供基本资料。通过测序和初步的拼接,所测序列被拼接成186个重迭群,总有效测序碱基18,471,205 bp,达到8.03倍基因组覆盖率,为进一步填补基因组空缺及对基因组进行生物信息学分析奠定了基础。2.胸膜肺炎放线杆菌flp操纵子的结构分析及序列比较在伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)和杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)中,flp操纵子与细菌的黏附和毒力相关。同时伴放线放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌同为巴氏杆菌科中的病原菌。基于这个背景,对APP中的flp操纵子的结构和功能展开了相关研究。通过对APP标准1型4074株flp操纵子的分析,在APP中flp操纵子有15个基因,并包含有完整的启动子和终止子。通过对APP标准1型菌株4074,标准5型菌株L20和临床分离血清3型菌株JL03的flp操纵子序列进行比较分析,发现JL03株flp操纵子5′端有约3.7kb的缺失,并且缺失包含flp操纵子的启动子区域。RT-PCR实验结果显示JL03菌株flp操纵子不能转录,而4074株flp操纵子可以转录。对实验室保存的所有标准血清型1-15(不含14型)和临床分离3型菌株HB0504,LZ-03和GDSB的PCR实验结果显示这些菌株的flp操纵子不包含有类似JL03菌株的缺失。透射电镜实验结果显示,具有完整flp操纵子的4074株能产生Flp菌毛,而不具有完整flp操纵子的JL03株不能产生Flp菌毛。3.胸膜肺炎放线杆菌血清1型4074株tadA基因缺失突变株构建目前对APP的Flp菌毛是否与APP的毒力相关还不清楚。因此本研究以能产生菌毛的4074株为亲本菌,使用同源重组技术缺失flp操纵子中的重要功能基因tadA。构建了重组自杀载体pBⅡSK(+)LRscm和pEMOC2LR,并以这两个质粒分别构建了标准1型4074株的单交换重组菌株TadAS1和TadAS2,为进一步筛选tadA基因缺失菌株及对flp操纵子的功能研究奠定了基础。
贝为成[8]2005年在《猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究》文中进行了进一步梳理猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成了严重的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。 目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌感染猪引起的临床症状并降低死亡率,但不能降低发病率、慢性感染和阻止肺部病变,对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。可以说,目前采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择,迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。 与灭活疫苗和亚单位疫苗不同,自然感染或试验感染能够诱导抗任何异源血清型的保护。这样,弱毒活疫苗也许是解决当前商品化疫苗不足的一种可行方法。构建胸膜肺炎放线杆菌突变株的传统方法存在很多缺陷。如利用化学或转座子介导的突变方法存在随机性,只适合于表型发生明显变化突变子的筛选,而不导致明显表型变化的突变株就不能够通过这些方法获得;而通过同源重组导致靶基因突变方法获得的突变株最后含有抗性标记,由于不符合生物安全性要求不能作为疫苗株用于疫苗生产。鉴于上述背景,本研究通过使用同源重组技术和负向选择方法(counterselection strategy)构建了不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡ基因工程突变株,随后对其生物学特性进行了研究,主要研究内容包括: 1.外膜脂蛋白(omlA)基因启动子序列验证及作为启动子启动绿色荧光蛋白(GFP)基因的功能特性研究 由于胸膜肺炎放线杆菌血清1型(S4074)外膜脂蛋白基因转录起始位点已经得到证实,本研究以APP血清1型基因组DNA为模板,采用PCR扩增157 bp omlA基因启动子序列,序列测定证实无误后以正向的方式将其连接到不带启动子的绿色荧光蛋白基因(GFP)上游,构建质粒pMSKOGFP。通过电穿孔将质粒pMSKOGFP电转化到APP,在荧光显微镜下观察转化子发荧光的情况。结果含有质粒pMSKOGFP的APP转化子能够表达GFP,表明157 bp omlA基因启动子序列能够启动GFP基因在APP中表达。 2.sacB基因在APP中表达特性研究 枯草杆菌sacB基因编码果聚糖蔗糖酶,表达sacB基因的革兰氏阴性细菌在含有5%蔗糖的培养基上不能生长。为了描述sacB基因在胸膜肺炎放线杆菌的表达特性,本研究采用PCR从质粒PGS284中扩增sacB基因,将它按照omlA基因启动子序列相同的方向克隆到质粒pMSK-omlA中获得重组质粒pMSKOS。同时,将单独
陈华美, 肖国生, 文心田[9]2006年在《猪胸膜肺炎放线杆菌的血清型分型及毒力因子研究进展》文中认为根据荚膜多糖和脂多糖抗原表位的不同,猪胸膜肺炎放线杆菌分为15个血清型,某些血清型间存在交叉反应,不同血清型甚至同一血清型不同菌株间的毒力大小不一样,致病性也有强弱之别。该菌的致病性与多种毒力因子密切相关,主要有外毒素、外膜蛋白、脂多糖、荚膜多糖、转铁蛋白、脲酶等。本文综述了国内外对胸膜肺炎放线杆菌的几种主要毒力因子及血清型的研究进展。
程相蕾[10]2007年在《猪胸膜肺炎放线杆菌血清抗体快速检测试剂盒的研制及应用》文中认为1 rApxⅣ-ELISA反应条件的优化和试剂盒的研制重组ApxⅣ蛋白表达与提纯经过改进，诱导转速由190rpm提高到220rpm：对早期经建立的检测猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)野毒感染抗体的rApxⅣ-ELISA进行了反应条件的优化，封闭液使用1％BSA在37℃封闭2h。底物溶液中的H_2O_2工作浓度从0.025‰降低到0.020‰，显色时间控制在8～10min。在此基础上组装成检测APP抗体的试剂盒可在-20℃保存12个月。该试剂盒的批次内和批次间的变异系数分别为3.2～6.9％和0.1～6.4％，具有特异性、敏感性良好的特点，可快速检测APP的ApxⅣ抗体水平的效果。2 rApxⅣ-IHA方法的建立利用大肠杆菌表达的APP的rApxⅣ主要结构蛋白，建立rApxⅣ—IHA检测猪的抗体。致敏绵羊血红细胞的蛋白浓度为15μg／mL，以pH4的TAP缓冲液作为致敏稀释液，37℃水浴1h致敏。IHA采用30μl体系，37℃，作用45min．1∶8孔全凝时判定为阳性，用此方法与本试验室先期建立的rApxⅣ—ELISA方法共同检测血清，328份呈线性正相关，相关系数为0.974。3 rApxⅣ-IHA试剂盒的研制和实际应用对建立的检测rApxⅣ抗体的IHA进行进一步的优化，并组装成ApxⅣ-IHA试剂盒，该试剂盒重复试验批间变异系数为0～6.4％；而批内变异系数为0～6.8％，4℃保存可达6个月。实际应用中，该rApxⅣ-IHA试剂盒检测猪血清阳性率32.0％(176／550)，其中人工感染猪血清rApxⅣ—IHA检测阳性率达到92.2％：在检测的猪场中，其中1个6.1％的阳性率；而其余4个猪场阳性率为27.6～45.0％。以上结果表明rApxⅣ—IHA检测方法具有简便、快速和特异性强的特点，适于基层快速定性检测。
参考文献：
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[2]. 胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌基因芯片检测与分型研究[D]. 肖国生. 四川农业大学. 2006
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[4]. 猪胸膜肺炎放线杆菌血清型研究进展[J]. 陈凡, 何启盖, 陈焕春, 刘正飞. 动物医学进展. 2004
[5]. 猪的叁种常见呼吸道细菌多重PCR检测方法的建立[D]. 孙学飞. 安徽农业大学. 2016
[6]. 血清型1，2，6，7胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及应用[D]. 陈华美. 四川农业大学. 2006
[7]. 胸膜肺炎放线杆菌JL03株的全基因组测序与flp操纵子的结构分析[D]. 李良军. 华中农业大学. 2008
[8]. 猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究[D]. 贝为成. 华中农业大学. 2005
[9]. 猪胸膜肺炎放线杆菌的血清型分型及毒力因子研究进展[J]. 陈华美, 肖国生, 文心田. 中国兽药杂志. 2006
[10]. 猪胸膜肺炎放线杆菌血清抗体快速检测试剂盒的研制及应用[D]. 程相蕾. 南京农业大学. 2007
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