（1苏州大学附属第一医院重症医学科 江苏 苏州 215000）苏州大学附属第一医院肿瘤科 江苏 苏州 215000）
【摘要】 目的：探讨数字PCR方法检测肺癌患者中血浆游离DNA中T790M突变的效果。方法：收集40例经穿刺活检证实存在T790M突变的晚期肺腺癌耐药患者和20例正常人的外周血标本并提取血浆游离DNA，分别采用ARMS法和数字PCR法检测血浆游离DNA中的T790M突变情况。结果：40例患者标本中数字PCR法检测到32例T790M突变阳性，ARMS发检测到27例T790M突变阳性。20例正常人标本中数字PCR和ARMS法均未检测到T790M突变。结论：数字PCR法可以作为一种新的检测血浆游离DNA中T790M突变的方法。
【关键词】 肺腺癌；数字PCR；表皮生长因子；T790M突变
【中图分类号】R730.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）36-0225-01
肺癌位于世界癌症之首，而大量肺癌患者存在着表皮生长因子受体突变。络氨酸激酶抑制剂是表皮生长因子受体阳性的晚期非小细胞肺癌患者首选靶向治疗药物。但是患者在服药后在一定时期内会不可避免的出现耐药，而在耐药患者中有50%存在T790M突变[1-2]。阿斯利康最新生产的泰瑞沙能够有效治疗T790M突变的患者[3-4]，因此对T790M突变检测显得尤为重要。晚期肺癌患者穿刺活检存在较大风险，患者也要承受较大痛苦，近年来液态活检由于采样方便、创伤小逐渐成为一种重要肿瘤患者基因检测手段，目前主流检测方法有二代测序，ARMS法等，而数字PCR最近逐渐成为一种新兴的液态活检方法。本研究对40例经穿刺活检后对组织进行ARMS法检测证实存在T790M突变的肺癌患者的血浆游离DNA进行数字PCR法和ARMS法的T790M突变检测，并对比检测结果，以探讨数字PCR法作为一种新的检测方法在血浆游离DNA中检测T790M突变的效果。
1.样本来源及检测方法
1.1 收集2015年3月—2018年6月期间在苏州大学附属第一医院病理确诊为肺腺癌患者活检石蜡组织157例，其中活检组织用ARMS法确认为T790M突变阳性的患者40例。40例样本中男性18例，女性22例，临床分期为Ⅲ到Ⅳ期。平均年龄59岁。采集这40例患者的外周血标本。同时采集20例健康志愿人群外周血标本。均采用10ml无创cell free DNA专用采血管（美国streck公司），采血后2h内进行1200g离心10min，吸取上层血浆转移至2ml离心管，15000g离心12min，吸取上层血浆进行游离DNA提取。
1.2 血浆游离DNA的提取
使用血清/血浆游离DNA分离试剂盒（德国qiagen公司）抽提血浆游离DNA。提取的DNA使用qubit2.0（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行浓度定量。
1.3 血浆游离DNA
T790M突变检测 采用数字微滴式PCR仪 QX200（美国Bio-Rod公司）及伯乐数字PCR T790M突变检测试剂盒检测标本中T790M突变。采用罗氏480荧光定量PCR仪（美国罗氏公司）及人类EGFR基因突变检测试剂盒（中国厦门艾德公司）检测标本中T790M突变。结果判读均参照说明书指示。
2.结果
2.1 40例肺癌患者血浆游离DNA T790M突变结果
40例患者血浆标本中使用数字PCR法检测到32例T790M突变阳性，8例阴性。ARMS法检测到27例T790M突变阳性，13例阴性。数字PCR T790M突变检测敏感度为80%，ARMS法T790M突变检测敏感度为67.5%。数字PCR法和ARMS法T790M突变检测一致率为87.5%。见表。
2.2 20例健康志愿者血浆游离DNA T790M突变结果
20例健康志愿者血浆标本中数字PCR法和ARMS法检测790M突变结果均为阴性。数字PCR法和ARMS法T790M突变检测特异度均为100%。
3.讨论
络氨酸激酶抑制剂是表皮生长因子受体阳性的肺腺癌患者的重要靶向药物，故对表皮生长因子受体突变情况的准确检测对肺癌患者的诊治至关重要。阿斯利康最新研发的泰瑞沙在T790M耐药突变的肺腺癌进展患者上体现出了非常好的治疗效果。我们在40例患者血浆标本中使用数字PCR法检测到32例T790M突变阳性，8例阴性。ARMS法检测到27例T790M突变阳性，13例阴性，20例健康志愿者血浆标本使用数字PCR法和ARMS法检测T790M突变均为阴性。这个结果显示数字PCR在血浆游离DNA基因检测上体现出了非常好的敏感性和特异性，未来可以在血浆游离DNA基因检测上成为一种非常重要的检测方法进行补充。而受限于血浆游离DNA易降解，以及肿瘤时空异质性等客观情况，目前和活检组织的检测敏感度还存在一定的差别，未来随着数字PCR检测方法的改进，以及血浆游离DNA保存和提取的工艺提升，相信数字PCR法的检测灵敏度还会有进一步的提高。
【参考文献】
[1]张亚龙，尤嘉琮.非小细胞肺癌EGFR—TKIs耐药分子靶向研究进展[J].药品评价，2015，(14):14-18，32.
[2]王阿曼，宁振，刘基巍.非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药的分子机制及防治策略[J].中华肿瘤防治杂志，2017，(1):71-78.
[3]魏媛，魏莉，马晓平，等.T790M与晚期NSCLC患者EGFR-TKI继发耐药及预后的相关性[J].中华肿瘤防治杂志，2016，(6):364-368.
[4]叶胜兵，李锐，时姗姗.肺腺癌患者表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药前后EGFR基因状态变化情况探讨[J].中华病理学杂志，2017，(2):98-101.
论文作者:王俊1,李玮2,胡颖熹2,石立彦2,谢宇锋2,喻正
论文发表刊物:《医药前沿》2018年36期
论文发表时间:2019/1/7
标签：突变论文; 血浆论文; 患者论文; 数字论文; 肺癌论文; 标本论文; 阳性论文; 《医药前沿》2018年36期论文;