李红权[1]2001年在《真菌多糖对虾类免疫功能的影响》文中研究说明近年来，严重的暴发性养殖虾类疾病，使我国水产业蒙受了巨大损失。在认识到使用抗生素等药物的负面影响后，人们已把注意力转移到调动或激活虾类自身的免疫系统。真菌多糖作为虾类的免疫激活剂已受到中外学者的重视，但这方面的研究刚刚起步，已研究过的真菌多糖仅限于虫草多糖等少数几种。本文首次研究了叁种名贵的食用真菌发酵产生的胞内多糖对虾类免疫系统的作用机理，为虾类免疫增强剂的研究提供理论依据。 本文通过液体深层发酵提取了赤芝（Ganoderma lucidum）、灰树花（Grifolafrondosa）、香菇（Lentinus edodes）叁种真菌的胞内多糖，确定了最佳发酵条件与提取条件，并对其进行了初步纯化。以真菌多糖作为免疫刺激物，通过注射、饲喂等途径对日本沼虾（M.nipponense）、日本对虾（P.japonicus）进行免疫刺激，研究了真菌多糖对日本沼虾、日本对虾的免疫因子及免疫相关酶类的影响。结果表明：真菌多糖可以使日本沼虾血细胞的吞噬率、吞噬指数，血清溶菌活力、抗菌活力、溶菌活性、凝集素活力以及免疫相关酶类活力显着提高，并可维持一定时间。灰树花多糖的效果最好，注射灰树花多糖后可以使日本沼虾的吞噬率提高56.5％，吞噬指数提高39.3％，抗菌活力提高133.8％，溶菌活力提高90.1％，超氧化物歧化酶（SOD）活力提高42.0％，酚氧化物酶（PO）活力提高133.3％，碱性磷酸酶活力（AKP）提高55.8％，溶血活性提高164.0％。对体长4.0-4.5cm的日本沼虾，每只注射6μll％真菌多糖为宜，饲喂以真菌多糖0.75g/kg饲料为宜。真菌多糖对日本沼虾生长的影响不显着，但可以提高日本沼虾的存活率。对日本对虾注射灰树花多糖后，日本对虾的抗菌活力、溶菌活力、超氧化物歧化酶（SOD）活力、酚氧化物酶活力（PO）分别提高167.3％、143.3％、66.8％、86.4％。且对日本对虾的抗菌活力、溶菌活力、超氧化物歧化酶（SOD）活力提高的百分比高于日本沼虾，但对酚氧化物酶提高的百分比低于日本沼虾。真菌多糖作为免疫激活剂在水产养殖上的应用有着广阔的前景，在应用过程中，要依不同的虾种，选择不同的多糖。
章跃陵[2]2003年在《南美白对虾类Ig的定性、功能和免疫分子进化的研究》文中认为随着淡海水养殖业的迅速兴起，对虾等养殖动物的病害问题显得日益突出。人们尝试了多种途径来防治虾病，但收效甚微。由此认为虾类免疫学研究是最终战胜虾类病害的重要基础。一般认为，无脊椎动物体液中不具有免疫球蛋白。但近年来，许多学者在无脊椎动物中证实了免疫球蛋白超家族分子，甚至初级适应性免疫的存在。关于虾内是否存在类Ig物质，尚存在争论。本文运用免疫学，蛋白质组学，基因克隆和生物信息学等现代生物学技术，以我国南方主要养殖虾种——南美白对虾为研究对象，对对虾血清中的类Ig物质进行分离、纯化、鉴定和功能分析，为丰富虾类免疫系统研究，探索对虾疾病免疫学防治奠定基础。 结果表明，对虾血清与羊抗人Ig(IgM、IgG、IgA)在单向扩散板和硝酸纤维膜上可分别形成明显的沉淀环和沉淀斑。对虾血清的Western-blotting实验结果显示，与羊抗人Ig发生特异性结合的对虾类Ig的表观分子量为70 kDa(Wp70)，其结合反应可以被特异性阻断和中和。这些与羊抗人IgM、IgG、IgA结合的蛋白质依次称为对虾血清类IgM、IgG和IgA，其在虾血清中的含量依次为0.1578±0.0427、1.2255±0.6844和0.3178±0.1243mg／mL。免疫组化研究证明，对虾组织和血细胞中同样存在与羊抗人Ig发生特异性结合的类Ig物质。对虾类Ig的定性分析，为类Ig的进一步研究奠定了扎实基础。 将免疫亲和层析和蛋白质组学技术相结合建立了亲和蛋白质组学技术。采用该技术对对虾血清中的类Ig进行分离、纯化和鉴定。结果显示，采用羊抗人IgM、IgG、IgA层析得到的对虾血清类Ig在1-D和2-D电泳上均表现为表观分子量分别为75kDa、73kDa、62kDa的叁种蛋白(Ap75、Ap73、Ap62)，其中Ap75蛋白与羊抗人IgG反应呈阳性，而Ap73蛋白与羊抗人IgM和IgA反应呈阳性。经MALDI-TOF／MS分析，Ap75、Ap73和Ap62均与南美白对虾血清中的血蓝蛋白具有同源性，其匹配率分别为22％、26％和24％。运用ESI-MS／MS对其进行进一步鉴定，结果发现Ap75和Ap73分别与南美白对虾血蓝蛋白Hcl单体(gi|7414468)和血蓝蛋白前体(gi|1085839)匹配。由此认为，对虾血清中与羊抗人Ig发生特异性结合的蛋白为血蓝蛋白及前体。 选择不同物种范围，对血蓝蛋白及前体PMF进行Mascot检索。结果表明，血蓝蛋白及前体与高等生物的免疫分子和低等生物的识别分子具有同源性。进一厦门大学博士学位论文步利用生物信息学方法对血蓝蛋白及前体进行保守区的搜索、序列比对、叁维结构同源建模及进化树的构建，发现血蓝蛋白及前体中含有一个长252个残基，位于其c端的19一l议e区。在血蓝蛋白及前体氨基酸序列中存在多个与人19高度同源的模序，其中血蓝蛋白前体和Hol单体19一like区的motifoll-625(HPCR611一动和motifelg-633在叁维结构中的位置与人Ig重链相对应moti玩.55的位置相似。由于两者在此模序中的氨基酸序列仅有1个氨基酸不同，故仅选取血蓝蛋白前体HPcR6，:一625模序进行序列比对分析，结果发现该模序序列EYNI开GSHGvYPDKR、与不同生物的免疫分子(如人Ig、TCR、MHq和识别分子(如细菌粘附分子)具有较高的同源性，是一个新发现的在免疫分子进化过程中的保守模序。尤其值得重视的是，在血蓝蛋白前体与脊椎动物IgSF的分子进化树中，血蓝蛋白前体与兔IgM和人Ig重链等IgSF分子关系非常密切。这些结果提示，血蓝蛋白及前体是一类与人Ig密切相关的新的免疫球蛋白超家族(195玛分子。 利用基因工程技术，对血蓝蛋白基因(Hc基因)及其19一like区(Hc*I基因)、19一like+CuB区(He一IB基因)和。+euA区(Hc一NI基因)进行克隆和原核表达。取各重组蛋白进行以羊抗人Ig为一抗的immunoblot分析。结果表明，Hc，Hc一I和Hc一IB的重组蛋白能与羊抗人Ig反应，而Hc一NI的重组蛋白不能与羊抗人Ig反应。说明血蓝蛋白与羊抗人Ig的结合区域为其C端的Ig一like保守区。进一步研究显示，其两者之间的特异性结合是血蓝蛋白与人Ig的抗原决定簇相似所致。 在对对虾血清类Ig进行了分析和鉴定的基础上，进一步探讨了血蓝蛋白及前体的免疫学功能。结果发现，血蓝蛋白能直接与细菌相互作用，其结合位置在血蓝蛋白为19一like保守区，在细菌为膜蛋白ompx和ompc。血蓝蛋白的lg一like区重组表达蛋白与细菌外膜蛋白的结合可直接导致血清中酚氧化酶活性的变化，其作用机制可能是一种免疫分子与病原微生物之间的分子互作。实验还发现，血蓝蛋白前体对鸡红细胞和10种细菌表现出明显的凝集活性，其凝集活性仅被N一乙酞神经氨酸强烈抑制。研究结果说明，血蓝蛋白是一种重要的抗感染分子。 为进一步阐明血蓝蛋白的免疫防御功能，采用副溶血弧菌人工感染南美白对虾。结果发现，大部分受感染的对虾血清中条带明显增加，其中分子量为28.5kD a的血蓝蛋白裂解片段帅28．5）在12k前后死亡对虾中出现的比例分别为25％和56．5％。经卡方检验，两者之间具有极显着性差异O叙对1卜这些结果提示，该蛋白可能与对虾抗感染免疫的能力有关。 综上所述，本文发现对虾类Ig为血蓝蛋白或其前体，具有免疫防御功能，可能是Ig
李红权, 刘燕, 王安利[3]2006年在《赤芝多糖对日本沼虾免疫功能的影响》文中研究表明本研究在日本沼虾的饲料中添加不同剂量的赤芝多糖,通过测定血清抗菌活力、溶菌活力、超氧化物歧化酶、酚氧化酶以及存活率等指标,研究其对日本沼虾免疫功能的影响。结果表明,饵料中添加1%、1.5%和2%的赤芝多糖对沼虾都有显着的增强免疫功能的作用,其中1.5%的赤芝多糖的效果要优于其他两组。
隋大鹏[4]2003年在《微生态制剂对南美白对虾生长和非特异性免疫因子影响的研究》文中研究说明从海水和养殖对虾体表及体内分离纯化得到223株细菌。从中筛选出若干生长旺盛、特征明显、消化酶活性较强且对弧菌有一定拮抗性的菌株，保种备用。临用时按一定比例制备成微生态制剂。 以南美白对虾(Penaeus vannamei Boone)为试验材料，将微生态制剂定期加入养殖水体，定期测量对虾体长和体重，并抽取虾血，计数血细胞数量并研究其组成，并测定对虾血清中的酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、抗菌活力(Ua)及溶菌活力(Ul)。同时，定期取试验组和对照组对虾的类淋巴器，制备显微光镜切片和超微电镜切片，观察并摄影。 结果显示，对虾体长和体重的增长速度明显加快，试验组体长增长率(13.27％)显着高于对照组(9.33％)(P＜0.05)，试验组体重增长率(73.65％)显着高于对照组(63.17％)(P＜0.05)。试验组对虾颗粒细胞数比对照组增加63.92％，小颗粒细胞数增加61.5％，血细胞总数增加29.04％。试验组各项免疫指标均比对照组有所增强。其中效果明显的是酚氧化酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、抗菌活力和溶菌活力。结合其他研究者的研究成果，建议将酚氧化酶、超氧化物歧化酶、抗菌活力和溶菌活力作为衡量对虾免疫功能强弱的指标。类淋巴器观察结果表明：光镜下，试验组类淋巴器明显比对照组大，第二种小管明显多于对照组的，且血细胞数目明显较多；电镜下，试验组颗粒细胞和小颗粒细胞明显多于对照组。 综上可知，微生态制剂可以促进南美白对虾的生长，并通过增加血细胞数量和改善其组成增强其防病抗病能力，通过促进类淋巴器的发育来增强其非特异性免疫功能，可以增强与非特异性免疫有关的酶活力值和免疫因子活力，从而更好的预防和抵抗疾病。使用微生态制剂进行对虾健康养殖，有着良好的应用前景。 本次试验在研究微生态制剂对南美白对虾生长和免疫的影响方面进行了有中国海洋大学硕士论文微生态制剂对南美白对虾生长和非特异性免疫因子影响的研究益的尝试。较为细致地观察了南美白对虾类淋巴器的形态结构。初步掌握了几个对非特异性免疫有关的酶活的变化规律，确定了以酚氧化酶、超氧化物岐化酶、抗菌活力和溶菌活力作为衡量对虾健康状况和免疫机能强弱的指标，为对虾的病害防治工作提供了参照。试验操作中采用了与分子生物学相关的试验技术，如96孔酶标板法测定对虾血清酚氧化酶活力。试验全过程是将微生态制剂直接加入养殖水体，由于以往的类似研究多通过口服或注射途径进行，采用直接加入水体方法进行研究是一种有意义的尝试。发现这种方法可以取得与注射或口服相似的结果，并且操作简便，值得推广。
戚成震[5]2005年在《凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）免疫疲劳初探》文中提出本文以凡纳滨对虾和中国明对虾为研究对象,分别进行了为期66天与42天的养殖实验,研究长期投喂含β-1,3/1,6-葡聚糖饲料对这两种对虾免疫力的影响。同时,在投喂葡聚糖饲料一段时间的基础上(凡纳滨对虾23天;中国明对虾24天),换用其它免疫增强剂的饲料继续投喂,研究这种投喂方式对这两种对虾各种免疫指标的影响,同时,这也是对水产养殖动物免疫疲劳唤醒问题的一个尝试。主要研究结果如下: 1.凡纳滨对虾由于长期服用葡聚糖饲料,在血浆蛋白浓度这项指标上表现出一个先升高,后降低的趋势,也就是Chang(2000)所提出的免疫指标疲劳现象。通过改换含有其它免疫增强剂饲料继续投喂这种方式,没有解决血浆蛋白浓度这项指标的免疫疲劳问题。 2.含葡聚糖饲料能够显着提高凡纳滨对虾的血浆酚氧化酶活力与血浆蛋白浓度(P<0.05),但对其它各项指标的影响均不显着。 3.在实验的第二阶段(从第23天开始),换用含其它各种免疫增强剂(肽聚糖、左旋咪唑、乳铁蛋白)饲料进行继续投喂后,各种免疫增强剂对凡纳滨对虾各项免疫指标的影响如下:实验进行到第44天时,肽聚糖饲料显着提高了碱性磷酸酶的活力(P<0.05);实验进行到第32天时,左旋米唑饲料显着的抑制了酸性磷酸酶的活力(P<0.05);实验进行到第44天时,乳铁蛋白饲料显着的提高了碱性磷酸酶的活力(P<0.05)。 4.中国明对虾长期服用含葡聚糖饲料,在测定的各项免疫指标中均没有表现出Chang(2000)所提出的免疫疲劳现象。 5.葡聚糖饲料能够显着的提高中国明对虾的血浆酚氧化酶活力(P<0.05),但对其它各项所测定的指标无显着性的影响。 6.在实验的第二阶段(从第24天开始)换用含其它各种免疫增强剂(肽聚糖、左旋咪唑、维生素C)饲料继续投喂后,各种免疫增强剂对中国明对虾的各项免疫指标无显着性影响。
李义[6]2007年在《中华绒螯蟹新型免疫调节剂及其酚氧化酶的纯化和性质研究》文中提出本文综述了甲壳动物免疫防御机制研究的现状及最新进展,首次比较系统地研究了左旋咪唑、米糠多糖、山药多糖及CpG寡脱氧核苷酸(ODN-2006)对中华绒螯蟹(Eriociteir sinensis)免疫功能和抗病力的影响;探讨了ODN-2006触发中华绒螯蟹血细胞酚氧化酶原激活系统的信号转导机制;从中华绒螯蟹血细胞破碎物上清液中分离纯化到了酚氧化酶并对其生物化学性质进行了研究。现将研究结果总结如下:(1)左旋咪唑对中华绒螯蟹免疫功能及抗病力的影响为研究饲料添加左旋咪唑(levamisole,LMS)对中华绒螯蟹的免疫调节作用,以0(对照)、100、200和300mg·kg~(-1)干饲料的剂量将LMS添加于基础饲料中,制成颗粒饲料投喂中华绒螯蟹7 d,然后投喂不含LMS的对照组饲料。在投喂含LMS的饲料之前(0周)和投喂后2、4、6、8周,采样测定中华绒螯蟹的血细胞总数(THC)、不同血细胞数量(DHC)、吞噬活性、呼吸爆发(超氧阴离子的释放)、酚氧化酶(PO)活性和溶菌酶(LSZ)活性;并在投喂含LMS的饲料后的第4周,按1.2×10~7 cfu·kg~(-1)体重的剂量,体腔注射接种中华绒螯蟹致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)CL99920菌株,记录接种10d后中华绒螯蟹的累积死亡率。结果显示,各LMS处理组的THC、透明细胞(HC)数量、吞噬百分率(PP)、呼吸爆发、PO活性和LSZ活性均显着地高于对照组(P＜0.05);颗粒细胞(GC)数量、血细胞吞噬指数(PI)与对照组无显着差异(P＞0.05);LMS处理的中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的抵抗力明显增强。由此表明,饲喂适量的LMS可增强中华绒螯蟹的免疫力和抗病力;在试验条件下,200 mg·kg~(-1)干饲料的剂量为最适添加剂量;LMS可作为中华绒螯蟹的新型免疫调节剂在疾病预防中使用。(2)两种植物多糖对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用为研究饲料添加米糠多糖(Rice bran polysaccharide,RBP)和山药多糖(Chinese yam polysaccharide,CYP)这两种高等植物多糖对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用,将RBP、CYP按0(对照)、1.0、2.0和4.0 g·kg~(-1)干饲料的剂量添加于基础饲料中投喂中华绒螯蟹,采取间隔投喂的策略,即每投喂7天试验饲料后再投喂7天对照饲料,整个试验持续6周。在试验开始后1、2、4、6周采样,对中华绒螯蟹的一系列免疫学参数进行测定,并在试验开始后2周,按1.2×10~7 cfu·kg~(-1)体重的剂量,体腔注射接种中华绒螯蟹致病性嗜水气单胞菌CL99920菌株,记录接种7 d后中华绒螯蟹的累积死亡率。结果显示,饲料添加2.0～4.0 g·kg~(-1)的RBP、1.0～2.0 g·kg~(-1)的CYP能显着地提高中华绒螯蟹的THC和HC数量(P＜0.05),显着地增强血细胞的吞噬活性和HIS的PO活性(P＜0.05),显着地提高血清POD、SOD、ACP、ALP活性及抗菌活性(P＜0.05),并能明显地增强中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的抵抗力,但对血清LSZ活性的影响没有规律性。上述结果表明,饲喂2.0～4.0 g·kg~(-1)的RBP或1.0～2.0 g·kg~(-1)的CYP能显着地增强中华绒螯蟹的免疫功能和抗病力;两种植物多糖可作为中华绒螯蟹的新型免疫调节剂在养殖生产中试用。(3) CpG寡脱氧核苷酸对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用将ODN-2006(含3个CpG基序)、ODN-R(含1个反向CpG基序)按0(对照)、1、5和25μg·kg~(-1)体重的剂量体腔注射中华绒螯蟹(0.1 mL·只~(-1)),同时设注射等体积的0.85%生理盐水的对照组,研究了两种ODN对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用。在注射ODNs或生理盐水之前(0 d)和注射后第1、3、5、8 d采样,对中华绒螯蟹的一系列免疫学参数进行测定,并在注射ODNs后第3 d,按1.2×10~7 cfu·kg~(-1)体重的剂量,体腔注射接种中华绒螯蟹致病性嗜水气单胞菌CL99920菌株,记录接种7 d后中华绒螯蟹的累积死亡率。结果显示,25μg·kg~(-1)ODN-2006能显着地提高中华绒螯蟹的THC、吞噬活性和呼吸爆发活性(P＜0.05),显着地增强血清PO、SOD、ACP、ALP、溶血素及抗菌活性(P＜0.05),但对中华绒螯蟹的DHC、血清POD及LSZ活性没有显着影响(P＞0.05)。此外,25μg·kg~(-1)ODN-2006能明显地增强中华绒螯蟹对致病性嗜水气单胞菌的抵抗力。与此相对,25μg·kg~(-1)ODN-R除对血清PO活性具有显着的增强作用外(P＜0.05),对其他免疫学参数没有明显的影响(P＞0.05)。上述结果表明,ODN-2006能显着地增强中华绒螯蟹的免疫功能和抵抗力,是中华绒螯蟹潜在的新型免疫调节剂,可进一步加以研发和利用。(4) CpG寡脱氧核苷酸触发中华绒螯蟹proPO激活系统的信号转导途径以0、5、10、15、20和25μg·mL~(-1)浓度的ODN-2006体外处理中华绒螯蟹血细胞30min,研究了ODN-2006对中华绒螯蟹PO活性的影响。结果显示,10μg·mL~(-1)以上浓度的ODN-2006能显着地增强血细胞胞内外受ODN刺激的PO(PO_S)活性及胞外总PO(PO_T)活性(P＜0.05),但胞内PO_T活性有所下降;ODN-2006诱导的胞内外PO活性的上升或下降均显示出剂量依赖性。由此表明,在试验条件下,ODN-2006能刺激中华绒螯蟹血细胞脱颗粒,但不能刺激血细胞合成新的proPO。进一步以10μg·mL~(-1)ODN-2006和一定浓度的特异性信号激活剂或抑制剂分别单独或联合体外处理中华绒螯蟹血细胞30 min,通过检测血细胞胞内外PO活性的增减情况,对ODN-2006触发proPO激活系统的信号转导途径进行了探讨。结果显示,用氟化钠(G蛋白激活剂)处理血细胞,胞内外PO_T活性均增加;用8-Br-cAMP(PKA激活剂)或咖啡因(磷酸二酯酶抑制剂)或白屈菜赤碱(PKC抑制剂)处理血细胞,胞内PO_T活性增加,胞外PO_T活性下降;用佛波酯(PMA,PKC激活剂)处理血细胞,胞外PO_T活性增加,胞内PO_T活性下降;用叁羟基异黄酮(酪氨酸蛋白激酶抑制剂)处理血细胞,胞内外PO_S活性及胞外PO_T活性均上升,胞内PO_T活性下降。当用白屈菜赤碱和ODN-2006或PMA共同处理血细胞时,白屈菜赤碱对ODN或PMA诱导增强的胞内外PO_S活性及胞外PO_T活性具有较强的抑制作用。此外,试验发现氟化钠、PMA及叁羟基异黄酮与ODN-2006对血细胞脱颗粒具有协同刺激作用,ODN-2006可部分地解除被8-Br-cAMP、咖啡因或白屈菜赤碱对血细胞脱颗粒的抑制作用。上述结果表明,ODN-2006可能经由G-蛋白介导的PKC途径活化中华绒螯蟹血细胞proPO系统,并通过酪氨酸蛋白激酶途径进行负调控。(5)中华绒螯蟹酚氧化酶的分离纯化及其生物化学性质以中华绒螯蟹的HLS为材料,利用凝胶过滤和离子交换层析等方法,对中华绒螯蟹的酚氧化酶(PO)进行了分离纯化和生物化学性质研究。试验发现,中华绒螯蟹酚氧化酶原(proPO)的相对分子质量约为76.4 kDa,在试验操作过程中极易发生降解或自身降解,变成有活性的大小约70.1 kDa的PO。以L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)为特异性底物对PO活性进行研究发现,中华绒螯蟹PO的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,对L-DOPA和邻苯二酚的K_m值分别约为2.63 mmol·L~(-1)和6.25 mmol·L~(-1)。中华绒螯蟹PO对苯硫脲极为敏感,对硫脲、半胱氨酸、抗坏血酸及苯甲酸也很敏感。根据中华绒螯蟹PO对抑制剂的敏感性和对底物的亲和力,将其鉴定为邻二酚氧化酶(o-diphenoloxidase)。中华绒螯蟹PO对胰蛋白酶抑制剂SBTI较为敏感,但几乎不受另一种胰蛋白酶抑制剂TLCK的影响,推测该酶在蛋白酶性质上与胰蛋白酶存在着一定的相似性。此外,中华绒螯蟹PO的活性可被二乙基二硫代氨基甲酸钠(DETC)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Cu~(2+)、Zn~(2+)及Ca~(2+)强烈抑制,Cu~(2+)能有效地恢复被DETC或EDTA抑制的PO活性,表明该酶很可能是一种Cu-金属酶(Cu-metalloenzyme)。
魏克强[7]2005年在《对虾白斑综合症病毒浙江株对实验动物克氏原螯虾的致病性及其重组囊膜蛋白rVp28保护效应的研究》文中指出对虾养殖是我国水产业的重要创汇和支柱产业之一,然而病害却是制约当前对虾养殖业持续发展的瓶颈问题。其中,白斑综合症病毒(WSSV),由于致病性强、危害性大、地域分布和宿主范围广泛,自1993年首次暴发性流行以来,至今已造成了巨大的经济损失,同时也给海洋生态平衡带来了一定的威胁,目前还没有有效的防治方法。应用基因工程技术来干扰病毒与宿主细胞的结合机制,将为预防和控制对虾的病毒性疾病开辟新的途径。因此,本课题利用对虾白斑综合症病毒浙江株(WSSV-ZJ)及其以家蚕杆状病毒表达系统在家蚕蛹中表达的重组囊膜蛋白rVp28作为试验材料,以实验动物克氏原螯虾作为试验对象,采用感染试验、核酸探针杂交试验和免疫试验等方法,研究了WSSV-ZJ株对螯虾的致病性、rVp28对螯虾免疫因子的影响和抗病毒保护效应。主要研究结果如下: 1.WSSV-ZJ株于2001年从宁波地区患病中国对虾中分离得到,经螯虾感染增殖,透射电镜观察显示,与其它地区毒株的形态结构相似,但大小不同:病毒感染组织的粗提液和超薄切片中,完整的病毒粒子呈椭圆形,具有双层囊膜结构,大小分别约为319 nm×69 nm和318 nm×90 nm;精提液中脱掉囊膜的核衣壳呈长杆状,大小约(211～344)nm×(50～63)nm。 2.感染试验表明,水温22～24℃,投喂染毒肌肉组织和注射病毒粗提液,在8天内螯虾的死亡率可达100%。组织切片H. E染色光镜观察显示,WSSV-ZJ株在螯虾体内感染增殖对胃、肠、甲壳下上皮、鳃和肝胰腺等组织的上皮细胞较敏感,呈现细胞核肿大、深染等典型的病变特征。透射电镜观察显示,病毒感染的细胞呈现细胞核肿大、染色质消失;线粒体大量坏死,嵴断裂、脱落;粗面内质网增生、严重扩张等明显的病理变化。DIG标记WSSV特异性核酸探针的原位杂交结果表明,WSSV-ZJ株对螯虾消化道上皮具有很强的组织嗜性,是病毒侵染的主要靶位点。提示病毒的感染增殖造成了机体新陈代谢功能衰退与丧失,最终导致发病死亡。 3.以体重23.0±0.2g的螯虾为试验动物,以重组杆状病毒HyNPV-Vp28感染的家蚕蛹为试验材料,试验分为3个处理组,每组60尾。试验蚕蛹(Test pupa)组:饵料中添加2%的含有表达Vp28基因产物的蚕蛹;对照蚕蛹(Control pupa)
黄建华[8]2012年在《WSSV部分基因序列分析及防控WSS免疫增强剂的筛选》文中进行了进一步梳理对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是迄今为止对全球虾类养殖业危害最为严重的一种双链DNA病毒,自1992年我国台湾地区首次发生养殖的斑节对虾感染该病毒大规模死亡事件,短短10多年间,该病毒席卷了全球的虾类养殖地区,给世界虾类养殖业造成了不可估量的损失。近年来在江苏地区爆发虾病,养殖的脊尾白虾大规模死亡,严重影响了该地区海水养殖业的经济发展。本实验用PCR的方法在基因水平上对WSSV感染江苏沿海养殖脊尾白虾的分子流行病学进行了研究。即以江苏沿海典型发病的脊尾白虾所携带的WSSV为实验对象,提取其基因组,设计出了针对8个可变区的特异性PCR引物,研究了该分离株与GenBank上公布的3个WSSV全基因序列相关片段上的差异,检测了该分离株在可变区中非同源重复区单向重复单元的数量差异以及重复单元中的SNP。结果显示,该分离株的8个片段序列差异主要表现在重复单元数量的不同、单核苷酸变异、单核苷酸多态性和单核苷酸插入,可变区在进化上与中国株的序列有明显差异,与台湾株和泰国株的进化关系较近。推测DY001株可能由其它分离株的共同的祖先通过序列的缺失、插入和单核苷酸变异进化而来,在进化过程中,某些片段基因与台湾株和泰国株的片段基因出现很大的相似性,江苏地区脊尾白虾感染WSSV可能具有不同于其它分离株的流行病特点。通过养殖试验分析了4种添加剂对脊尾白虾非特异性免疫功能的影响。在基础饲料中分别添加0.5%海藻糖、0.5%壳聚糖、1.0%蜂胶和1.0%光合细菌配制成四种免疫实验饲料,以基础饲料为空白对照组饲料,每个试验组设2组平行,对体质量为3.33±1.24g、体长为3.50±1.21cm的脊尾白虾进行为期30d的养殖实验,分别在第3、6、9、12、15、18、21、24、27及30d进行取样,以肌肉组织中的过氧化物酶活性(POD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)及超氧化物歧化酶(SOD)为免疫指标,探讨了这四种物质作为免疫制剂对脊尾白虾非特异性免疫效应的影响。AKP和ACP是磷酸单脂酶,参与磷酸单脂酶的水解反应和磷酸基团的转移反应,加速物质的摄取和转运,对虾类蜕壳过程具有重要作用。POD和SOD都是抗氧化酶,其活性的高低直接反映了机体清除O2-的能力,作为氧的清除剂参与清除体内自由基,在防御机体衰老及分子损伤等方面有极为重要的作用。试验结果发现,海藻糖、壳聚糖、蜂胶和光合细茵在一定的时间段内对脊尾白虾组织中的AKP、ACP、SOD及POD等活性都有使其升高的作用；而蜂胶和光合细菌对脊尾白虾各酶活性效果强于海藻糖和壳聚糖,光合细菌易于培养,综合考虑光合细菌和蜂胶的成本及作用效果,本试验建议光合细菌作为脊尾白虾免疫增强剂,具有良好的应用前景。
裴素蕊[9]2009年在《饲料中添加虾青素对凡纳滨对虾的影响及作用机理》文中进行了进一步梳理本文从雨生红球藻中提取虾青素,高效液相色谱法测定虾青素的含量后添加到凡纳滨对虾的基础饲料中。分别从虾青素对生长、存活和抗氧化能力的影响,对抗氨氮胁迫能力的影响和光保护作用叁个方面研究饲料中添加虾青素对凡纳滨对虾的影响,并探讨其作用机理。实验中虾青素分别以0、20、40、60、80、100mg/kg的浓度添加到凡纳滨对虾的饲料中投喂7周,研究虾青素对凡纳滨对虾生长、存活和抗氧化能力的影响。结果显示,虾青素可提高凡纳滨对虾的存活率和特定生长率(SGR),其中添加量80 mg/kg组最高,80 mg/kg组SGR和对照组间差异显着(P<0.05),但实验组和对照组间存活率无显着差异(P>0.05)。各实验组的总抗氧化能力(T-AOC)与对照组相比显着升高(P<0.05),到第四周后逐步稳定；超氧化物歧化酶(SOD)活力和过氧化氢酶(CAT)活力与对照组相比均显着降低,且都表现出先降低后升高的变化趋势,第4周左右酶活力降到最低。以生长、存活和抗氧化能力为指标,虾青素的最适添加量为80 mg/kg,最佳投喂时间为4周。在氨氮胁迫(1mg/L)条件下,虾青素分别以0、80 mg/kg的浓度添加到凡纳滨对虾基础饲料中,投喂时间21 d。结果显示,虾青素可显着提高实验组对虾的SGR和存活率。氨氮胁迫使对照组对虾肌肉细胞中的T-AOC降低,SOD和CAT活力升高；添加虾青素组T-AOC小幅降低后升高,2种酶活力略有降低。氨氮胁迫使对照组对虾的血细胞总数(THC)和吞噬活力降低,凝血时间延长；添加虾青素组的THC先降低,7d后恢复到正常水平,吞噬活力和凝血时间无明显变化。证明虾青素可提高凡纳滨对虾的抗氨氮胁迫能力,提高对虾的存活率,保持血液学指标和抗氧化系统的稳定状态。虾青素以0、80mg/kg浓度添加到凡纳滨对虾的饲料中投喂4周,研究UVA对凡纳滨对虾肌肉细胞的辐射损伤和虾青素对凡纳滨对虾的光保护作用。凡纳滨对虾肌肉细胞原代培养选用M199作为基础培养基,渗透压650 mmol/L, pH值7.2为最佳培养条件。UVA辐射后对虾肌肉细胞存活率下降,T-AOC降低,SOD和CAT活力升高。虾青素可提高UVA辐射后细胞的存活率和T-AOC,降低SOD和CAT活力。证明UVA辐射会对凡纳滨对虾肌肉细胞造成损伤,虾青素可以对UVA辐射损伤的体外培养肌肉细胞起到光保护作用。综上所述,虾青素作为一种免疫增强剂,在添加量为80 mg/kg时可显着提高凡纳滨对虾的存活率和SGR、提高对虾的抗氧化能力,增强对虾抗环境胁迫能力,并可保护细胞免受UVA的损伤。
严芳[10]2011年在《甲壳动物血蓝蛋白免疫学活性及其作用机制研究》文中认为目前我国是世界上最大的甲壳动物(虾蟹)集约化养殖生产国。然而,与国际虾蟹养殖业相比,我国商业化的虾蟹养殖整体效益较低,可持续发展前景不容乐观。究其原因,主要与虾蟹病害和生物安全等有关。为此,学者们认为选育优质、抗逆优良虾蟹品种,建立安全、生态、环保的健康养殖模式,是解决目前虾蟹养殖疾病,提高虾蟹品质的有效途径。要成功解决这些问题,关键环节之一就是揭示虾蟹自身免疫防御机制,寻找虾蟹病害防治的有效方法。近年来研究表明,存在于对虾等无脊椎动物血淋巴中的血蓝蛋白是一种具有抗病毒和抗细菌等多种免疫活性的多功能蛋白。本研究以凡纳滨对虾、锯缘青蟹血蓝蛋白为研究对象,在国内外所获研究结果的基础之上,进一步对其免疫学活性及作用机理等进行了深入的研究,所获研究结果具体如下:1、发现凡纳滨对虾血蓝蛋白抑菌活性与其糖基化修饰有关,且OmpC为其抑菌作用靶标之一首先,在本课题组已分离得到的2种糖含量和抑菌活性存在显着差异的凡纳滨对虾血蓝蛋白(LHt和LH75)的基础之上,本研究采用凝集素印迹、Tricine-SDS-PAGE和HPLC等技术,进一步发现LH75、LHt糖基化修饰存在显着性差异,其中前者α-D-甘露糖、α-D-葡萄糖修饰程度比后者高;前者胰酶水解肽段分子量明显高于后者;前者胰酶酶解HPLC图谱表现为10个峰,而后者为24个峰。同时,2-DE显示,LHt主要蛋白点为7个,大小亚基分别为3和4个点,LH75主要蛋白点为6个,大小亚基分别为4和2个点。由此说明该2种血蓝蛋白不仅在蛋白质水平存在差异,其糖基化修饰也存在差异。继而,选用副溶血弧菌人工感染对虾,发现对虾刺激后虾血清中LHt、LH75表达均呈上升趋势,且LH75上升幅度明显高于LHt。结合前期研究发现LH75抑菌活性显着高于LHt抑菌活性的研究结果,提示LH75可能是血蓝蛋白发挥抑菌作用的重要组分,其抑菌活性应该与糖基化修饰有关。最后,利用亲和孵育获得3种与LH75相结合的副溶血弧菌外膜蛋白(Omp), p1、p2和p3,经质谱鉴定p2为OmpC,根据前期研究发现LH75对外膜蛋白敲除菌△OmpC的抑菌活性明显降低的结果,推测OmpC应为为LH75抑菌作用靶标之一,至于其是否还存在其他作用靶标还有待于进一步研究和证实。2、发现锯缘青蟹血蓝蛋白具有凝集活性,凝集作用靶标为OmpA和OmpX首先,采用亲和蛋白质组学策略,发现锯缘青蟹血蓝蛋白由分子量分别为70、72、75、76、80 kDa的5个亚基组成,其与岸蟹(Carcinus aestuarii)、蓝蟹(Callinectes sapidus)和黄道蟹(Cancer magister)血蓝蛋白亚基具有高度的同源性,且3个主要亚基(p75、p76和p80)与兔抗虾血蓝蛋白抗血清呈显着阳性,说明所获得的青蟹血蓝蛋白成分单一、可靠,适合于进一步研究。继而,采用凝集实验和凝集抑制实验,发现青蟹血蓝蛋白对副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、河弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌K12和金黄色葡萄球菌等7种细菌具有凝集活性,且其凝集活性能被葡萄糖、半乳糖、木糖和N-乙酰神经氨酸部分或完全抑制。说明青蟹血蓝蛋白确实具有凝集活性。最后,运用SDS-PAGE、Western-blotting、凝集抑制实验、基因敲除凝集实验等发现青蟹血蓝蛋白凝集活性作用亚基为76 kDa亚基;大肠杆菌Omp能够抑制血蓝蛋白对7种细菌的凝集活性;与大肠杆菌K12野生菌株相比,血蓝蛋白对△OmpA和△OmpX凝集活性明显降低。由此推测,青蟹血蓝蛋白可能主要依赖其76 kDa亚基,通过与病原菌OmpA和OmpX相结合而发挥凝集活性。3、发现锯缘青蟹血蓝蛋白具有溶血活性,溶血作用机制为胶体渗漏机制采用溶血实验发现锯缘青蟹血蓝蛋白对鸡、鼠、兔、人等多种红细胞表现出依赖于钙离子的溶血活性。其溶血活性具有“剂量-效应”效应,同时对pH、温度敏感,在pH 5-8范围内,溶血活性随pH上升而降低;随着温度的升高,溶血活性逐渐增强, 37℃时溶血活性达到100%。在上述研究的基础之上,进一步采用SDS-PAGE、Western-blotting、渗透保护实验等,发现锯缘青蟹血蓝蛋白5个亚基均可与红细胞膜相结合,且青蟹溶血活性随着渗透保护剂分子的增大而降低。由此推测,青蟹血蓝蛋白可能依赖其全部亚基通过胶体渗漏机制而发挥溶血活性。综上所述,本课题研究主要发现:甲壳动物(虾、蟹)血蓝蛋白具有凝集活性、抑菌活性和溶血活性,其中凝集、抑菌活性作用靶标为细菌外膜蛋白,溶血作用机制为胶体渗漏机制。所获研究结果为揭示血蓝蛋白的免疫学分子作用机制,阐明血蓝蛋白与病原菌的识别模式奠定了良好的基础,同时为研究血蓝蛋白在虾蟹中的免疫抗病作用提供了较好的实验依据,对丰富和发展甲壳类动物免疫系统的基础研究及指导免疫学防治具有重要的意义。
参考文献：
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[2]. 南美白对虾类Ig的定性、功能和免疫分子进化的研究[D]. 章跃陵. 厦门大学. 2003
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[5]. 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）免疫疲劳初探[D]. 戚成震. 中国海洋大学. 2005
[6]. 中华绒螯蟹新型免疫调节剂及其酚氧化酶的纯化和性质研究[D]. 李义. 南京农业大学. 2007
[7]. 对虾白斑综合症病毒浙江株对实验动物克氏原螯虾的致病性及其重组囊膜蛋白rVp28保护效应的研究[D]. 魏克强. 浙江大学. 2005
[8]. WSSV部分基因序列分析及防控WSS免疫增强剂的筛选[D]. 黄建华. 南京农业大学. 2012
[9]. 饲料中添加虾青素对凡纳滨对虾的影响及作用机理[D]. 裴素蕊. 河北大学. 2009
[10]. 甲壳动物血蓝蛋白免疫学活性及其作用机制研究[D]. 严芳. 汕头大学. 2011