杨红[1]2002年在《小鼠重构卵的制作及研究》文中研究说明小鼠体细胞重构胚是将已分化的体细胞核移入去核的卵母细胞中，重构胚经过激活、体外、体内培养等步骤后，移植到寄母输卵管或子宫内，从而获得克隆胚的技术。本论文以新鲜获得的卵丘细胞及传代培养的胎儿成纤维细胞作供核细胞，通过胞浆内直接注射法，将供体细胞核移入去核的MⅡ期卵母细胞内获得重构卵，将其体外培养3—4h，移入10mM SrCl_2激活液中激活6h，再将重构卵移入同步发情的受体鼠输卵管内，72h后处死受体母鼠，冲出胚胎观察其发育情况。主要目的是为了建立一套小鼠体细胞核移植技术系统，探索核移植程序中去核、移核、激活、及重构卵体内培养的关键性技术问题。在卵母细胞去核的研究中，比较了显微操作液中加与不加蔗糖对去核结果的影响。将超排获得的3489枚MⅡ期卵母细胞随机分为两组。A组，2452枚卵细胞，显微操作液中不加蔗糖；B组，1037枚卵母细胞，显微操作液中加2.5％蔗糖。去核率分别为87.64％、89.97％，两组间去核率无明显差异(p＞0.05)；在注射技术的研究中比较了不同管径的注射针对注射后存活率的影响。将3336枚去核卵母细胞随机分为3组，分别选用5-7μm、7-10μm、＞12μm等不同管径的注射针进行注射，注射后存活率为11.84％、35.19％、10.59％，7-10μm管径的注射针注射后存活率最高(p＜0.05)，比较适合小鼠体细胞核移植的显微操作；在激活的研究中获得了卵母细胞孤雌激活的最佳条件及重构卵在最佳激活条件下的激活率。将518枚MⅡ期小鼠卵母细胞随机分为2组，第一组，固定激活时间，改变激活液浓度，将278枚小鼠卵母细胞随机放入2、4、6、8、10mM不同浓度的氯化锶激活液中，激活6小时，第二组，固定激活液浓度，改变激活时间，将240枚小鼠卵母细胞放入10mM氯化锶激活液中，分别作用3、6、9小时，观察激活率及囊胚发2002年扬州人学硕十研究生论文育率。第组，激活率分别为86.49%、82.61%、88.00%、86.67%、81.18%。几组间无明显差异。72小时回收囊胚，囊胚发育率分别为0、31.42%、43.33%、62.5%、50.00%。6一10mM激活液激活后囊胚发育率显着高于O一4mM(P<0.05)。第二组，激活率分别为82.86%、89.6一%、91 .40%。以9小时激活率最高。72小时囊胚发育率分别为26.53%、50.00%、53.22%。激活6、9小时囊胚发育率明显高于激活3小时(P<0.01)。6一0 mM的SrC12为卵母细胞孤雌活化的最佳作用浓度，6一9小时的激活时间为最佳作用时间。其次以10mM SrCI:激活液中激活6h为激活条件，将重构卵475枚放入IOmMSrCI:激活液中激活6h，激活率为57.05%;在重构卵的体内培养的研究中，比较了卵丘细胞及胎儿成纤维细胞为供核的重构卵在体内发育的结果，分析了供核细胞类型对重构卵的后发育的影响。56枚卵丘细胞、45枚胎儿成纤维细胞为供核的重构卵在临时寄母体内培养，72h回收，桑堪囊胚率分别为16.07%、15.38%。两种供核细胞间的桑堪囊胚率无明显差异(p>0.05)。从以上结果可以看出，我们己初步建立一套小鼠体细胞核移植的技术系统，在研究中还将部分卵丘细胞重构卵移植到同步发情的受体鼠体内，仅获得9个着床点和1个死胎，有关克隆小鼠的研究工作还有待于进一步探索。
陈建文[2]2012年在《利用RNA干扰和乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究》文中研究表明仔猪腹泻是养猪业中常见的疾病，给世界养猪业造成了极大地经济损失。传统预防和治疗猪腹泻的方法如改善环境、服食抗菌素和免疫接种等缺点日渐明显，存在很多风险和问题，因此，迫切需要我们用新的方法和手段来有效控制这种疾病的发生。随着分子生物学技术的快速发展，通过转基因操作改良性状的生物育种方法，直接针对育种目标，目的性强、周期短，直接跨越基因互作的消极影响，可以同时改良多个重要经济性状，这是一种新的富有生命力的疾病控制方法，具有传统的免疫学方法控制疾病所无法比拟的优势。因此，利用转基因技术开展猪抗病育种研究，开发出具有自主知识产权和抗腹泻病转基因猪抗病新品种，提高疾病控制水平，有效控制这种疾病，意义重大。本研究主要从两个方面入手创制转基因抗病育种新材料：一是通过RNAi技术，培育特殊抗病力（ETEC F18）的转基因猪生物育种新材料；二是通过乳腺生物反应器模型培育一般抗病力抗病转基因猪生物育种新材料。主要结果如下：1.通过RNAi技术培育转基因猪育种新材料的工作如下：1)建立了一种基于Cre-LoxP的多启动子介导多个shRNA的方法，获得了干扰FUT1的转基因囊胚；2)建立了一种由慢病毒介导shRNA的方法，获得了7头转基因猪，并从其相关免疫学指标及小肠粘附抑制等生物学功能进行了抗病性研究；3)利用2）中获得的慢病毒感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2），结果显示RNA干扰前后F18大肠杆菌对小肠上皮细胞的粘附能力无显着差异，结合国内外研究，证明了FUT1不是F18大肠杆菌致病的主要受体基因；2.通过乳腺生物反应器模型培育转基因猪育种新材料的工作如下：1)为探讨转pBD-1基因小鼠在疾病方面的抗病作用，利用小鼠可以在SPF这一环境下饲养的这一优势，开展pBD-1在动物水平群体抗病性及上的功能研究，建立了一种猪防御素-1(pBD-1)转基因小鼠模型，为建立大动物抗病育种模型奠定了基础；2)为了评估表达载体设计的合理性和高效性，为进一步开展利用乳腺生物反应器模型培育一般抗病力的生物新品种奠定基础，建立了一种乳腺生物反应器载体验证的细胞模型，同时通过细胞模型预测转基因成体动物相关免疫应答通路奠定了基础及建立了研究模型；3)建立了转人溶菌酶的转基因细胞系，并进行移植，获得了9头胎儿；4)建立了转pBD-1的转基因细胞系，并进行移植，获得了转基因囊胚。本研究的创新点：首次建立了一种由4启动子介导4个shRNA的全部筛选标记可去除的表达载体，并首次获得了干扰FUT1的转基因囊胚；首次通过体细胞核移植获得了慢病毒介导的RNA干扰的大动物模型；首次在细胞学水平上证明了FUT1不是导致仔猪腹泻与水肿病的主效受体基因；首次利用细胞模型对猪防御素进行了研究，初步建立了一种乳腺生物反应器的细胞模型；首次获得了转pBD-1的转基因小鼠与转基因猪囊胚。
淡新刚[3]2006年在《小鼠卵母细胞孤雌激活、去核方法及受精卵体外培养研究》文中认为小鼠卵母细胞相对较小,显微操作易导致胞质散裂,因此小鼠核移植难度较大,成功率较低,其中培养液、激活条件、去核方法都极大地影响其成功率。本研究通过对小鼠受精卵体外培养体系,MII期卵母细胞孤雌激活条件的筛选以及探讨MII期卵母细胞的去核方法为小鼠体细胞核移植的成功奠定基础。1、筛选最佳的小鼠胚胎体外发育培养体系,并进一步探讨不同浓度的FBS、PVA、hLIF对其体外发育的影响,从而为小鼠卵母细胞核移植后重构胚的体外培养提供支持。试验I:分别用自配的M16、mM16、KSOM、mKSOM、CZB进行体外发育培养,进而筛选出一种最佳的体外培养体系;在筛选出培养液的基础上进行试验II、III、IV,分别探讨FBS、PVA、hLIF对小鼠胚胎发育的影响。结果,试验I中,受精卵培养效果最好的培养液为mM16,其次为mKSOM,在这两种培养液中,胚胎发育到4-细胞的比率分别为94.7%(91/96)和85.8.%(73/85),发育到桑椹胚/囊胚的比率分别为84%(80/96)和81.1%(69/85),均明显高于其他叁种培养液(p<0.05);试验II,用5%FBS、10%FBS或15%FBS代替mM16中的BSA时,胚胎发育至桑椹胚或囊胚的比率明显下降,分别为32.6%、35.8%,与对照组(82.1%)差异显着(p<0.05);试验III,用0.05 mg/mL PVA、0.1 mg/mL PVA、0.5 mg/mL PVA或1 mg/mL PVA取代mM16中的BSA,胚胎不能发育到桑椹胚/囊胚,与对照组差异显着(p<0.05);试验IV,叁种不同浓度的hLIF均能提高胚胎在体外的发育率,但以1000 IU/mL浓度的hLIF效果最好。表明在不添加其他成分前提下,只在M16中添加0.1 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L牛磺酸、1000 IU/mL hLIF便可获得84%的囊胚率;FBS和PVA不能有效取代mM16中的BSA。2、采用不同的激活方法对小鼠卵母细胞进行孤雌激活研究。小鼠注射hCG13 h后,采集卵母细胞并在体外培养4 h～5 h,分别采用乙醇、氯化锶、电脉冲对卵母细胞进行孤雌激活。结果显示:乙醇对小鼠卵母细胞的孤雌激活效果最好,其次是氯化锶,电脉冲对小鼠卵母细胞的孤雌激活效果较差;8%的乙醇激活5 min,其激活率可达97.9%,随后激活卵发育到桑椹胚/囊胚的比率为85.4%,与其他乙醇激活组差异显着;在氯化锶的激活组中,用2 mmol/L SrCl2和5μg/mL CB处理卵母细胞1 h,其激活效果最好;含有1%DMSO的氯化锶激活组中,卵母细胞的激活率普遍高于含5μg/mL CB的氯化锶激活组,差异显着(P<0.05),但随后激活卵发育到桑椹胚或囊胚的比率明显低于含5μg/mlL CB的氯化锶激活组,差异极显着(P<0.01);电脉冲对小鼠卵母细胞激活率和随后激活卵的发育率普遍都较低,其中以场强为2.0 kv/cm,持续时间160μs,连续两次激活效果
肖雄[4]2012年在《应用小鼠胚胎干细胞（ESCs）裂解液逆转化胎儿成纤维细胞（MEFs）为诱导性多能干细胞（iPSCs）的研究》文中研究表明诱导已分化体细胞发生去分化并形成类似于ESCs多能性细胞特征的过程称作“体细胞重编程”。从ESCs裂解液中提取活性物质诱导已分化体细胞重编程为多能干细胞的过程,既没有诱导性干细胞基因组染色质的直接参与,也没有被诱导体细胞基因组DNA结构序列的变化；研究ESCs提取物中有活性细胞因子的作用,有利于发现和识别与重编程相关的细胞因子及其表达调控机制,并进而研究其相互作用关系；因为ESCs的提取物直接诱导靶细胞使其发生了生物学变化,而没有引起靶细胞基因组碱基序列发生结构学变化,不会使靶细胞发生遗传学变异,因此,应用这项技术对体细胞重编程所诱导形成的多能干细胞具有更好的生物安全性；以上种种优势赋予这项研究内容在生物医学领域具有重要的理论价值和广阔的应用前景。本研究通过优化小鼠体内受精囊胚、杂合二倍体孤雌囊胚、人工重组异期卵母细胞核二倍体孤雌囊胚(含有速激核成熟新生鼠生长初期卵母细胞与成熟卵母细胞基因组二倍体小鼠孤雌囊胚)的获取途径,获得不同囊胚来源的ESCs。采用形态学观察法、碱性磷酸酶(AKP)染色法、核型分析法、Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学检测法、Oct-4基因和Sox-2基因表达检测法、类胚体(EB)分化能力检测等方法对其ESCs的特性进行鉴定。用于被诱导的受体MEFs,采用曲古抑菌素A(TSA)和5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-dc)预处理,然后再经过适宜浓度链球菌溶血素O(SLO)渗透化处理；用于起诱导作用的不同囊胚来源的小鼠ESCs,采用液氮反复冻融和离心的方法,得到不同类型ESCs的无细胞裂解液；将受体细胞孵育在无细胞裂解液的培养液中进行重编程逆转化性诱导培养,获得来源于体细胞的多能干细胞。对诱导所得多能干细胞进行多能干细胞特性的鉴定。借助双重PCR性别鉴定的方法,分选出来源于雌性的有性生殖ESCs,孤雌胚胎干细胞(pESCs)和重构pESCs,叁种雌性胚胎干细胞分别通过冻融和离心的方法,获得叁种不同类型雌性ESCs(供体细胞)的无细胞裂解液,将此作为诱导剂重编程逆转化雄性MEFs(受体细胞),获得多能干细胞后,依据供体细胞和受体细胞的性别差异,采用双重PCR性别鉴定的方法确定重编程所得多能干细胞集落的来源。最后以鸡成纤维细胞作为重编程的受体细胞,探讨小鼠ESCs裂解液进行种间体细胞重编程、逆转化鸡胚成纤维细胞形成多能干细胞的可行性,并通过核型分析鉴定其所得多能干细胞的来源。通过上述研究,旨在比较不同来源ESCs裂解液介导体细胞重编程逆转化为多能干细胞的可能性及其效率,筛选适宜的共孵育方式,验证重编程体系的可靠性,比较有性生殖ESCs和无性生殖pESCs裂解液的作用效果,进一步研究父本基因缺失情况下对体细胞重编程逆转化效率的作用和对异种动物体细胞诱导形成多能干细胞的可能性。这项研究结果将为今后进一步探索ESCs和pESCs裂解液中重编程有效成分的筛选、鉴定和物种间多能干细胞的研究奠定基础。研究结果如下：1.用于分离小鼠ESCs(?)勺叁种囊胚有效生成途径研究1.1小鼠体内受精囊胚内细胞团(ICM)集落获取的条件优化本研究首先通过比较不同胎龄MEFs的生长状况和连续传代过程中细胞的生长情况,研究影响MEFs分离和培养效率的因素,旨在为早期胚胎共培养体系选择更加有效的MEFs的分离培养体系,用于MEFs饲养层的制备、ESCs的分离培养和被诱导受体细胞的筛查处理。然后,采集3.5d、4d和4.5d胎龄的胚胎,分别移入DMEM培养液、DMEM+白血病抑制因子(LIF)培养液和包含有MEFs贴壁生长细胞的共培养体系中进行体外培养,比较叁种培养体系中ICM孵出的时间、孵化囊胚贴壁比率和ICM集落形成比率,旨在筛选获取优质ICM集落的实验方法,为ESCs(?)勺分离培养奠定基础。结果表明：采用12.5-14.5d胎龄的小鼠胎儿分禺MEFs,传代培养后选取第3代MEFs制备饲养层,采集4d的小鼠囊胚置于其MEFs饲养层的共培养体系中,经体外培养3-4d,可以获取优质的ICM,这为体内受精囊胚来源ESCs的分离培养奠定了基础。1.2小鼠杂合二倍体孤雌囊胚生成途径的优化本研究采用5种化学激活方法即乙醇、乙醇+6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、乙醇+6-DMAP+细胞松弛素B (CB)、SrCl2、SrCl2+CB处理小鼠成熟卵母细胞,通过观察激活卵母细胞第二极体排出情况和核型分析,探讨不同激活方法所得激活卵母细胞染色体倍性的倾向类型,比较不同染色体倍性激活卵母细胞的体外发育能力,筛选有利于形成杂合二倍体孤雌囊胚的激活方法。结果表明：在含有10%乙醇培养液中激活卵母细胞5min的基础上,添加6-DMAP有利于抑制第二极体的排出,促进双原核(2PN)杂合二倍体孤雌胚胎的形成,获取更高的过二细胞阻滞率和桑葚胚/囊胚发育率；采用含有10mM SrCl2和CB处理卵母细胞4h,也能够获取较多的双原核(2PN)杂合二倍体和较高的桑葚胚/囊胚发育率,因此,以上两种孤雌激活方法适宜用于获取小鼠杂合二倍体孤雌囊胚。1.3人工重组异期卵母细胞核二倍体孤雌囊胚(含有速激核成熟新生小鼠生长初期卵母细胞和M Ⅱ期卵母细胞基因组的二倍体孤雌胚胎)的构建本研究分别研究了CB对生发泡(GV)期卵母细胞去核效果的影响、去除成年小鼠MⅠ期卵母细胞GV的方法选择、新生小鼠生长初期卵母细胞与去核GV期卵母细胞黏合体系的筛选、电融合条件选择以及重构胚化学激活方法的筛选等,旨在构建含有速激核成熟新生小鼠生长初期卵母细胞和MⅡ期卵母细胞基因组的二倍体孤雌胚胎,用于ESCs的分离。结果表明：预先采用10μg/mL CB溶液处理GV期卵母细胞,0.5%链霉蛋白酶去除GV期卵母细胞的透明带,显微操作仪上去除生发泡,将去除生发泡的GV期卵母细胞与新生小鼠生长初期卵母细胞移入自制凹窝内进行黏合,选择1.5KV/cm-2.0KV/cm的电场强度、40μS的脉冲宽度对黏合细胞进行电击,发生电融合和电激活,获得排出了第一极体的速激核成熟重构卵母细胞。利用显微操作仪将重构卵母细胞的核区移植到去除第一极体的MⅡ期成熟卵母细胞的透明带下,通过电融合使两者发生融合,形成含有两个MⅡ期卵母细胞核的重构卵细胞,再经过对其进行7%乙醇(5min)联合2.5mmol/L6-DMAP (4h)(?)勺激活后用于体外培养,可以构建出含有速激核成熟新生小鼠生长初期卵母细胞和MⅡ期卵母细胞基因组的二倍体孤雌胚胎。2.小鼠ESCs、pESCs和重构pESCs(?)勺分离、培养与鉴定2.1小鼠体内受精囊胚ESCs的分离、培养与鉴定本研究采集13.5d胎龄的胎儿分离MEFs,选取第3代MEFs制备饲养层；分别采用全胚法和免疫外科法从4d胚龄的囊胚中获取ICM,将ICM小团块移到饲养层上进行增殖培养,观察集落形态,并对细胞集落进行多能性鉴定。结果表明：采用全胚法和免疫外科法均能分离得到小鼠ESCs集落,其集落形成率差异不显着(30.26±2.77%vs32.92±4.37%,P>0.05)。两种方法所得ESCs集落具有典型的ESCs形态特征,AKP染色阳性,ESCs的染色体为二倍体,具有正常核型,Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,RT-PCR检测表明ESCs表达多能性基因：Oct-4和Sox-2, RT-PCR检测显示EB中叁个胚层的标记基因(Fgf-5、Bra T和Afp)均为阳性。2.2昆明小鼠孤雌囊胚来源pESCs的分离、培养与鉴定鉴于孤雌囊胚于体外培养时间过长,胚胎难以突破透明带引起囊胚孵化率和贴壁率降低的情况,本研究选用免疫外科法分离单倍体pESCs(源自SrCl2激活卵母细胞4h所得囊胚)和二倍体pESCs(源自10mM SrCl2+5μg/mL CB激活卵母细胞4h所得囊胚),并对所得细胞进行多能性鉴定,旨在探讨孤雌囊胚染色体倍性对pESCs分离和培养效率的影响,筛选适宜倍性的孤雌囊胚获取pESCs。(?)吉果表明：本研究所得到的pESCs集落具有与体内受精囊胚来源ESCs类似的多能性鉴定效果。从二倍体孤雌囊胚分离所得pESCs的集落形成率显着高于单倍体孤雌囊胚处理组(13.54±4.43%vs7.17±4.45%,P<0.05),宜选择有利于提高二倍体孤雌囊胚形成率的激活方法进行pESCs的分离。2.3异期二倍染色体重构胚胎来源pESCs的分离、培养与鉴定本研究通过构建包含有新生小鼠生长初期卵母细胞和MⅡ期卵母细胞的二倍染色体重构核型孤雌胚胎,经体外培养获得囊胚,采用全胚法分离pESCs,并对所得重构pESCs进行多能性鉴定。结果表明：将融合后发育至桑葚胚期和囊胚期的180枚胚胎转移到MEFs饲养层上,48h后从透明带中孵出并贴壁于饲养层上,96h后ICM长出并开始增殖,5d后ICM增殖成柱状,挑出消化离散成细胞小团块后,5d后可见形成了26个pESCs集落,其集落形成率为14.43±4.36%。所得集落具有与体内受精囊胚来源ESCs类似的多能性鉴定效果。3.应用小鼠ESCs裂解液重编程逆转化MEFs为多能干细胞的研究3.1不同浓度SLO对MEFs生长状态的影响本试验采用不同浓度SLO处理MEFs,通过比较SLO处理下MEFs的细胞密度、存活率和贴壁率,并绘制适宜浓度SLO处理后MEFs的生长曲线,研究不同浓度SLO对MEFs生长状态的影响,探讨SLO对体细胞的损伤是否具有剂量依赖性,以便筛选适宜浓度的SLO用于重编程体细胞的渗透化处理。结果表明：25USLO处理组的细胞密度和经CaCl2封膜后继续培养的细胞贴壁率分别与10U SLO处理组之间差异不显着(p>0.05),分别极显着地高于50U和100U SLO处理组(p<0.01)。第3代MEFs经25USLO渗透化处理后细胞仍具有正常分裂增殖的生长模式,说明该浓度的SLO对MEFs的分裂增殖影响较小。因此,宜选用25U SLO对重编程MEFs进行渗透化处理。3.2昆明小鼠ESCs裂解液的制备本研究比较了两种机械性裂解法即超声波处理法和液氮反复冻融法对ESCs裂解液制备效果的影响,并对所得裂解液进行体外培养试验和加入未经SLO渗透化处理的MEFs后的Oct-4免疫细胞化学染色,尽可能地排除ESCs完整细胞或细胞碎片残留等造成裂解液诱导体细胞重编程的假阳性,旨在探讨适宜的ESCs裂解方法,以获得用于体细胞重编程的高效ESCs裂解液。结果表明：液氮反复冻融7次可使ESCs细胞绝大部分发生裂解,获得的总蛋白质浓度显着高于超声波裂解细胞处理组(35.6mg/mL vs14.3mg/mL)。裂解液经体外培养后未见MEFs饲养层上生长有ESCs集落,AKP染色也未见红棕色细胞,Oct-4免疫细胞化学染色MEFs为阴性反应。因此,宜选择液氮反复冻融7次的方法制备用于体细胞重编程的ESCs裂解液。3.3小鼠ESCs裂解液与MEFs共孵育体系的研究本研究首先探讨了供、受体细胞的性别属性对ESCs裂解液诱导体细胞重编程效率的影响,结果表明供、受体细胞性别对ESCs裂解液诱导MEFs重编程所得多能干细胞集落数量无显着差异。然后,比较了叁种不同来源囊胚分离所得雌性ESCs裂解液重编程雄性MEFs或经过TSA和5-aza-dC预处理的雄性MEFs为多能干细胞的效率,以雄性MEFs与其自身裂解液共孵育和未经裂解液处理的雄性MEFs作为对照组,并对所得多能干细胞进行鉴定,旨在探讨适宜的裂解液诱导体细胞重编程体系。结果表明：体内受精囊胚来源并经双重PCR性别鉴定为雌性的ESCs裂解液、孤雌囊胚ESCs裂解液和重构囊胚来源ESCs裂解液均能够重编程雄性MEFs为多能干细胞,这些多能干细胞集落具有与体内受精囊胚来源ESCs类似的多能性鉴定指标表现。在重编程所得多能干细胞集落数量上,体内受精囊胚来源雌性ESCs裂解液处理组(64.33±3.7个、80.67±2.08个)>重构囊胚来源ESCs裂解液处理组(45.00±4.36个、53.67±3.06个)>孤雌囊胚处理组(35.67±2.52个47.67±4.16个)；TSA和5-Aza-dC的预处理有助于促进雄性MEFs的重编程,但是,在没有ESCs裂解液的诱导作用下,仅采用TSA和5-Aza-dC预处理雄性MEFs并不能获得多能干细胞集落；无ESCs裂解液参与的单纯重编程操作过程和雄性的MEFs裂解液并不能使雄性MEFs发生重编程,因此,促使雄性MEFs发生重编程的物质来源于ESCs的裂解液。4. ESCs裂解液诱导MEFs重编程所得多能干细胞集落的来源鉴定采用双重PCR性别鉴定方法对体内受精囊胚来源经性别鉴定为雌性ESCs裂解液、孤雌囊胚来源pESCs裂解液和重构孤雌囊胚来源ESCs裂解液诱导雄性MEFs重编程所得到的多能干细胞进行性别鉴定,鉴定所得多能干细胞的来源,判定细胞提取物诱导的重编程体系的可靠性。结果表明：体内受精囊胚来源经性别鉴定为雌性ESCs的裂解液、孤雌囊胚来源pESCs裂解液和重构孤雌囊胚来源的ESCs裂解液均能够诱导雄性MEFs重编程为多能干细胞,所得多能干细胞的基因组DNA中具有250bp的Sry基因序列片段和339bp的ZFX基因序列片段,为雄性细胞。因此,pESCs裂解液重编程所得具有多能性特征的细胞是源自于雄性MEFs,它们所表现出的多能性检测指标的阳性反应并不是由于裂解液制备过程中的ESCs污染所致。5. ESCs裂解液诱导种间体细胞重编程的可行性研究本研究以鸡胚成纤维细胞作为重编程的受体细胞,采用小鼠体内受精囊胚来源ESCs裂解液与其进行共孵育,通过形态学观察,研究其对鸡胚成纤维细胞的逆转化效果,对所获得干细胞集落进行多能性检测,旨在探讨小鼠ESCs裂解液作用于异种体细胞后,使其重编程逆转化为多潜能干细胞的可行性。结果表明：与小鼠ESCs裂解液共孵育的鸡胚成纤维细胞均变为圆形细胞,未见梭形的贴壁细胞,形成了42.33±4.5个细胞集落。细胞集落经AKP染色和Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学染色,均呈阳性反应。表明小鼠ESCs裂解液重编程鸡胚成纤维细胞后,所获得的细胞集落表现出一定的多能干细胞特性,经核型分析表明这些细胞来源于鸡胚成纤维细胞。单独的重编程操作过程和与鸡胚成纤维细胞裂解液共孵育,均无法将鸡胚成纤维细胞重编程为具有ESCs多能性特征的干细胞,说明参与重编程鸡胚成纤维细胞的物质来源于小鼠ESCs的裂解液。结果表明,ESCs裂解液诱导体细胞重编程逆转化为多能干细胞的作用也能够在小鼠和鸡的种间发生。总结论：通过共孵育(或者共培养)途径应用ESCs的无细胞裂解液作为诱导剂,能够在较短的时间内(处理后1天内呈现细胞形态学显着变化成为圆形细胞；4天内形成边界清晰的细胞集落；共孵育后第3天细胞集落表现AKP活性,第7天细胞表达Oct-4、Sox-2和Nanog基因)逆转化经过SLO、TSA和5-Aza-dC预处理的MEFs成为多能干细胞；应用这个逆转化体细胞成为多能干细胞的细胞培养体系,使用同样的预处理体细胞的方法,也能够诱导异种鸡胚成纤维细胞成为多能干细胞。
慈书峰[5]2008年在《利用小鼠MI期卵母细胞获取孤雌胚胎的研究》文中研究指明目前对孤雌发育的研究多使用MⅡ期卵母细胞,得到的孤雌胚胎多为单倍体。利用细胞松弛素D(CD)抑制小鼠MⅠ期卵母细胞排出第一极体可以保持染色体组的倍性。尽管由于基因印记的缘故,这样做并不能使孤雌胚胎发育到期,但是却可以给孤雌胚胎细胞提供一个更加丰富的遗传背景。国外研究表明,从这样的孤雌囊胚中可以分离得到与卵母细胞供体的MHC相匹配的孤雌干细胞。本研究从激活方法和培养液的选择方面对利用CD处理获取二倍体孤雌胚胎进行了初步研究,并且与MⅡ期卵母细胞孤雌胚的发育能力进行了比较。同时,对利用纺锤体移植的技术路线获取二倍体孤雌胚胎进行了探索性的研究。1不同激活方法对小鼠MⅡ期卵母细胞孤雌激活效果比较。实验采用5种方法对经CD处理的MⅠ期卵母细胞进行孤雌激活。A23187+6-DMAP的卵裂率和囊胚率分别为69.56%和28.86%,极显着高于乙醇、SrCl_2、A23187和电激活的卵裂率和囊胚率(p＜0.01)。2不同培养液对小鼠MⅠ期卵母细胞孤雌发育的影响。实验采用4种培养液mCZB、KSOM、M16和mM16,对经CD处理的MⅠ期卵母细胞的激活卵进行培养。4个处理的2细胞率没有显着差异(79.39%、77.54%、77.47%、78.02%,p＞0.05)。mM16的4～8细胞率极显着高于其它3种培养液(68.50%vs.58.63%、48.39%、36.86%,p＜0.01)。囊胚率也以mM16最高(43.37%vs.26.85%、16.13%、7.96%,p＜0.01)。3 MⅠ期卵母细胞与MⅡ期卵母细胞孤雌发育能力的比较。实验采用A23187+6-DMAP联合处理的方法对卵母细胞进行孤雌激活,激活卵用mM16培养。经CD处理的MⅠ期卵母细胞发育到囊胚的比率极显着高于MⅡ期卵母细胞(46.25%vs.34.37%,p＜0.01)。但是两者之间的激活率无显着性差异(90.13%vs.87.64%,p＞0.05)。4不同电场强度对重构卵融合的影响。通过核移植手段将MⅠ期纺锤体移入去核MⅡ期卵母细胞的透明带下构成重构卵,选用0.3 mol/L甘露醇,含0.1 mmol/L MgCl_2、0.05 mmol/LCaCl_2、0.05%的BSA和0.5 mmol/L HEPES,作为电融合介质,固定脉冲宽度为40μs,依次采用4种电场强度(1.0 KV/cm,1.5 KV/cm,2.0 KV/cm,2.5 KV/cm)对重构卵进行融合处理。其中,1.5 KV/cm与2.0 KV/cm场强的融合率显着高于2.5 KV/cm场强(15.09%、14.92%vs.6.34%,p＜0.05),极显着高于1.0 KV/cm场强(15.09%、14.92%vs.4.61%,p＜0.01),但是两者之间无显着差异(15.09%vs.14.92%,p＞0.05)。5不同脉冲宽度对重构卵融合的影响。通过核移植手段将MⅠ期纺锤体移入去核MⅡ期卵母细胞的透明带下构成重构卵,选用0.3 mol/L甘露醇,含0.1 mmol/L MgCl_2、0.05 mmol/LCaCl_2、0.05%的BSA和0.5 mmol/L HEPES,作为电融合介质,固定电场强度为2.0 KV/cm,依次采用3种脉冲宽度(40μs,80μs,120μs)对重构卵进行融合处理。其中脉冲宽度为40μs和80μs时,融合率较高,但是两者之间无显着差异(15.73%vs.9.06%,p＞0.05)。6重构卵的激活与培养。选用0.3 mol/L甘露醇,含0.1 mmol/L MgCl_2、0.05 mmol/LCa Cl_2、0.05%的BSA和0.5 mmol/L HEPES,作为电融合介质,采用电场强度2.0 KV/cm,脉冲宽度40μs,对重构卵进行融合处理。重构卵的激活率为86.29%,2细胞率为61.78%,4～8细胞率为32.88%,囊胚率为4.17%。结论:(1)经CD处理的小鼠MⅠ期卵母细胞激活后能发育到囊胚阶段,并且其发育能力明显强于MⅡ期卵母细胞的孤雌胚。(2)乙醇、SrCl_2、A23187、电激活与A23187+6-DMAP五种激活方法中,以A23187+6-DMAP对经CD处理的小鼠MⅠ期卵母细胞的激活效果最好,激活后孤雌胚发育到囊胚的比率也最高。(3)mCZB、KSOM、M16和mM16四种培养液中,以mM16对小鼠MⅠ期孤雌胚的发育最为有利。(4)小鼠MⅠ期纺锤体移植的重构卵,在本实验室以1.5 KV/cm～2.0 KV/cm之间的电场强度和40μs的脉冲宽度进行融合的效果最好。(5)小鼠MⅠ期纺锤体与去核的MⅡ期卵母细胞融合后经激活处理,有一小部分能够发育到囊胚阶段。(6)利用CD处理小鼠MⅠ期卵母细胞,抑制第一极体的排出,再对其激活可以得到二倍体孤雌胚胎。通过纺锤体移植,再利用重构卵获取二倍体孤雌胚胎的方法效率太低,不实用。
武建中[6]2009年在《用于分离昆明小鼠治疗性胚胎干细胞的囊胚生成途径相关问题研究》文中认为随着干细胞技术的不断发展,能够用于人类再生医学的具有克服免疫排斥反应的治疗性胚胎干细胞逐渐成为人们研究的重点。通过体细胞核移植技术获得胚胎干细胞,因为具有与体细胞提供者相同的基因型被认为是克服免疫排斥反应的最佳途径,然而,体细胞克隆胚胎由于其重构胚核编程不完全导致其发育率较低,进而影响获取干细胞的成功率;哺乳动物MⅠ期和MⅡ期卵母细胞孤雌激活胚胎与有性生殖胚胎相比,具有与提供卵母细胞的母体相同的组织相容性复合物,由此获得的干细胞能够克服免疫排斥反应。但是来源于MⅡ期卵母细胞孤雌激活胚胎缺乏父源基因印迹作用,其发育潜能受到限制,从而导致其分离获得的干细胞的分化潜能也有可能因此而受到限制:来源于抑制了第一极体排出的MⅠ期卵母细胞孤雌激活胚胎,因为含双倍杂合体基因组核型,能够获得类似于体细胞克隆胚胎的胚胎细胞核型,可在一定程度提高孤雌胚胎的发育潜力并使其分离得到的胚胎干细胞具有正常的细胞核型以用于临床治疗。但是,体细胞克隆胚胎和孤雌胚胎途径都需要囊胚做为胚胎干细胞分离的材料。本试验研究了以上体细胞核移植胚胎和MⅡ期、MⅠ期卵母细胞孤雌激活胚胎叁种途径来源囊胚生成的可能性和方法,并研究了影响这叁种囊胚发育率的因素,旨在探索昆明小鼠治疗性胚胎干细胞获取的新途径。本研究采用昆明小鼠做为试验动物,针对体细胞克隆胚胎囊胚发育率低,获取其胚胎干细胞困难的问题,选择合适浓度的组蛋白去乙酰化抑制剂(TSA)分别作用于体细胞核移植重构胚的融合和激活阶段,比较了TSA在不同阶段对重构胚发育的影响。旨在通过研究供核体细胞在去核卵母细胞内的核基因重塑修复与重编程过程,分析和探索提高体细胞克隆胚胎囊胚发育率的有效方法。针对孤雌胚胎干细胞获取新途径中,有性生殖胚胎与无性生殖孤雌胚胎嵌合发育,能够在早期胚胎细胞间通过旁分泌与自分泌因素和晚期胚胎发育阶段通过胚胎诱导因素的作用下,促进孤雌胚发育的理论可行性,本研究通过性别鉴定的方法选择雄性有性生殖胚胎与无性生殖MⅡ期卵母细胞孤雌激活胚胎嵌合发育,并可以通过性别鉴定的方法将这种嵌合囊胚分离得到的内细胞团细胞进行来源标记,旨在通过性别鉴定的方法建立有性生殖胚胎辅助与其嵌合发育的无性生殖孤雌胚胎生成干细胞和有效分选分离这种干细胞的新途径。针对孤雌胚胎干细胞获取新途径中,通过抑制体外培养过程中MⅠ期卵母细胞第一极体的排出,获取含双倍体基因组核型的成熟卵母细胞,孤雌激活这种卵母细胞能够获得类似于体细胞克隆胚胎核型的原理,研究MⅠ期卵母细胞双倍体基因组核型获取途径,探讨了小鼠MⅡ期卵母细胞孤雌激活体系是否能成功应用于MⅠ期卵母细胞的孤雌激活,并对不同体外胚胎发育培养液对这种MⅠ期孤雌胚胎的体外培养效果进行了观察,旨在研究MⅠ期卵母细胞双倍体基因组核型人工激活发育为孤雌胚胎的可能性及其早期胚胎体外培养发育的潜力,探索治疗性克隆胚胎孤雌干细胞生成的新途径。试验结果如下:1组蛋白去乙酰化抑制剂(TSA)对体细胞核移植重构胚囊胚生产效果的影响依据体细胞克隆胚胎囊胚生产效率低的原因与供体核染色质和受体卵质之间互作异常、影响体细胞染色质解聚和激活表达程序出现紊乱有关,本试验利用组蛋白去乙酰化酶特异性抑制剂TSA(trychostatin A)能够抑制重构胚早期组蛋白去乙酰化的作用特点,对重构胚发育早期的融合阶段和激活阶段分别或共同进行添加TSA处理,观察其对重构胚发育状况的影响,以揭示组蛋白乙酰化/去乙酰化作用在核内染色质重编程过程中所发挥的作用,旨在探索能够提高体细胞核移植重构胚囊胚生产效率的新途径。结果显示:试验1中处理组3添加50nmol/L TSA作用于核移植重构胚融合和激活阶段(融合3h、激活6h)可以有效抑制组蛋白去乙酰化酶的作用,促进组蛋白的乙酰化,从而达到明显提高重构胚发育的效果,50 nmol/L的TSA浓度处理后的体细胞核移植重构胚的囊胚发育率(14.00%)要显着高于处理组1(0.5nmol/L,5.36%)、处理组2(5 nmol/L,6.12%)、处理组4(500 nmol/L,7.69%)和对照组(0 nmol/L,3.92%)(P＜0.05);试验2中仅在融合阶段添加TSA抑制组蛋白去乙酰化作用虽然在一定程度能够提高重构胚的囊胚发育率(5.56%),但与未添加TSA的处理组1(2.63%)相比差异不显着(P＞0.05),并不能显着改善重构胚的发育状况;试验3中在融合和激活阶段均添加TSA的处理组3和仅在激活阶段添加TSA的处理组2的囊胚发育率(14.71%Vs 12.12%)之间差异不显着,但两者与未添加TSA的对照组的囊胚发育率(6.45%)相比均差异显着(P＜0.05),可见TSA在激活阶段对供体核染色质组蛋白去乙酰化作用的抑制明显提高了体细胞核移植重构胚的囊胚发育效率;试验4中在融合阶段添加TSA处理时间不变的前提下将TSA在激活阶段的处理时间从6 h延长至9 h,虽然在一定程度上提高了重构胚的囊胚发育率(15.56%),但与未延长激活时间的处理组1(14.29%)相比囊胚率并没有得到明显的提高,两者之间差异不显着(P＞0.05),说明延长激活阶段TSA处理时间并不能进一步提高重构胚的发育潜力。2昆白小鼠孤雌胚胎与雄性胚胎嵌合发育研究本研究对小鼠早期胚胎进行性别鉴定,获得雄性胚胎后与孤雌激活胚胎进行嵌合培养,其目的是为了建立一种新的异性胚胎嵌合培养模式,在便于通过分子生物学方法对胚胎不同来源进行性别检测的基础上,研究两种不同类型胚胎细胞之间在嵌合发育过程中的相互影响,为从嵌合发育胚胎中分析标记来源于孤雌胚胎的干细胞研究过程奠定基础。本研究初步建立了构建孤雌激活胚胎与雄性胚胎嵌合胚的方法与程序,对该过程中的几个影响因素做了初步的探讨。结果显示:自主设计的两对性别鉴定引物特异性较强,能够分别扩增出公鼠所特有的250 bp Sry基因片段和公母小鼠共有的399 bp的ZFX基因片段;经过优化的双重PCR体系能够在取2个卵裂球作为PCR反应模板的前提下比较准确的判定小鼠早期胚胎性别:在比较了各种去带液的去带效果及对胚胎的后续发育潜力的影响后发现,在0.5%链蛋白酶液中处理5 min后,胚胎能获得较高的裸胚率(93.33%)和囊胚发育率(76.67%);应用前面试验建立的小鼠早期胚胎性别鉴定体系鉴定的有性生殖雄性8细胞胚胎与孤雌生殖8细胞胚胎在自制凹窝培养体系的胚胎聚合率(73.91%)与PHA微滴培养体系的胚胎聚合率(62.50%)相比差异显着(P＜0.05)。聚合胚胎在自制凹窝培养体系的囊胚发育率(47.82%)虽然高于PHA微滴培养体系(41.67%),但两种体系之间差异不显着(P＞0.05),因此自制凹窝培养体系可以替代PHA微滴培养体系用于胚胎嵌合;通过免疫法对10枚嵌合囊胚内细胞团进行了单细胞分离后有7枚嵌合囊胚的内细胞团单细胞能够在体外增殖。平均每个嵌合囊胚可得到1.40个类ES细胞集落,经对其细胞进行性别鉴定检测后发现,孤雌胚胎来源集落与雄性胚胎来源集落的比例为5:9。3利用小鼠MⅠ期卵母细胞获取孤雌胚胎的研究依据利用细胞松弛素D(CD)能够抑制小鼠MⅠ期卵母细胞排出第一极体,而保持染色体组的倍性,使染色体组类似于体细胞,通过适当的激活方法可使其发育为杂合二倍体孤雌囊胚,为获得与卵母细胞供体组织相容性抗原更加匹配的孤雌生殖胚胎干细胞奠定基础。本研究从激活方法和培养液的选择两个方面对利用CD处理获取二倍体孤雌胚胎进行了初步研究,并且与MⅡ期卵母细胞孤雌胚的发育能力进行了比较。结果显示:在含有5μg/ml浓度CD的mCZB培养基中作用3h,能够成功抑制第一极体的排出;经过乙醇、SrCl_2、A23187、电激活与A23187+6-DMAP五种激活方法激活后胚胎均能发育到囊胚阶段;其中以A23187+6-DMAP激活效果最好(46.15%),激活后孤雌胚在mCZB培养液中发育到囊胚的比率也最高(19.23%);应用前面试验确定的最适激活方法处理后的MⅠ期孤雌胚胎分别在mCZB、KSOM、M16和mM16四种培养液中培养后发现,以mM16培养液中的MⅠ期孤雌囊胚发育率最高(16.67%);应用A23187+6-DMAP分别对MⅠ和MⅡ期卵母细胞激活后培养于mM16培养液中发现,MⅡ期卵母细胞的卵裂率显着高于MⅠ期卵母细胞(65.88%Vs46.15%,p＜0.05),但两者的囊胚发育率之间差异不显着(18.82%Vs 17.58%,p＞0.05)。以上叁个试验,观察探索了用于分离昆明小鼠治疗性胚胎干细胞的囊胚生成的新途径;综合对不同来源囊胚生成途径的关键问题进行了研究。研究结论如下:1.在昆白小鼠体细胞克隆胚胎的制作过程中,重构胚于激活阶段,在添加有50 nmol/LTSA的KSOM激活培养基中作用6 h,可以在最小程度伤害重构胚的情况下最大限度的实现对组蛋白去乙酰化酶的抑制,促进组蛋白的乙酰化,可以明显提高重构胚发育至囊胚的效率。2.双引物双重PCR法能够成功的对小鼠早期胚胎进行性别鉴定;应用该方法选择出的雄性胚胎与孤雌胚胎在自制凹窝培养体系中可成功发育至囊胚;同时应用这种性别鉴定方法,还成功的对嵌合囊胚内细胞团单细胞培养增殖的类ES细胞集落的来源进行了检测;从而成功建立了一种新的利用有性生殖胚胎辅助与其嵌合发育的无性生殖孤雌胚胎生成干细胞和有效分选分离这种干细胞的新的研究模型。3.昆白小鼠MⅠ期卵母细胞在CD处理后经A23187和6-DMAP激活后可成功获得二倍体孤雌胚胎并发育至囊胚;其囊胚发育率与MⅡ期卵母细胞孤雌激活胚胎相比差异不显着。
吴克良[7]2007年在《淋巴细胞核移植重构胚的构建及其CD分子表达的初步研究》文中研究指明在哺乳动物核移植研究中按照核供体细胞来源的不同可以分为两类：以胚胎卵裂球为核供体的胚胎细胞核移植和以各种体细胞为核供体的体细胞核移植。小鼠作为重要的试验模式动物在核移植研究中起着不可替代的作用。目前对于小鼠卵的显微操作方面也有许多，但大部分方法的实施需要借助于特殊的装置(如Piezoimpact装置、Spindle-View偏振光系统)或对卵的后期发育有明显副作用。为了能够找出一种既容易操作，又不需要特殊设备的核移植方法，本论文对以前的核移植方法进行了改进并用来构建重构胚。即首先以预先吸有细胞核或细胞的注射针在固定于持卵针上的卵母细胞透明带上穿刺两个孔，然后一边缓慢的将注射针回拔至卵周隙中，一边逐渐增加持卵针中的负压，直至极体与目标核质被完整的吸入持卵针中而完成去核，最后在不拔出注射针的情况下直接注射细胞核或完整细胞进而完成重构胚的构建。通过对重构胚去核效率和成活率的分析统计表明，用此方法可以在只有倒置显微镜和显微操作仪的条件下一次性快速的完成去核和注核，大大提高了细胞核移植的效率和重构胚成活率；更重要的是该方法操作简单，可以很快被新手掌握，易于在实际工作中推广应用。本论文还利用淋巴细胞作为供核细胞构建重构胚，在重构胚发育的特定时间段对供体细胞核在重构胚中所处的状态进行观察，并用CD分子单克隆抗体对重构胚表面CD分子以及供体细胞CD分子残留进行检测。结果表明移核重组淋巴细胞其基因组再程序化过程短于24小时，期间如果不能实现基因组的再程序化可造成重组细胞的死亡；在重组淋巴细胞基因组再程序化过程中，仍有淋巴细胞特定分化抗原的表达，但在其后的细胞分裂过程中此类抗原的基因表达被关闭。提示基因组在卵母细胞质特定成分的作用下启动再程序化的过程中存有基因转换表达的递进程序。当细胞核的生理时钟重新调回到它的胚胎初始状态时，即以特定的时空表达程序向胚胎发育的方向进行程序化表达。该论文为进一步研究供核细胞基因组再程序化的分子机制提供了必要的技术和初步理论平台，将有助于阐明核一质重组细胞的基因组编程规律及细胞定向分化的分子机制，并在当今生物医学领域中具有重要的实践意义。
王鸿[8]2002年在《胚胎干细胞的分离及克隆》文中研究说明胚胎干细胞技术和动物克隆技术是当今生物学和医学领域发展非常迅猛的两种高尖技术，它不仅对生物学和医学领域的一些基础理论的研究具有重要意义，而且具有十分广阔的应用前景。为了建立胚胎干细胞分离技术及了解其在同种和异种卵母细胞中的发育能力，首先从小鼠囊胚分离胚胎干细胞，并以它作为核供体，移植到同种不同品系去核的小鼠卵母细胞内，观察不同品系的卵母细胞对胚胎干细胞重构胚发育的影响。其次观察胚胎干细胞在异种(兔)卵母细胞内的发育情况，并与成纤维细胞作比较，对影响异种重构胚发育的因素也进行了分析。 联合Evans和Martin的方法，稍加改良来分离小鼠胚胎干细胞，把昆明白小鼠完整的囊胚直接种植在经丝裂霉素灭活的STO饲养层细胞上，在含有BRL条件培养基的ES细胞培养液中培养。共建立了2株小鼠胚胎干细胞系。胚胎干细胞培养超过了30代，经免疫组化染色后显示AKP和SSEA-1呈强阳性。经过核型分析证实，2株胚胎干细胞系均为XY型，染色体整二倍体的细胞所占的比例均超过了90％。将胚胎干细胞注射到C57BL／6J小鼠的囊胚腔内，移植后产生了一只WK2-胚胎干细胞的雄性嵌合体鼠，毛色嵌合率为15％左右，成熟后分别与C56BL／6J和昆明白雌鼠交配，均未得到来自ES细胞的后代。结果显示，用昆明白小鼠囊胚所建立的胚胎干细胞在体外长期培养时仍能保持未分化的状态，核型稳定，但还未证明其具有生殖系嵌合的能力。 在以胚胎干细胞为核供体，进行同种克隆时，胚胎干细胞的遗传内涵对重构胚的发育有很大影响。为了了解受体卵的遗传内涵是否对胚胎干细胞重构胚发育也会产生影响，分别以C57BL／6J和昆明白小鼠的MⅡ期去核卵为受体，构建胚胎干细胞重构胚。两种重构胚的融合率之间没有显着差异(P＞0.05)，C57BL／6J重构胚的卵裂率(60.5％)明显高于昆明白小鼠(33.7％)，但是前者只发育到4细胞期，而后者可以发育到桑椹期和囊胚期(2.3％)。可见，近交系C57BL／6J卵胞质不能支持昆明白小鼠胚胎干细胞核的长期发育。同时说明以不同遗传内涵的卵胞质作为受体，克隆胚胎的发育能力明显不同。 在胚胎干细胞异种克隆中，比较了激活重构胚的不同方法、不同代数胚胎干细胞以及不同类型的供核细胞对异种重构胚的影响。用二次电脉冲加6-DMAP联合激活或单独用二次电脉冲激活小鼠胚胎干细胞-兔卵母细胞异种重构卵时，联合激活组的卵裂率是86.2％，明显高于单用二次电脉冲组(64.2％，P＜0.05)，囊胚形成率分别为17.0％和13.4％，两组间没有显着差异(P＞0.05)。用体外培养14代和24代的小鼠胚胎干细胞构建的异种重构卵的卵裂率分别是88.5％和82.1％(P＞0.05)，囊胚发育率分别是16.7％和15.4％(P＞0.05)。通过比较小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎成纤维细胞和成年小鼠外耳成纤维细胞为核 大连理工大学博士学位论文供体所克隆的异种克隆胚在体外的发育情况，发现胚胎干细胞的异种重构胚在体外发育到囊胚的比例为 16．l％，明显高于用成年小鼠成纤维细胞（0－3．1％，WO．05）和小鼠胚胎成纤维细胞（2．1－3．7W，P（．05）。重构囊胚细胞经染色体分析，证实其染色体来源于小鼠胚胎干细胞。以上结果显示，6－DMAP能增加胚胎干细胞异种重构卵的卵裂率，对重构卵囊胚的发育率影响不大；高培养代数和低培养代数的胚胎干细胞用于异种核移植不影响异种重构卵的卵裂率和囊胚发育率；用胚胎干细胞作为供核细胞；比体细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚更容易进行重编程，并且胚胎于细胞指导异种克隆胚胎正常发育的能力强于体细胞。
张东[9]2011年在《转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究》文中研究表明fat-1基因编码ω-3 PUFAs脱氢酶,可以将PUFAs从ω-6转化为ω-3形式。本研究目的是通过动物转基因技术将fat-1转入绵羊的基因组,再利用动物克隆技术创造能产生ω-3 PUFAs的转基因绵羊,从而培育含ω-3 PUFAs丰富的转基因肉羊新材料。以我区绵羊为对象,摸索了绵羊克隆胚的构建和胚胎移植体系;建立雄性绵羊胎儿的皮肤成纤维细胞系;克隆了秀丽隐杆线虫的fat-1基因,构建目的基因表达载体;再将其转染到绵羊成纤维细胞基因组中,经G418筛选,PCR鉴定后选择阳性细胞建立转基因细胞系;通过体细胞克隆动物技术构建并生产转基因克隆胚并移植,待移植后代出生后鉴定并检测其肌肉中ω-6和ω-3 PUFAs的相对含量及比值;以获得转基因的具有保健功能的肉羊新品种。1.绵羊体细胞克隆体系的优化本实验主要是对体细胞克隆胚移植胚龄的摸索。采用组织块种植法分离培养了叁种雌性成年绵羊耳皮肤成纤维细胞系,分叁个阶段进行绵羊体细胞克隆体系的优化。第一阶段构建了来源于1号细胞的重构胚272枚,体外发育到桑椹胚期移植入17只受体羊中,有一只妊娠,妊娠率为5.88%,产羔羊1只,经鉴定为克隆羊。第二阶段构建了来源于2号细胞的重构胚683枚,分别在胚胎发育的不同时期进行了胚胎移植,共移植了35只受体羊。结果显示,在3只移入的胚龄是1-细胞期胚胎的羊中,有一只妊娠并产羔1只,经鉴定为克隆羊。第叁阶段构建了来源于3号细胞的重构胚197枚,在1-细胞期阶段全部移入了11只受体羊中,结果有两只羊妊娠,妊娠率为18.18%,生产了3只克隆羊,产羔率为27.27%。有效地的重复了第二阶段实验。待克隆羔羊性成熟和体成熟后对其进行了自然交配,成年体细胞克隆羊正常顺产2胎,均是双胞胎。表明获得的克隆羊具有正常的生殖和哺育后代的能力,进一步证明,本实验室建立了相对稳定的的体细胞克隆绵羊技术体系。2.转基因体细胞克隆体系的建立采用组织块种植法分离纯化了约40日龄绵羊胎儿成纤维细胞;克隆了秀丽隐杆线虫fat-1基因,同时对其进行了密码子的优化与合成,构建了pTFK-c和pTFK-o两个真核表达载体。pTFK-o转染绵羊胎儿成纤维细胞,经G418压力筛选后进行转基因细胞的鉴定。结果表明获得的7个细胞克隆中有5个细胞系的基因组中整合有目的基因,对获得的转基因细胞进行染色体数目分析,其核型正常率为69.77% (2n=54),符合用于转基因克隆的要求。以筛选到的7号转fat-1基因绵羊胎儿成纤维细胞系为核供体,绵羊去核卵母细胞胞质为核受体生产转基因克隆胚。采用抽吸法共回收卵母细胞4881枚,成熟培养18h成熟率为72.87%。实验共进行去核操作绵羊卵母细胞3557枚,用于融合的卵数是3305枚,共融合3040枚,融合率为91.39%。共分叁组移植了处于1-细胞期的2909枚胚胎到230只羊体内,1组移植了146只受体羊,妊娠5只,妊娠率为3.42%,产羔5只,产羔率为3.42%;2组移植了60只受体羊,妊娠18只,妊娠率为30%,产羔19只,产羔率为31.67%;3组移植了24只羊,妊娠5只,妊娠率为20.83%,产羔6只,产羔率为25%。后2组实验结果进一步优化了体细胞克隆技术体系。3.转fat-1基因克隆绵羊的出生与鉴定通过实验共产羔30只,其中19只存活。对获得的30只中的29只转基因克隆羔羊进行基因组水平检测,结果显示有27只羔羊基因组中含有目的基因。克隆羊肌肉组织中ω-6和ω-3PUFAs的相对含量检测结果显示,在检测的23只羊中有18只羊都表达了有活性的脂肪酸脱氢酶,其ω-6/ω-3 PUFAs比值都有不同程度的降低,平均值为16.45,其ω-3 PUFAs的平均值为0.194,和对照公羊平均值0.147相比提高了31.97%,有效的改善了绵羊体内ω-6和ω-3 PUFAs的相对比例和含量。
王怡[10]2006年在《小鼠体细胞核移植中不同去核方法及融合和培养条件对重构胚胎发育的影响》文中研究指明小鼠体细胞核移植技术不仅可以为研究动物胚胎发育、细胞和组织分化、基因表达调控、核质相互作用提供技术平台，而且在建立人类疾病动物模型方面也有着重要的作用和意义。本实验以B_6D_2F_1品系小鼠的胎儿成纤维细胞和卵母细胞作为核、质供体，通过不同去核方法、融合方案、体外培养条件以及PEG／DMSO和TSA等试剂的应用，对小鼠体细胞核移植重构卵去移核后的存活情况、电融合情况和激活后重构胚的着床前发育情况进行比较，筛选合适的实验条件，为本实验室小鼠体细胞核移植技术的建立和应用打下基础。结果如下：一、持卵方法、去核针口径对小鼠卵母细胞去移核效果的影响：(1)以改进的双持卵针法去移核后重构卵的存活率(82.05％)极显着高于传统的单持卵针法(22.35％)(P＜0.01)；(2)以14～16μm内径组去核针去移核后重构卵存活率为80.77％，显着高于10～12μm组和20～22μm组(P＜0.05)。二、PEG／DMSO对供核细胞的处理、不同的融合液、融合电参数和细胞代次对融合率的影响：(1)以PEG／DMSO对供核细胞预处理5分钟后所得融合率显着高于同条件下未处理组(51.11％vs 25.64％)(P＜0.05)；(2)融合液中含0.1 g／L PVA的各组融合率均高于无PVA组；重构卵在甘露醇浓度为0.32mol／L的融合液中的融合率(48.21％)高于其他甘露醇浓度组的融合率(27.78％，41.67％和30.11％)；(3)针状电极融合槽的融合率(42.31％，43.13％)高于其他参数条件相同时平行丝状电极融合槽组(30.43％，33.33％)，其中又以在2000V／cm，20μs，2个脉冲时，交流电预处理30秒组最高(43.13％)；(4)供核细胞传代一次后融合率随着传代次数的增加而下降。叁、TSA和培养系统对重构胚体外发育率的影响：(1)组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatin A能够提高重构胚的发育率；(2)不同的体外培养系统(CZBG，KSOM，KSOM+Vero饲养层细胞)中，以KSOM体系培养重构胚时卵裂率(39.06％)高于其它组(34.14％，35.90％)，而KSOM+Vero饲养层培养体系中桑葚胚发育率(15.38％)高于其它组(8.54％，12.50％)。实验结果表明，本实验室采用双持卵针法，内径14～16μm去核针可以获得较高的去移核后重构卵存活率；使用针状电极融合槽，当融合液中甘露醇浓度为0.32mol／L，并添加PVA时，在2000V／cm，20μs，2个脉冲，交流电预处理30s条件下可以得到相对较高的重构卵融合率；PEG／DMSO对供核细胞的预处理显着提高了融合率；TSA和vero饲养层细胞可以促进重构胚的桑葚期／囊胚期发育率。
参考文献：
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[2]. 利用RNA干扰和乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究[D]. 陈建文. 安徽农业大学. 2012
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[4]. 应用小鼠胚胎干细胞（ESCs）裂解液逆转化胎儿成纤维细胞（MEFs）为诱导性多能干细胞（iPSCs）的研究[D]. 肖雄. 西南大学. 2012
[5]. 利用小鼠MI期卵母细胞获取孤雌胚胎的研究[D]. 慈书峰. 西南大学. 2008
[6]. 用于分离昆明小鼠治疗性胚胎干细胞的囊胚生成途径相关问题研究[D]. 武建中. 西南大学. 2009
[7]. 淋巴细胞核移植重构胚的构建及其CD分子表达的初步研究[D]. 吴克良. 山东大学. 2007
[8]. 胚胎干细胞的分离及克隆[D]. 王鸿. 大连理工大学. 2002
[9]. 转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究[D]. 张东. 内蒙古农业大学. 2011
[10]. 小鼠体细胞核移植中不同去核方法及融合和培养条件对重构胚胎发育的影响[D]. 王怡. 扬州大学. 2006