赵增芹[1]2004年在《海带中L-褐藻糖的测定及其制备》文中指出海带（Laminaria japonica）是褐藻类海藻中的一种大型经济海藻。以海带为原料生产具有很高经济价值的 L-褐藻糖，提高了我国海带综合工业的高附加值，促进了我国海藻工业及养殖业的进一步发展。 L-褐藻糖（L-fucose ）又名 L-岩藻糖、6-脱氧半乳糖，是一种以 L 型异构体形态天然存在的稀有糖类。L-褐藻糖几乎存在于所有褐藻中，只是含量稍有差异。在生物体内，L－褐藻糖主要存在于大多糖蛋白和糖酯等糖复合物糖苷链的非还原端及分子量较大的糖酯中。在海带中，主要以褐藻多糖硫酸酯的形式存在。褐藻多糖硫酸酯是一种水溶性多糖，存在于褐藻的胞间组织中，分子量大且结构复杂。其组成因褐藻的种类而有所不同，但其主要成分都是 L-褐藻糖-4-硫酸酯。 国内外大量研究发现 L-褐藻糖具有多种生物活性，可抑制白血细胞形成（即消炎作用）、治疗风湿性关节炎及合成某些免疫抗原等等。此外，L－褐藻糖还是一种很重要的生化试剂，它被广泛用于化学分析、生物工程、细胞工程和糖工程等。我国目前仍依赖进口，而且进口价值昂贵。 因此，在当前采用一种快速有效的分离方法来制备 L－褐藻糖，借助于先进的测试手段来对 L－褐藻糖进行定性定量分析，为确定其生物活性及其在医药领域的应用具有重要的理论意义和应用价值。 本文通过大量的实验，对从青岛产海带提取多糖中的 L-褐藻糖进行了分析测定，并且确定了以海带为原料制备 L-褐藻糖的最佳生产工艺。L-褐藻糖的制备工艺流程图为： 海带粉末 提 取 富集多糖 酸降解 单糖 研究中我们采用 Dische 比色法和气相色谱法对海带提取多糖中的 L-褐藻糖进行测定。Dische 比色法测定多糖样品 A、B、C、D 中的 L-褐藻糖的平均含量分别为 29.08％、26.31％、25.62％、28.59％，变异系数为 0.98‰～1.75‰。 气相色谱法结果表明海带提取多糖中仅含有 L-褐藻糖和 D-半乳糖两种单糖，所选定的多糖样品 A、B、C、D 中的 L-褐藻糖的平均含量分别为 32.9072％、32.3147％、32.2924％、32.3571％，回收率为 97.1％～99.9％，变异系数为 0.23‰～0.60‰。 1
薛美兰[2]2012年在《褐藻糖胶对小鼠乳腺癌的体内外抑制作用及机制研究》文中指出背景与目的：褐藻糖胶(fucoidan)是从海带中提取纯化的一种多糖,其主要组成为褐藻糖、硫酸根,以及少量糖醛酸、半乳糖、木糖。褐藻糖胶具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、降血脂、降血糖、增强免疫力等生物学功能,使之成为天然海洋药物研究的热点。研究证实,褐藻糖胶对肠癌、乳腺癌、肝癌和白血病等均有明显的抑制作用,并能诱导细胞凋亡,而对正常细胞无毒副作用,但对其具体的作用机制尚未阐明。本研究以小鼠乳腺癌细胞4T1为靶细胞,采用体外培养细胞(体外实验)及建立荷瘤小鼠模型(体内实验)方法从分子水平、细胞水平及动物整体水平探讨褐藻糖胶的抗肿瘤活性及其作用机制,为最终将该药开发成为一种新型的天然抗癌药物奠定基础。方法：1.体外实验：体外培养小鼠乳腺癌细胞4T1,采用MTT比色法、荧光染色、流式细胞术(flow cytometry, FCM)、RT-PCR、Western blotting等方法,观察不同浓度褐藻糖胶对4T1细胞增殖和凋亡的影响,探讨褐藻糖胶体外的抗肿瘤活性及其作用机制。2.体内实验：培养4T1细胞接种Balb/c小鼠建立荷瘤小鼠模型,观察褐藻糖胶对荷瘤小鼠移植瘤生长的抑制情况,TUNEL染色检测瘤组织凋亡细胞,Western blot及免疫组化等方法检测褐藻糖胶处理后瘤组织内Bcl-2/Bax、生存素(Survivin)、β连环蛋白(B-catinin)、细胞周期蛋白Cyclin-D1和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK4以及血管内皮生长因子(VEGF)等相关蛋白的表达,探讨褐藻糖胶体内的抗肿瘤活性及其作用机制。结果：1.体外实验：褐藻糖胶(0、50、100、200μg/ml)作用4T1细胞48 h后,在荧光显微镜下观察到褐藻糖胶处理组细胞出现典型的凋亡形态学改变：细胞核固缩、有DNA碎片；RT-PCR及Western blot结果显示,随褐藻糖胶浓度的增加,Bcl-2 mRNA和蛋白表达均下降、Bax mRNA和蛋白表达升高,导致Bcl-2/Bax比值下降；凋亡抑制蛋白Survivin表达增加；线粒体膜电位下降,细胞色素C由线粒体向细胞浆释放增加,Caspase-3的活化率逐渐增加,明显高于对照组(P<0.05);MTT比色结果显示褐藻糖胶能抑制4T1细胞增殖；细胞周期分析表明,经50、100、200μg/ml褐藻糖胶处理48h后,G1期4T1细胞数明显增加,呈明显的G1期阻滞；Western blot结果显示随褐藻糖胶浓度增加,β-catinin、CyclinD1和细胞周期依赖激酶CDK4表达逐渐减少(P<0.05)。另外,褐藻糖胶处理后,VEGF表达也出现减少(P<0.05)。2.体内实验：结果显示褐藻糖胶能抑制荷瘤小鼠移植瘤的增长；TUNEL染色显示褐藻糖胶明显促进肿瘤组织内细胞凋亡；Western blot结果显示Bcl-2/Bax比值降低和Survivin的表达下降；免疫组化检测到β-catinin、CyclinD1、CDK4和VEGF的表达减少,肿瘤组织微血管密度降低；癌灶在肺部的转移率下降。结论：褐藻糖胶能明显诱导4T1细胞凋亡和细胞周期G1期阻滞,抑制小鼠肿瘤生长和肺转移,这些作用可能与Bcl-2/Bax降低、Survivin表达下降、Caspase-3激活以及下调Wnt通路中β-catinin、CyclinD1、CDK4的表达和抑制VEGF的生成有关。
刘斌[3]2005年在《中药海藻海蒿子多糖的分离与鉴定及其抗肿瘤活性初步研究》文中研究说明本文以我国的传统海洋中药—海蒿子作为试验材料,对其中的多糖进行了提取、分离鉴定和抗肿瘤活性初步研究。海蒿子多糖主要由褐藻糖胶、褐藻胶和褐藻淀粉组成,其中褐藻糖胶具抗凝血、抗病毒、抗肿瘤、抗炎和抗感染等活性。通过水提取法获得褐藻糖胶SPC(25℃提取)和SPH(85℃提取)。褐藻糖胶经乙醇分部沉淀、分级获得4个褐藻糖胶组分SPC60(60%乙醇沉淀,下同),SPC70,SPH60,SPH70。对4个组分进行了理化性质、分子量、单糖组成和红外光谱分析,揭示了各组分在组成与基本性质上的区别,证明不同的提取温度和不同浓度的乙醇醇沉可以获得性质不同的褐藻糖胶;通过离子交换和凝胶柱层析技术分离获得电荷、分子量均单一的褐藻糖胶组分P3和P4。系统比较了组分SPH70P3和SPH70P4的差别,证明了相同条件下提取的粗褐藻糖胶经柱层析分离可以获得不同的组分。通过理化性质分析、单糖组成、红外光谱分析、甲基化和高碘酸氧化等分析手段确定了纯化褐藻糖胶SPH70P4的基本特征:总糖含量82.15%,糖醛酸含量3.42%,硫酸基含量16.38%;分子量410 kD;红外光谱显示C-O-S伸缩振动吸收在840 cm~(-1);单糖组成为鼠李糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。结构特点为:多糖存在主要以岩藻糖,甘露糖和半乳糖组成的多糖骨架,硫酸基和糖链分支主要连接于该骨架上,其分子量为280 kD,不被高碘酸氧化;多糖链主要有1→2,4、1→3连接的岩藻糖和1→2,3,4和1→3,4,6连接的甘露糖、1→3,6连接的半乳糖构成;多糖的分支点主要位于己糖(甘露糖和半乳糖)上;侧链主要为葡萄糖;糖链末端为木糖;硫酸基主要连接于岩藻糖的2位或者3位;多糖链不存在叁股螺旋。 利用MTT法观察多糖对肿瘤细胞A549,P388的生长抑制作用,没有发现显着作用,但是硫酸基含量最高的SPH70P4活性最强。
柏超[4]2012年在《海带降解复合菌的选育及其功能研究》文中研究表明海带是一类在我国已实现大规模人工养殖的经济型海藻,除了作为海洋食品以外,由于其富含具有生理活性且可发酵的海藻多糖,如褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉等,因此在食品、医药、农业、能源等领域极具开发潜力。本文以海带为底物,通过人工孵育,获得两个能够降解海带的菌群,分别为淡水来源的R1菌群和海洋来源的HZ菌群,通过传统分离方法,分别从R1和HZ菌群中分离获得菌株70株和29株。在对全部菌株其进行系统发育分析和功能酶筛选后,以物种多样性和产酶多样性的互补原则人工组合,根据海带降解活性进行筛选,最终从R1菌群中挑选出3株菌组建人工菌群R1-3-A1,从HZ菌群中挑选2株菌组建人工菌群HZ-3-A。以藻体残余情况、酶活分析、总糖和还原糖含量检测等指标对两个人工菌群的海带降解效果进行分析,结果证明,上述2个人工菌群均具有液化藻体生物质、降解海带多糖的活性。进一步对HZ-3-A中产褐藻酸裂解酶的新种HZ-22进行了形态及生理生化特征的检测,系统发育分析以及褐藻酸裂解酶的酶学性质研究,结果表明该产酶菌株属于Tamlana属,与Tamlana agarivorans JW-26T具有最高的序列相似性为96.834%,迄今,尚未有Tamlana菌株产褐藻酸裂解酶的报道。该褐藻胶裂解酶粗酶的最适反应条件为40-50℃,pH 7.0-8.0,在0.8 M NaCI浓度下酶活保持不变,具有突出的耐盐性,在褐藻胶降解以及褐藻寡糖的制取中具有应用潜力。
吴泽[5]2015年在《海带酶解液中褐藻多糖硫酸酯的提取分离工艺研究》文中提出本文综述了褐藻多糖硫酸酯的提取方法,研究了溶剂萃取法从海带酶解液中提取分离褐藻多糖硫酸酯的新工艺。提取过程中产生的海带废渣用于提取水不溶性膳食纤维,符合绿色工艺要求。建立了硫酸苯酚法和高效液相色谱法分析检测糖含量的方法,研究了褐藻多糖硫酸酯萃取过程的热力学、动力学参数,并对膳食纤维的提取工艺进行了优化。试验确定了硫酸苯酚法测定总糖含量的最优试剂配比,每2.00 m L原料液加入5.00 m L浓硫酸及1.00 m L 6%的苯酚溶液,反应后在70 min内显色稳定。确定了以高效液相色谱法测定L-岩藻糖含量时褐藻多糖硫酸酯的最佳水解条件,以0.0050 mol/L硫酸60℃水解3 h。选用酰胺萃取体系:50%酰胺萃取剂及50%异β十六支链醇进行褐藻多糖硫酸酯的萃取,在20℃时以500 r/min转速萃取浓度为0.3430 g/L的原料液5min,原料液p H 0.46,相比5:2。在此条件下8级逆流萃取,萃取率稳定在95%左右。以萃取段所得饱和负载有机为原料进行反萃,在60℃时以700 r/min的转速萃取浓度为0.4461 g/L的负载有机,相比为1:1,经8级逆流反萃后反萃率稳定在90%左右。反萃所得产品经傅里叶红外光谱表征,确定为褐藻多糖硫酸酯。采用Lewis池进行了萃取动力学研究,得到褐藻多糖硫酸酯与萃取剂的反应系数为1:1,萃取反应速率方程为:R?5.408[P],该萃取反应为扩散控制步骤,属于界面反应模型,表观活化能为13.47 KJ/mol。转速与传质系数符合4K1.13 10 r 0.01986????,温度与传质系数符合4K5.066 10 T 0.18719?????。海带渣最佳干燥时间为3 h,由Cubic模型拟合得海带渣脱水速率方程:3 2tX?1.0187t?15.2708t?73.4104t?16.0978。海带渣在80℃水浴中以1:100(g/m L)的固液比加入浓度为20 g/L的Na2CO3溶液消化12 min,消化率稳定在75%-80%之间。消化后海带渣采用两步漂白法,先以浓度6%的双氧水按1:75(g/m L)的固液比在80℃恒温水浴中漂白p H为6.0的海带渣2 h,随后加入3 m L浓度30%双氧水继续消化2 h,最终成品膳食纤维为米白色。成分分析表明产品干基膳食纤维含量达80.53%,持水力为643.17%,膨胀力为1.50 m L/g,松装密度为0.1672g/m L。
吕广[6]2010年在《海藻肥原料中褐藻黄素的分离纯化》文中进行了进一步梳理海带中含有大量的褐藻黄素,占其类胡萝卜素总量的60%以上,具有预防治疗癌症,促进脂肪分解,降低胆固醇等多种对人类健康有益的生物学功能。然而,海带作为生产海藻肥的优质原料,在用化学法提取完其中的植物生长调节成分后,具有诸多生理功能和很大经济效益的褐藻黄素被破坏和丢弃,造成大量自然资源的浪费。本文研究的以褐藻黄素提取为中心的褐藻黄素和海藻肥联产工艺,为工业上提高海带的利用率和附加值提供了试验依据。采用单因素试验和正交试验,并结合操作可行性对褐藻黄素的提取条件进行了优化,结果表明:提取时海带先经过4 mL/g水溶涨预处理,选取丙酮作为最佳浸提溶剂,料液比为5 mL/g(以干海带记),室温条件下,避光静置浸提2次,每次30 min,具有最佳的提取效果:褐藻黄素的平均提取收率可达72.4%。分别采用萃取、硅胶柱层析、皂化、结晶多种分离方法对褐藻黄素进行纯化,根据各种分离方法的分离效果并结合操作可行性,最终确定了用正己烷对丙酮浸提液进行萃取以实现褐藻黄素的转移和初步分离,然后依次采用两次硅胶柱层析对其进行纯化,流动相分别选择丙酮:正己烷=1:3和丙酮:氯仿=1:9,经紫外吸收光谱(UV)和高效液相色谱(HPLC)分析,色素纯度为75%以上。最后色素样品分别经制备薄层层析(氯仿:丙酮=6:1)和制备高效液相色谱(PHPLC,19×300 mm,7μm,SymmetryPrepTM;methanol:water=89:11;8 mL/min;8 mL)进一步分离得到标准品,纯度分别为95%以上和99%以上。对得到的色素标准品进行紫外吸收光谱、质谱(MS)、核磁共振(13C-NMR,1H-NMR)定性分析,其特征吸收峰、分子量、结构均与报道的褐藻黄素一致。利用提取褐藻黄素后的海带残渣为原料,加入2倍体积的水和总体积(海带残渣和水的体积)5%的氢氧化钾作为消化剂,80℃消化2 h后,4000 rpm离心10 min,得到液体海藻肥。经田间试验结果表明,用提取褐藻黄素的海带残渣制备的海藻肥使小白菜增产41.98%,具有显着的促进作物生长的功效。本文首先用丙酮对海带中的褐藻黄素进行提取,然后采用碱消化法将提取残渣制备成海藻肥,并经试验证明,褐藻黄素和海藻肥联产工艺具有可行性。本方法褐藻黄素提取时间短,收率高,溶剂利于回收,过程简便,提取褐藻黄素后的海带残渣消化得到的液体肥料,在田间实验中增产效果明显,为海带工业中提高原料利用率和附加值,提供了实验依据。
郑军, 王英, 钱俊杰, 张靖, 杨红[7]2002年在《褐藻糖胶的提取纯化及其抗凝血活性的研究》文中研究指明从海带中提取出的水溶性提取物 ,经超滤、醇析获得褐藻糖胶粗多糖 .以DEAE -SephroseFastFlow离子交换层析分离纯化 ,得到了F1,F2和F3叁个级分 .这叁个级分具有明显的抗凝血作用 ,尤其是F3级分 ,能显着地延长激活部分凝血活酶时间和凝血酶时间 .
李春莲[8]2011年在《低分子量亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备及抗肿瘤活性研究》文中提出亨氏马尾藻(Sargassum henslowianum C.Agardh)隶属褐藻门,墨角藻目,马尾藻科,马尾藻属。岩藻聚糖硫酸酯(Fuciodan)是海藻多糖中一类独特的结合有硫酸基团的活性多糖,具有显着的抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗凝血及提高机体免疫力等作用。但由于其分子量大,溶解性较差,不容易被人体吸收,所以在研究和应用方面受到了限制。酶降解是一种温和的制备低分子量的活性海藻多糖的方法,但是市售的酶制剂价格昂贵,降解效果不佳,因此寻找更经济实惠的酶制剂值得进一步的研究。本文以广东湛江硇洲岛的亨氏马尾藻为原料,对已初步分离纯化的亨氏马尾藻岩藻聚糖(SF)再进行分离纯化,并以新鲜的海洋小杂鱼内脏为原料来提取降解海藻多糖粗酶,再以酶法降解大分子量的亨氏马尾藻岩藻聚糖,并对降解前后亨氏马尾藻岩藻聚糖的抗肿瘤活性与分子量、理化组成的关系展开了研究。本文首先以八种新鲜海洋小杂鱼的肝胰脏为原料,比较得出从沙钻鱼肝胰脏提取出活力较高的酶。以磷酸盐缓冲液为浸提液,在单因素的基础上通过L_9(3~4)正交试验对浸提工艺条件进行优化,试验结果得出最佳的浸提条件为:浸提pH6.0、浸提温度35℃、浸提时间3 h。再对粗酶液进行分步盐析沉淀,先以饱和度30%的硫酸铵除去部分杂质,离心收集上清液进行硫酸铵盐析沉淀。在单因素的基础上采用L_9(3~4)正交试验对盐析工艺条件硫酸铵饱和度、pH、温度、时间进行优化,得出最佳的盐析条件为:硫酸饱和度为80%、盐析pH为5.5、盐析温度为45℃、盐析时间为3 h。将制备的酶进行SephadexG-100柱层析,洗脱出D_1、D_2、D_3叁个蛋白组分,其中组分D_2的酶活力最大,D_1、D_3几乎没有酶活力,收集组分D_2冷冻干燥,低温保存。通过凝胶过滤法(Gel Filtration, GF)对超声波热水提取并用纤维素阴离子交换树脂(Cellulose DE-52 )分离纯化得到的亨氏马尾藻岩藻聚糖再进行分级纯化,通过SepharoseCL-6B琼脂凝胶柱柱层析得到4个组分:SF1、SF2、SF3、SF4,经鉴定均为分子量较均一的组分。凝胶过滤标准曲线法测定4个组分的相对分子量分别为:851.13kDa,239.85kDa,102.34kDa,19.95kDa。采用酶法对4个组分进行降解得到相应的降解组分:SF1-R、SF2-R、SF3-R、SF4-R,通过L_9(3~4)正交试验得出最优酶降解条件组合为:底物浓度为0.6%、降解pH为5.0、降解温度为45℃、降解时间为4 h。同样采用凝胶过滤标准曲线法测得降解后的4个组分的相对分子量分别为:53.74kDa,19.54kDa,9.27kDa,6.69kDa,对比降解前后的各多糖组分的相对分子量得出SF1、SF2、SF3、SF4降解倍数分别为:15.82,12.34,11.22,3.01。通过标准曲线法对降解前后多糖组分进行理化分析:得出SF1、SF1-R、SF2、SF2-R、SF3、SF3-R、SF4、SF4-R的总糖含量分别为:72.92%,70.15%,67.55%,65.46%,60.87%,59.23%,56.81%,55.78%;L-岩藻糖含量分别为:38.82%,36.91%,34.12%,31.33%,30.19%,25.58%,26.86%,19.84%;糖醛酸含量分别为:4.14%,4.65%,6.37%,7.43%,8.35%,8.93%,9.72%,10.23%;硫酸基含量分别为:30.93%,33.63%,32.65%,35.87%,29.88%,30.44%,21.61%,20.85%。通过细胞体外培养法,采用MTT比色法研究了八组分亨氏马尾藻岩藻聚糖在5个质量浓度(1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL)下分别对小鼠肉瘤细胞S-180、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞SMMC-7721作用24 h、48 h、72 h时细胞增殖的抑制情况,结果分析表明:不同浓度,不同时间,八组分亨氏马尾藻岩藻聚糖对叁种肿瘤细胞的抑制作用不同,随着亨氏马尾藻岩藻聚糖质量浓度的增加和作用时间延长,3种肿瘤细胞的抑制作用分别呈现不断增强趋势,呈现一定的剂量和时间的依赖效应。采用统计学分析了八组分亨氏马尾藻岩藻聚糖对叁种肿瘤细胞的抑制效果(P<0.05显着,P<0.01极显着),结果表明:在48 h~72 h组, SF1-R、SF2-R对叁种肿瘤细胞增殖的抑制效果较各自降解前SF1、SF2的抑制效果有显着性提高(P<0.05显着,P<0.01极显着);在72 h组,降解后的SF3-R抑制效果较显着于降解前的抑制效果(P<0.05显着,P<0.01极显着);在24 h~72 h组,降解后的SF4-R较降解前的抑制效果显着性不明显(P>0.05)。结果分析还表明,8组分多糖中SF2-R对S-180、A549细胞增殖的抑制效果显着于其他组分,SF2-R对S-180、A549细胞作用72 h后的抑制率分别为:77.57%,61.06%;8组分多糖中SF1-R对SMMC-7721细胞增殖的抑制效果显着于其余组分,作用72 h后抑制率达到62.47%。经计算:SF1、SF1-R、SF2、SF2-R、SF3、SF3-R、SF4、SF4-R对S-180作用72 h的IC_(50)值分别为:7.11mg/mL、5.57mg/mL、6.61mg/mL、4.89mg/mL、9.91mg/mL、8.91mg/mL、14.66mg/mL、14.79mg/mL;对A549作用72 h的IC_(50)值分别为:11.64mg/mL、9.86mg/mL、10.63 mg/mL、8.75mg/mL、14.37mg/mL、12.62mg/mL、18.71mg/mL、20.27mg/mL;对SMMC-7721作用72 h的IC_(50)值分别为:9.33mg/mL、7.88mg/mL、11.48mg/mL、9.75mg/mL、13.66mg/mL、12.84mg/mL、15.94mg/mL、16.83mg/mL。
参考文献：
[1]. 海带中L-褐藻糖的测定及其制备[D]. 赵增芹. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2004
[2]. 褐藻糖胶对小鼠乳腺癌的体内外抑制作用及机制研究[D]. 薛美兰. 青岛大学. 2012
[3]. 中药海藻海蒿子多糖的分离与鉴定及其抗肿瘤活性初步研究[D]. 刘斌. 中国海洋大学. 2005
[4]. 海带降解复合菌的选育及其功能研究[D]. 柏超. 浙江大学. 2012
[5]. 海带酶解液中褐藻多糖硫酸酯的提取分离工艺研究[D]. 吴泽. 哈尔滨工业大学. 2015
[6]. 海藻肥原料中褐藻黄素的分离纯化[D]. 吕广. 河北农业大学. 2010
[7]. 褐藻糖胶的提取纯化及其抗凝血活性的研究[J]. 郑军, 王英, 钱俊杰, 张靖, 杨红. 分子科学学报. 2002
[8]. 低分子量亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备及抗肿瘤活性研究[D]. 李春莲. 广东海洋大学. 2011