崔风云1.2 刁英1（通信作者）
（1遵义医学院附属医院生殖中心 贵州 遵义 563003）
（2河南省汝州市第一人民医院 河南 汝州 467500）
【摘要】 通过从免疫组织化学角度对银杏内酯B（GB）抗小鼠胚胎着床作用进行观察，得出结论：GB通过干扰FN、LN在小鼠子宫内膜上的表达，影响了蜕膜反应，这可能是该药抗着床作用的重要机制之一。
【关键词】 银杏内酯B；小鼠胚胎；免疫组织化学
【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）20-0185-02
银杏内酯BGB）是从银杏叶中提取出来的萜类化合物，属于PAF天然拮抗剂的一种，活性最强，特异性最高，具有专属的抗PAF活性。近年来许多研究表明：细胞外基质（ECM）的主要成分纤粘连蛋白（FN）和层粘连蛋白（LN）在胚泡植入过程中起重要作用[1]。本研究拟通过免疫组织化学法，研究GB在小鼠胚泡植入时，对FN、LN在小鼠子宫内膜上表达的影响，以探讨其抗着床作用的机理。
1.材料和方法
1.1 实验动物处理
将体重25～30g的未经产成年雌性昆明小鼠，按雌雄2:1合笼交配；发现阴栓者定为妊娠第0天（D0天）。将25只孕鼠平均分为5组，均于D2天，于右侧子宫角的宫腔内注射不同剂量的GB 10μl、20μl、30μl、40μl、50μl作为实验侧，左侧子宫角的宫腔内注射相应剂量的生理盐水作为对照侧。另取3只孕鼠，未进行任何处理，作为空白对照组。
1.2 标本制备
将实验小鼠于D8天用脱颈椎法处死后，立即剖腹肉眼观察子宫，记录胚胎数目，并取出双侧子宫角，用以免疫组化及HE染色。
1.3 免疫组织化学染色
采用免疫组织化学Envision法染色。
1.4 结果判定
阳性结果必须具备：细胞结构清晰，阳性颗粒定位、定性好，着色明显高于背景。
2.统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差表示，进行t检验、单因素方差分析及均数趋势检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
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3.结果
3.1 一般组织学以及肉眼观察
3.1.1肉眼观察 对照侧小鼠D8天，出现子宫变粗，颜色淡红现象，胚泡发育相同且均匀分布于子宫内壁，成串珠状，数量少于空白对照组，但无统计学差异（P＞0.05）。而实验侧小鼠妊娠子宫有粗有细，直径不相同，并且胚胎数量变少，胚胎变性坏死后子宫有瘀血，并伴有水肿,胚胎总数明显少于对照侧，且随GB剂量增大，小鼠胚胎数量明显减少。
3.1.2一般组织学观察 光镜下D8天：对照侧小鼠子宫内膜有明显的蜕膜反应，绒毛结构较发达，胎盘发育尚不完善，有少量的血细胞分布于绒毛间隙，蜕膜与绒毛膜之间可见较多星形巨细胞分布。实验侧小鼠胚胎发育不良，蜕膜较对照组薄，蜕膜细胞间隙见有大量红细胞，绒毛间隙见白细胞浸润，巨细胞结构松散；部分蜕膜细胞发生变性和坏死。大剂量GB（≥40μl）时出现无胚胎着床。
3.2 免疫组织化学观察
3.2.1 FN在小鼠子宫内膜上的表达及平均光密度值 对照侧FN存在于小鼠子宫内膜的上皮基膜、子宫腺基膜、绒毛滋养细胞和蜕膜细胞周围的基质中；此期绒毛发达，结构松散。实验侧随着GB剂量的增大，FN免疫阳性物表达逐渐减少，≥40μl时几乎无阳性表达。空白对照组FN在小鼠子宫内膜上免疫阳性物的平均光密度值为0.30±0.02，与对照侧比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
3.2.2 LN在小鼠子宫内膜上的表达及平均光密度值 对照侧LN存在于小鼠子宫内膜的子宫腺基膜、绒毛滋养细胞、上皮基膜和蜕膜细胞周围的基质中；此时期的绒毛发达，结构呈现出松散状。随着GB剂量的不断增多，实验侧LN免疫阳性表达物则出现了逐渐减少现象，≥40μl的时候则几乎无阳性表达。空白对照组LN在小鼠子宫内膜上表达的平均光密度值为0.31±0.01，与对照侧比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
4.讨论
GB是从银杏叶中提取出来的萜类化合物，属于PAF天然拮抗剂的一种,具有专属的抗PAF活性[1]。研究报道，PAF的特异性拮抗剂海风藤酮，通过拮抗PAF有明显的抗胚胎着床作用[2]。
联系母体蜕膜细胞与子体滋养细胞的介质是细胞外基质（ECM），它是一种含有多种化学成分介质，其最主要的成份是LN和FN。研究表明，LN和FN与胚泡的植入有着非常密切的联系，它们在子宫内膜上皮的基底层、胚泡期胚胎的细胞表面广泛分布，无论是在维持成体结构、功能完善的生理活动中，还是在胚胎着床以及发育过程中，都具有至关重要的作用；据研究发现，蜕膜的形成过程中，其四周渐渐聚集着LN和FN等物质，这些物质将通过细胞膜上相应的受体把细胞粘附到基质当中，使细胞的定向迁移就会沿着其浓度和梯度，并且在迁移的过程中分裂增殖LN和FN。LN和FN在蜕膜细胞的四周的增多，不仅能够使蜕膜细胞自身的功能增强，还可以加快蜕膜细胞分泌胶原酶，从而降解基质当中的胶原纤维，使胚泡滋养层不断地侵入至植入到蜕膜中。本研究免疫组化染色观察，主要分布在子宫内膜的子宫腺基膜、上皮基膜、蜕膜细胞和绒毛滋养细胞周围的基质中的LN及FN免疫阳性物质，随着GB剂量的增多，滋养层细胞和子宫蜕膜发生了不同的组织学变化，LN和FN免疫阳性表达物也进而出现了改变。表明GB可能通过干扰LN、FN的表达进而抑制胚胎着床，但具体机制尚不明确，有待进一步研究。
另外，本实验中对照侧小鼠胚泡数较空白对照组减低，分析原因一方面与手术创伤有关，另一方面可能与着床时注入生理盐水，造成宫腔内与着床有关的因子浓度被稀释有关，但二者之间差异无显著性（P＞0.05）。
【参考文献】
[1]刁英，崔风云.银杏内酯B对小鼠胚胎着床过程中滋养层和蜕膜组织超微结构的影响[J].生殖与避孕，2012,32（10）：656-661.
[2]肖君刚，李惠，刘斌等.海风藤酮对小鼠胚卵着床的影响[J].北京医科大学学报，1994,26（1）：42-42
论文作者:崔风云1.2,刁英1（通信作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2016年7月第20期
论文发表时间:2016/7/28
标签：小鼠论文; 胚胎论文; 着床论文; 细胞论文; 免疫论文; 子宫论文; 阳性论文; 《医药前沿》2016年7月第20期论文;