邱薇, 扈荣良, 夏咸柱[1]2001年在《犬2型腺病毒基因重组活疫苗的基础研究》文中研究说明犬腺病毒是哺乳动物腺病毒中致病性最强的一种。CAV-2和CAV-1具有交叉免疫作用,可同时保护动物抵抗CAV-1和CAV-2的感染,且CAV-2弱毒苗克服了CAV-1弱毒苗的所有缺点,因此目前世界上用于犬腺病毒感染的疫苗都采用CAV-2。
邱薇[2]2001年在《犬2型腺病毒基因重组活疫苗的基础研究》文中指出犬腺病毒（Canine adenovirus，CAV）属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属，是哺乳动物腺病毒中致病性最强的一种，分为1型和2型。犬1型腺病毒（CAV-1）可以引起犬传染性肝炎和狐狸 熊的脑炎以及单纯的呼吸道疾病；犬2型腺病毒（CAV-2）引起犬的传染性喉气管炎和肠炎。CAV-1弱毒疫苗虽然已最大限度致弱，但还会引起眼、肾病变，造成免疫犬发生前眼色素层炎，形成短暂角膜浑浊的“蓝眼”。由于CAV-2和CAV-1具有交叉免疫作用，而且CAV-2弱毒苗克服了CAV-1弱毒苗的现有缺点，能激发体液免疫和细胞免疫，可同时保护动物抵抗CAV-1和CAV-2的感染。因此目前世界上用于犬腺病毒感染的疫苗都采用CAV-2弱毒疫苗。 以病毒为载体的重组疫苗能很好地表达外源基因，其表达产物能诱导机体产生高水平的细胞免疫和体液免疫反应，并产生免疫保护。腺病毒因其具有宿主范围广泛、感染滴度高、安全、稳定以及应用方便等优点而成为研究重组疫苗和人类基因治疗的热点。以人、猪、牛、羊、禽等腺病毒为载体的重组疫苗相继获得成功，如用人5型腺病毒构建的狂犬病病毒糖蛋白基因重组疫苗用于野生动物狂犬病的免疫，获得了良好的预防效果。但人腺病毒不能在动物体内很好的繁殖，这就影响了重组疫苗的免疫效果，犬科动物对CAV易感且本身就具免疫原性，插入外源性抗原基因即为二联基因工程苗，可同时对犬和野生动物进行两种疾病的免疫预防。采用犬2型腺病毒为载体进行重组疫苗的研究很早就引起了国内外学者的兴趣，但由于其同源重组效率低、表达调控机制不明等原因，迄今尚无相关报道。 本实验以分离驯化的CAV-2弱毒疫苗SY株为基础，提取全基因组DNA后直接进行酶切，分别回收含E1区的EcoRⅠC片段和含E3区的KpnⅠB片段，将它们克隆到质粒pGEM-3zf和pBluescriptⅡKS（+）中，得到重组质粒pG-E1和pBE3-2，并对克隆的CAV-2 SY株E1、E3区进行了序列测定和分析，结果表明CAV-2 SY株E1区序列与CAV-2Toronto A26/61株的完全相同，而与Vaxitas株的序列的最大同源性为99.8％。CAV-2 SY株E3区序列与CAV-2 Toronto A26/61株以及Manhattan株的E3区序列则完全相同。在克隆的CAV-2 SY株E3区重组质粒pBE3-2的基础上，通过酶切消除多克隆位点，经连续两次点突变，在E3区的首尾两端各引入一个Bg1Ⅱ酶切位点，用Bg1Ⅱ酶切后自连得到E3区缺失的质粒pBΔE3，并在该位点加入人工接头，得到质粒pBE3L。然后通过一系列重组，构建了含有和不含外源性启动子的荧光蛋白（GFP）基因和狂犬病病毒糖蛋白（Rgp）基因的表达质粒，分别命名为pBE3LCGFP、pBE3LGFP、pBE3Rgp和pBE3LCRgp，其中不含外源性启动子的表达质粒其外源基因的阅读框架与E3区的阅读框架保持一致。以4个重组质粒各5μg转染DK细胞。对含有和不含外源性启动子的绿色荧光蛋白基因重组质粒pBE3LCGFP和pBE3LGFP，分别于转染后24h、48h、72h和96h直接在荧光显 中文摘要一微镜下观察荧光；狂犬病病毒糖蛋白基因重组质粒 pBE3Rgp和 pBE3LCRgp，分别于转染后24h、48h、72h和96h时，以抗狂犬病病毒糖蛋白的单克隆抗体和羊抗鼠荧光抗体对细胞单层进行兔疫荧光染色检测。结果表明，含有启动于的重组质粒pBE3LCGFP在转染24h后即可观察到荧光，4M6h以上荧光无明显差别，转染细胞经两次传代后仍可见荧光细胞，但数量明显减少。不含外源性启动子的重组质粒pBE3LcFP在转染后始终未观察到荧光。对 Rgp基因重组质粒转染细胞单层的免疫荧光染色结果与荧光蛋白基因的转染结果一致，即含有外源性启动于的N刃基因能表达，不含外源性启动于的则不能表达。说明在构建的E3区缺失质粒中，E3区本身的启动子不能启动外源基因的表达，必需携带外源启动子。由于所构建的表达质粒在 E3区外两端各包括有 Ikb以上的 CAV－2核酸序列，并同时具有两个单一酶切位点，因此可用于体外的人工重组和细胞内的同源重组。 为了进行重组病毒的研究，首次建立了稳定的 CAV－2 EI转化细胞系，将带有 CAV－ZSY株EI区的质粒灿－EI用B刀RI和B团血H1将m区片段转移到pC DNDNA3上，构建了重组质粒pC－EI。再用 BStX对pG－EI进行酶切，以缺失EI区起始密码子前的多余片段，再用 ECOR和 BamH将m片段克隆到 pGDNA3上，构建m表达质粒 pG－Elt，然后用这两种质粒对 DK细胞分别进行转染，在保持 ling／ffil的 G418浓度筛选压力下，叁周后分别得到刀和26个克隆细胞。m转化细胞株的KR鉴定结果表明，pC－m质粒转染得到的 23个细胞克隆和 po－Elt质粒转染得到的 26个细胞克隆中均能扩增出 EIA 652hP的特异片段，说明转化细胞中整合有E！片段。RT－PCR结果显示pC－EI质粒转染得到的刀个细胞克隆无特异性扩增带，说明EIA不转录：而W－Elt质粒转染得到的拈个细胞克隆中部分能扩增出EIA 536hp的特异性片段，其中6株细胞为RT－PCR强阳性，说明EIA获得表达。其余为 RT．PCR弱阳性或阴性。用抗 CAV－2 SY株犬血清及碱性磷酸酶标
高玉伟[3]2006年在《虎源和狮源H5N1亚型流感病毒进化分析与HA基因重组犬2型腺病毒构建研究》文中认为自2003年以来,H5N1禽流感(AI)在亚洲的大面积暴发已导致近亿只禽类感染死亡或被捕杀,并跨越种间障碍导致109人死亡。这些事件让人们担心H5N1AIV可能会进化成为引发流感大流行的病毒。2002年我们从发病死亡虎中分离到1株H5N1 AIV,这是首次发现H5N1 AIV能够自然感染除人以外的哺乳动物并且导致其发病死亡。在进一步的虎和狮AI感染情况调查中分离获得14株H5N1 AIV,对虎源和狮源流感病毒的生物学特性和基因进化进行了研究:人工感染实验表明所分离病毒对鸡、小白鼠和家猫均具有高致病性;全基因序列测定表明所分离病毒与H5N1亚型AIV高度同源(96%～100%),虎源和狮源流感病毒各基因节片具有一系列H5N1 AIV特征性遗传位点;受体结合特性检测表明15株病毒均保持着与AIV受体结合的特性,虎气管流感病毒受体以AIV受体类型为主。以犬2型腺病毒为载体,构建了表达流感病毒HA蛋白的重组活病毒,用其免疫猫可以诱导产生效价为1:8～1:16的中和抗体。这为哺乳动物H5N1亚型流感病毒重组活载体疫苗的研究提供了理论与技术基础。
胡志敏[4]2006年在《猪带绦虫六钩蚴TSOL18基因重组犬腺病毒2型活载体疫苗的基础研究》文中研究指明囊虫病(Cysticercosis Cellulosae)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫寄生于人或猪体内而引起的一种重要人畜共患寄生虫病。人不仅是中间宿主，而且是唯一的终末宿主。腺病毒载体是基因工程疫苗研究中重要的转基因病毒载体，研究和开发基于腺病毒的重组猪囊尾蚴疫苗，将对控制或根除猪囊尾蚴病具有实践意义。 以质粒pVAX1为载体构建了猪囊虫病基因免疫用的真核表达质粒。首先根据kozak原理设计了1对表达引物，用PCR方法从构建好的重组质粒pGEM-TSOL18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSOL18基因片段，将其定向克隆到质粒pVAX1中得到真核表达质粒pV-TSOL18。再根据PCR点突变原理设计4条突变引物，对目的基因进行改造，之后亚克隆入pVAX1载体中获得含改造后的目的基因的重组表达质粒pV-TSOL18m。经脂质体介导法转染BHK-21细胞36h后用RT-PCR方法检测到了目的基因的转录。这为猪囊虫病基因疫苗动物免疫实验研究奠定了良好基础。 构建了能表达猪带绦虫六钩蚴TSOL18蛋白的重组犬2型腺病毒CAV2-TSOL18m。首先用Ssp I对重组质粒pVAXE3的E3区中859bp长度的片段进行缺失，得到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3。将所构建的真核表达质粒pV-TSOL18m用Nde I+Sph I双酶切，然后将含有TSOL18m基因的完整表达盒(pCMV-TSOL18m-PolyA)进一步定向克隆到pVAX△E3中，构建出p△E3-TSOL18m。通过Nru I+Sal I双酶切p△E3-TSOL18m，回收含有目的基因TSOL18m的表达盒将其克隆入含有犬腺病毒2型全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV2中，获得重组质粒pCAV2-TSOL18m。Asc I+Cla I双酶切pCAV2-TSOL18m释放重组基因组，转染DK细胞，获得了重组病毒CAV2-TSOL18m。该重组病毒在DK细胞上能产生典型的腺病毒细胞病变。RT-PCR检测表明，该重组病毒能转录出TSOL18m基因mRNA。
蔡锦顺[5]2010年在《PRRSV GP5与M蛋白重组犬2型腺病毒的构建及其免疫特性研究》文中提出为研制安全有效的PRRSV基因工程疫苗,本研究首先利用吉林地区一疑似PRRS的病猪肺脏,通过MARC-145细胞传代、血清学鉴定及病毒理化学特性等方法鉴定,获得了一株PRRSV, JL-0605。采用RT-PCR方法扩增了PRRSV JL-0605主要免疫原性蛋白GP5和M,将其克隆到犬2型腺病毒E3缺失性载体中,获得了携带GP5和M两个基因的重组感染性全基因组,转染细胞获得了重组病毒,通过对重组病毒酶切鉴定,确定GP5、M重组犬2型腺病毒构建成功。传代表明该病毒稳定,TCID50为105.25/0.1mL。感染细胞经IFA检测可观察到特异性荧光,表明PRRSV GP5、M蛋白获得了表达。以GP5、M蛋白重组犬2型腺病毒免疫小鼠,2周开始检出中和抗体,6周达到高峰,抗体效价达到1:16,同时产生了较明显的淋巴细胞增殖效应。该结果说明,GP5和M蛋白同时表达能显着增强体液免疫应答和细胞免疫应答。GP5、M蛋白重组犬2型腺病毒免疫3月龄仔猪,第10周中和抗体效价达到最高水平,说明该重组疫苗可有效诱导和维持PRRSV特异性抗体。以上研究为PRRS的特异性免疫研究奠定了基础,为有效抗原的筛选和预防制剂的研制提供了重要手段。
张祖维[6]2004年在《犬2型腺病毒活载体构建的基础研究》文中研究说明犬腺病毒(Canine adenovirus, CAV)属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属,是哺乳动物腺病毒中致病性最强的一种,分为1 型和2 型。犬1 型腺病毒(CAV-1)可以引起犬传染性肝炎和狐狸、熊的脑炎以及单纯的呼吸道疾病;犬2 型腺病毒(CAV-2)引起犬的传染性喉气管炎和肠炎。CAV-1 弱毒疫苗虽然已最大限度致弱,但还会引起眼、肾病变,造成免疫犬发生前眼色素层炎,形成短暂角膜浑浊的“蓝眼病”。由于CAV-2 和CAV-1 具有交叉免疫作用,而且CAV-2 弱毒苗克服了CAV-1 弱毒苗的现有缺点,能激发体液免疫和细胞免疫,可同时保护动物抵抗CAV-1 和CAV-2 的感染。因此目前世界上用于犬腺病毒感染的疫苗都采用CAV-2 弱毒疫苗。腺病毒为载体的重组疫苗能很好的表达外源基因,其表达产物能诱导机体产生高水平的细胞免疫和体液免疫反应,并产生免疫保护。腺病毒因其具有宿主范围广,感染滴度高,安全,稳定以及应用方便等优点而成为研究重组疫苗和人类基因治疗的热点。以人、猪、牛、羊、禽等腺病毒为载体的重组疫苗相继获得成功,如用人5 型腺病毒构建的狂犬病病毒糖蛋白基因重组疫苗用于野生动物狂犬病的免疫,获得了良好的预防效果,但人腺病毒不能在动物体内很好的繁殖,这就影响了重组疫苗的免疫效果,犬科动物对CAV易感且本身就具有免疫原性,插入外源性抗原基因即为二联基因工程苗,可同时对犬和野生动物进行两种疾病的免疫预防。采用犬2 型腺病毒为载体进行重组疫苗的研究很早就引起国内外学者的兴趣,但由于其同源重组效率低、表达调控机制不明等原因,迄今尚无相关报道。本研究进行了绿色荧光蛋白(GFP)与犬2 型腺病毒(CAV-2)基因体外重组的基础研究。一、以分离驯化的CAV-2 弱毒疫苗YCA-18 株为基础,提取全基因组DNA 后
孔庆波[7]2005年在《转移因子增强犬细胞免疫功能的作用机理研究》文中认为转移因子(transfer factor,TF)由T 淋巴细胞产生,分子质量小,化学本质为小肽与寡聚核苷酸复合物。TF 能够将供体的细胞免疫功能转移给受体,尤其是非特异性TF 能够提高受体天然免疫和特异性免疫功能的特性使其在人类和多种动物疾病防治中获得普遍应用。弄清TF 增强犬免疫功能的细胞和分子机制,无疑将为TF 临床用于犬病尤其是犬传染病的防治提供理论依据和指导。本研究首先提取制备了研究所需要的猪、犬TF,然后选择杂种牧羊犬作为实验犬,用淋巴细胞转化增殖试验MTT 法、流式细胞技术、ELISA、吞噬杀伤试验MTT 法,检测了实验犬注射猪TF、犬TF 前后不同时间的淋巴细胞增殖效果、T 细胞亚群的变化、在免疫应答调控中起重要作用的细胞因子(IL-2、IL-12、IL-4 和IFN-γ)分泌量的变化、外周血中性粒细胞吞噬杀伤活性的变化。在此基础上,用猪TF 等联合治疗人工感染和自然发病的犬细小病毒病,对猪TF 的效果进行评估。试验获得如下结果:1.制备的猪、犬TF 理化性质相似,所制备的TF 可供本研究使用。2.淋转试验中,PHA-P 在12.5μg/mL 时对犬淋巴细胞有促进增殖的作用,但t 检验分析表明,其促进淋巴细胞增殖的效果并不显着。ConA 在浓度为0.5～2.5μg/mL 范围内均可以显着刺激T 细胞的增殖(P<0.05),且在浓度为2.5μg/mL 时刺激效果最佳。LPS在浓度为40μg/mL 时,能够显着刺激B 细胞增殖;同种、异种TF 均可以单独刺激犬淋巴细胞增殖,但同种TF 的作用效果要优于异种TF。在协同PHA-P 刺激淋巴细胞增殖时,同种TF 的作用在较大的浓度范围内(0.097～12.5mg/mL)能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖,而异种TF 只在较小的浓度范围内(0.097～3.125mg/mL)能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖;但在协同ConA 刺激淋巴细胞增殖时,同种TF 的作用却在较小的浓度范围内(0.097～0.78mg/mL)能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖,而异种TF 只在浓度范围0.78～3.125mg/mL 内能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖。注射异种TF 后,在6～10d 内,犬淋巴细胞单独增殖的能力越来越强。注射了异种TF 的犬,其淋巴细胞再次受到TF 单独或协同丝裂原刺激时,淋巴细胞的增殖能力呈现早期(4～6d)下降趋势,后期(6d 后)受到抑制的现象。3.同种、异种TF 均可提高犬外周血淋巴细胞数量,CD4/CD8 比值变化分析证实,外周血增加的淋巴细胞中主要为CD4+ T 细胞。犬注射同种、异种TF 后在20d 内CD4+ T 细胞呈现持续增加的规律。同种TF 促进犬外周血CD4+ T 细胞上升的作用优于异种TF。4.犬注射同种、异种TF,均可提高淋巴细胞分泌IFN-γ。注射犬TF 后第10 天,犬
闫飞虎[8]2016年在《PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究》文中研究指明小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)俗称羊瘟,又被称为小反刍兽假性牛瘟,是一种由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的急性或亚急性传染病。世界动物卫生组织(The World Organization for Animal Health,OIE)将其列为必须通报疫病,我国将其列为一类动物疫病。2007年7月在我国西藏阿里地区出现了中国首例小反刍兽疫,2014年我国大面积爆发小反刍兽疫,波及20余省份,给当地养羊业造成巨大经济损失。此外,小反刍兽疫经空气传播,最易感的是小反刍动物,尤其野生小反刍动物不受国界限制,很容易造成全球性蔓延,所以有效的预防显得尤为重要。弱毒疫苗是OIE规定的唯一允许使用的小反刍兽疫病毒疫苗,然而PPRV对热非常敏感,疫苗在保护和运输过程中保持冷链状态相对较为困难。此外,减毒活疫苗还存在毒力返强的风险,这就限制了PPR弱毒疫苗的大规模田间使用,因此迫切需要开发一种安全有效、热稳定性好的疫苗候选。相比弱毒疫苗与灭活疫苗,病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗成为安全稳定的疫苗候选者之一,病毒样颗粒是由病毒一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒。在形态上,VLPs类似于真实的病毒粒子,但是由于缺乏具有感染性的核酸,故无复制和感染能力。虽然病毒样颗粒不具有感染性,但VLPs具有类似于天然病毒的理化性质,能被抗原提呈细胞摄取加工提呈,激发细胞免疫反应和体液免疫应答,具有安全性高和免疫原性好的优点。流感VLPs疫苗、乙型肝炎VLPs疫苗及猪圆环病毒2型VLPs疫苗都已进入临床试验或者已被比准上市。但目前为止,有关小反刍兽疫病毒病毒样颗粒(PPRV VLPs)构建研究的报道较少。因此,本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统构建生产不同毒株的PPRV VLPs,并对其免疫原性进行研究比较,选取免疫原性好的毒株的病毒样颗粒进行本动物免疫,为开发安全、有效的小反刍兽疫病毒样颗粒候选疫苗奠定基础。第1章:小反刍兽疫M、F和H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备本研究以PPRV疫苗株Nigeria 75/1株为研究对象,分别针对其M、F和H蛋白的主要抗原表位区设计克隆引物,通过RT-PCR扩增去除跨膜区和信号肽序列而保留主要抗原表位区片段,将编码序列大小分别为1005 bp PPRV M基因片段克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,将编码序列大小分别为1653 bp和1245 bp的PPRV F、H基因片段分别克隆至原核表达载体p GEX-4T-1中,构建重组质粒p ET-30a(+)-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H。将各表达质粒转化宿主菌Transetta(DE3),表达条件经优化后最终确定为0.4m M IPTG和37℃条件下诱导表达4h,经SDS-PAGE分析结果显示重组质粒p ET-30a(+)-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H在大肠埃希菌中分别诱导表达出分子质量为61 k D、66 k D和60 k D的重组蛋白,大小与预期相符,主要以不溶性包涵体形式存在。Western blot鉴定结果显示M、F、H重组蛋白均能被绵阳抗PPRV多克隆抗体特异性识别。以经Ni-NTA亲和层析纯化后的M、F和H重组蛋白分别免疫昆明鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV M、F和H蛋白多克隆抗体,为后期鉴定重组杆状病毒奠定了基础。第2章:小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,构建了含有双目的基因的重组杆状病毒rp FB-2M、rp FB-2F和rp FB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,可见特异性荧光;以叁种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。电镜下可以到80-100nm左右的病毒样粒子,且表面纤突明显。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38k D,59k D和68k D左右的条带,表明基质膜蛋白与两种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠可诱导产生保护性中和抗体。第3章:China/tibet/geg/07-30株PPRV病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了PPRV China/tibet/geg/07-30株(Gen Bank Access No.FJ905304.1)M、F、H和N基因,构建了含有双目的基因的重组杆状病毒rp FB-2M、rp FB-2F、rp FB-2H和rp FB-2N。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,可见特异性荧光;以四种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38k D,59k D,68k D和58k D左右的条带,表明基质膜蛋白、核衣壳蛋白与两种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠和山羊可诱导产生保护性中和抗体。免疫VLPs的小鼠触发显着增多的分泌IFN-γ或IL-4的CD4+T和CD8+T细胞;免疫PPRV弱毒的小鼠触发显着增多的分泌IL-4的CD4+T和CD8+T细胞;VLPs诱导产生强大的特异性Ig G2a抗体反应,倾向于Th1型免疫应答;与之相反,PPRV诱导产生更多的Ig G1抗体反应,倾向于Th2型免疫应答;VLPs促进B细胞和DC募集和/或活化,T淋巴细胞增殖和活化,因此,PPRV VLPs具有开发成为安全有效的新型动物疫苗的潜能。第4章:China/tibet/geg/07-30株PPRV病毒样颗粒在High5细胞中的高效表达及其免疫原性研究以期利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统比较病毒样颗粒在High5细胞和Sf9细胞中的表达量,本研究扩增了PPRV China/tibet/geg/07-30株(Gen Bank Access No.FJ905304.1)M、F和H基因,构建了含有目的基因的重组杆状病毒rp FB-M-F-H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,都可见特异性荧光,表明基质膜蛋白与两种囊膜糖蛋白在两种细胞中得到表达;间接免疫荧光试验、Western blot检测及血凝试验试验结果总体表明High5细胞更能高效的包装病毒样颗粒,产量要高于Sf9细胞。以重组杆状病毒感染昆虫High5细胞和Sf9细胞组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。后期将High5细胞生产的病毒样颗粒免疫小鼠和可诱导产生保护性中和抗体和细胞免疫。
崔艳[9]2008年在《犬2型腺病毒六邻体蛋白结构分析、改造及其基因转移载体的研究》文中认为重组腺病毒基因转移载体被广泛应用于基因治疗和重组疫苗研究领域。目前,动物腺病毒常被应用于相应易感动物重要疫病的重组疫苗研究,并已显示出良好的安全性。本实验室在前期工作中,建立了以犬2型腺病毒(CAV-2)为载体表达狂犬病病毒弱毒株SRV9糖蛋白的重组CAV-2疫苗,免疫试验结果表明,该重组疫苗可诱导动物机体产生针对狂犬病病毒的具有保护水平的中和抗体。该重组腺病毒是针对复制非必须区E3区进行缺失并插入外源基因,外源基因只能以分泌形式进行表达,与完整的病毒颗粒相比,外源蛋白诱导的抗体水平较低,虽然已达到国际要求的保护水平,但仍有进一步提高的空间和必要。重组病毒免疫中和抗体水平较低的原因是多方面的,在很大程度上与外源蛋白产量不高以及相当数量的靶动物机体本身携带的抗腺病毒抗体相关。因此,本研究进行了以犬2型腺病毒主要衣壳蛋白——六邻体为基础表达外源性抗原表位的基因转移载体的探索性研究。腺病毒衣壳由叁个主要衣壳蛋白构成:六邻体、纤突和五邻体基质。六邻体,是结构最大、数量最多的腺病毒衣壳蛋白,构成整个病毒粒子的衣壳表面。在成熟病毒粒子中,六邻体是以单体叁聚化形成病毒的二十面体结构,因此每个病毒粒子共含有720个拷贝。人的2型和5型腺病毒晶体结构已经得到实验解析,每个六邻体单体的基底部由两个β折叠基序构成,从基底延伸出叁个长环形成了分子顶端的“塔”区,形成病毒粒子的外部。比较不同血清型腺病毒六邻体蛋白发现,凸出于衣壳表面的环相对应的序列在氨基酸顺序和长度上都缺乏保守性,这些非保守区序列被称为超变区。基于人腺病毒不同血清型六邻体序列比对的早期研究,认为在六邻体蛋白分子中存在七个超变区,最近文献中报道了更精确的人2型腺病毒超变区的位置,并且发现第7超变区是由叁个独立的非保守区构成,因此超变区数目最终确认为九个。研究表明超变区不参与维持六邻体结构的完整性,因此假设对其氨基酸残基进行修饰改造不会影响病毒的包装。近来已有许多关于人腺病毒六邻体超变区改造成功的报道,分别是在不同超变区插入或替换为不同长度的外源序列肽段,突变后显示重组病毒的形成、稳定性和天然受体介导的病毒感染等生物学特性同原始病毒相近,并且能够检测到外源基因以不同程度和形式的表达。为了探索以犬2型腺病毒六邻体蛋白为基础基因转移载体研究的可行性,建立一种犬腺病毒抗原表位展示技术,本研究通过生物信息学手段分析CAV-2六邻体蛋白结构,推断超变区的位置,然后在不同超变区替换入狂犬病病毒糖蛋白线性表位,通过重组病毒的包装探索CAV-2六邻体蛋白中可修饰的区域,验证超变区的位置,从而为构建一种新型的基因转移载体,并作为抗原展示性疫苗研究奠定基础。本实验首先通过PCR分别获得犬2型腺病毒疫苗株YCA-18和弱毒株CC0710六邻体蛋白基因,进行克隆及测序,并推导氨基酸序列,与其它已知不同血清型的哺乳动物腺病毒六邻体蛋白序列进行比对,利用蛋白质同源模建方法预测CAV-2六邻体蛋白的二级、叁级结构,与已经实验方法解析的人2型和5型腺病毒六邻体蛋白结构进行比较分析,推导出CAV-2六邻体蛋白超变区的可能位置。根据不同超变区在六邻体蛋白中所处的空间位置,选择位于蛋白表面的第2、3、5和7超变区作为改造靶点。在本实验室前期构建的CAV-2感染性全基因组质粒pPolyII-CAV-2的基础上,通过重迭延伸PCR方法对超变区内的氨基酸残基进行缺失并替换为狂犬病病毒糖蛋白中和性线性表位WSPIDI,并在两侧加入柔性氨基酸LGS,分别构建了基于上述四个超变区的犬2型腺病毒六邻体蛋白基因转移载体。最后,通过脂质体介导重组全基因组转染MDCK细胞。在严格控制重组CAV-2全基因组质粒质量的情况下,虽经多次和重复转染,未能检测到重组腺病毒粒子的产生。Western-blotting分析转染后细胞,结果能够检测到六邻体蛋白的表达,说明CAV-2重组全基因组能够在转染体系中进行复制、转录和翻译功能,进一步说明腺病毒包装可能是影响无法获得重组病毒的重要因素。重组CAV-2六邻体蛋白空间结构模建分析发现,HVR2,HVR3和HVR5的突变导致loop1整体结构发生松散或紧缩的趋势,其中HVR2区域在缺失插入后形成一个多余的α螺旋,HVR3和HVR5在突变序列后侧可能的一个β折叠结构变为无规卷曲。HVR7位于loop2表面,天然二级结构预测为无规卷曲,在替换入线性表位后,出现一个额外的β折叠结构,引起loop2顶端构象改变。另外,在六邻体loop中存在多个表面衣壳蛋白相互作用位点,改造区域引起的局部空间构象改变,可能使得六邻体蛋白单体之间以及与其他蛋白相互对接的部位发生变形、错位,HVR2中的156～159位氨基酸位于六邻体蛋白的相互结合区域,其氨基酸残基被缺失替换后可能影响六邻体蛋白单体之间的相互作用力。综上所述,基于人2型和5型腺病毒六邻体成功改造实例所设计的上述四个位点的突变修饰,不能成功包装出重组病毒颗粒。从结构水平分析原因,改造可能影响了CAV-2六邻体蛋白局部空间构象和蛋白之间的相互作用,导致其包装过程受阻,最终未能获得重组CAV-2。本实验对CAV-2六邻体蛋白结构和超变区位置的分析,以及进行的CAV-2结构蛋白基因转移载体的研究,为下一步构建新型展示性犬2型腺病毒基因转移载体提供理论和实验基础。
李业伟, 杨洋, 刘晔, 王景龙, 孙程龙[10]2012年在《狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定》文中进行了进一步梳理目的构建狂犬病病毒(Rabies virus,RV)SRV9株糖蛋白(Glycoprotein)基因的重组伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV),并进行鉴定。方法将SRV9株糖蛋白基因表达盒和报告基因Lac Z表达盒克隆至转移载体p8AA中,构建转移质粒p8AA-LacZ-G,与PRV Bartha-K61株基因组共转染BHK-21细胞,待细胞发生病变后,收集病毒液,进行多轮蓝色噬斑筛选,获得重组病毒rPRV-LacZ-G,对其进行电镜观察、PCR及Western blot鉴定,并测定重组病毒的滴度。结果酶切及测序鉴定证实,转移质粒p8AA-LacZ-G构建正确;电镜观察显示,重组病毒rPRV-LacZ-G呈典型的PRV特征结构;PCR分析显示可见RV 1 790 bp的特异性条带;Western blot显示,重组病毒可与SRV9株糖蛋白单抗发生反应,形成特异条带;经测定,重组病毒的滴度为106.25TCID50/ml,较Bartha-K61亲本株的滴度(107TCID50/ml)下降。结论成功构建了RV SRV9株糖蛋白基因重组PRV rPRV-LacZ-G,为其应用于兽用狂犬病疫苗的开发奠定了基础。
参考文献：
[1]. 犬2型腺病毒基因重组活疫苗的基础研究[C]. 邱薇, 扈荣良, 夏咸柱. 新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展（上册）. 2001
[2]. 犬2型腺病毒基因重组活疫苗的基础研究[D]. 邱薇. 中国人民解放军军需大学. 2001
[3]. 虎源和狮源H5N1亚型流感病毒进化分析与HA基因重组犬2型腺病毒构建研究[D]. 高玉伟. 吉林大学. 2006
[4]. 猪带绦虫六钩蚴TSOL18基因重组犬腺病毒2型活载体疫苗的基础研究[D]. 胡志敏. 新疆农业大学. 2006
[5]. PRRSV GP5与M蛋白重组犬2型腺病毒的构建及其免疫特性研究[D]. 蔡锦顺. 吉林大学. 2010
[6]. 犬2型腺病毒活载体构建的基础研究[D]. 张祖维. 山西农业大学. 2004
[7]. 转移因子增强犬细胞免疫功能的作用机理研究[D]. 孔庆波. 西北农林科技大学. 2005
[8]. PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究[D]. 闫飞虎. 中国人民解放军军事医学科学院. 2016
[9]. 犬2型腺病毒六邻体蛋白结构分析、改造及其基因转移载体的研究[D]. 崔艳. 中国人民解放军军事医学科学院. 2008
[10]. 狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定[J]. 李业伟, 杨洋, 刘晔, 王景龙, 孙程龙. 中国生物制品学杂志. 2012
标签：生物学论文; 畜牧与动物医学论文; 细胞免疫论文; 腺病毒论文; 重组蛋白论文; 质粒载体论文; 细胞转染论文; 基因结构论文;