张伟[1]2004年在《硫嘌呤甲基转移酶的多态性及血液透析对其活性的影响》文中研究指明硫嘌呤甲基转移酶(thiopurine methyltransferase,TPMT)是一种胞质酶,主要催化芳香及杂坏类化合物如6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、咪唑硫嘌呤(azathioprine,AZA)、6-硫鸟嘌呤(6—thioguanine,6-TG)的甲基化反应。6-MP和6-TG在临床上主要用于抗肿瘤、自身免疫性疾病、实质器官移植术后的免疫抑制治疗,两者均为无活性的前药,需要在体内代谢生成硫鸟嘌呤核苷酸(thioguanine nucleotides,TGN)后才能产生细胞毒效应,TPMT催化的甲基化代谢可减少活性TGN的生成。大量人群调查显示红细胞TPMT表现为常染色体共显性遗传特征,其遗传多态性导致活性呈多态分布。在白种人中TPMT活性呈叁态分布:0.3%呈无活性,11%中等活性,其余为高酶活性。TPMT的活性是由位于人体第6对染色体上的一对等位基因(6p22.3)决定的,它由9个内含子和10个外显子组成。酶活性的降低或缺乏与其等位基因的突变密切相关。决定高TPMT活性的野生型等化基因称为TPMT~*1。迄今为止,已发现11种导致酶活性降低或丧失的突变等位基因。TPMT~*2、TPMT~*3A、TPMT~*3B和TPMT~*3C代表了不同人种80-95%的基因突变类型,所以本研究的基因型检测主要针对这几种突变。咪唑硫嘌呤是MP的前药,由于其与环孢素相比具有成本低和肾毒性较小的优点,近年来倡导在肾移植病人更多地使用咪唑硫嘌呤,但遗传所致的TPMT缺陷病人,肾移植术后应用常规剂量的硫嘌呤类药物,可能并发严重的造血系统疾郑州人学2004届硕卜学位论文硫嗓吟甲人铸专移酶的多态性及}rll液透析对其活性的影响病,甚至死亡。因此,TPMT的遗传多态性便成为影响肾移植术后免疫抑制剂治疗的一个重要因素。为此,本课题研究了河南地区汉族人TPMT的多态性和部分等待肾移植的尿毒症病人TPMT的基因型、表型及血液透析对TPMT活性的影响,以期为尿毒症病人肾移植术后免疫抑制剂的个体化用药提供临床治疗依据。方法1 TPMT基因型分析健康志愿者140例,_互无亲缘关系,河南地区汉族人,均为本校学生,男%例,女44例,平均年龄22.1月.2岁,4个月内无输血史、疾病史、外伤史、服药史;30例慢性尿毒症患者,男性16例,女性14例,平均年龄32士9.65岁,采血前一个月未输注红细胞。SDS一蛋白酶K一酚一氯仿法提取基因组DNA,采用等位基因特异性的PCR(allele speeifie pCR,AspCR)检测TpMT“l和TpMT*2,限制性片段长度多态性一PeR(:estriction fragment length polymo甲hism,pCR一RFLp)分别检测TPMT*3A、TPMT“3B不11 TPMT“3C。2 TPMT表型分析2.1血标本处理在已确定TPMT基因型的健康志愿者中筛选30例,其中TPMT*1型28例,TPMT*3C型2例;30例尿毒症患者均为TPMT*1型。健康志愿者和尿毒症患者血液透析前及透析后4小时各抽取肘静脉血sml,血样置于肝素铿管中抗凝后,6小时内低温离心分离红细胞,生理盐水洗涤两遍,离心弃上清,红细胞计数(用生理盐水稀释至4xl扩cells/ml),加入4倍冷蒸馏水裂解红细胞,离心后取上层透明液,置于一20℃保存。2.2酶活性的测定采用改良的高效液相色谱法测定红_细胞TPMT活性,用37℃每小时内每毫升红细胞催化生成1纳摩尔6一MMP来表示TPMT酶的1个活性单位。取样品解冻后,加入Chelex 1 004℃振荡lh后离心,取上清。每1 ml土清加入150林l(o.3M,pH 7.5)的磷酸盐缓冲液,80林l别嘿吟醇(终浓度58林M),一3一郑州大学200,1届硕1学位论文硫呼吟甲纂转移酶的多态性及lfll_液透析对共活性的影响3如1一硫苏糖醇(终浓度1090林M),20贝S一腺营一L一蛋氨酸(s一adenosyl一L-metionine,sAM)(终浓度29林M),x 00林l浓度0.IM6一Mp后在37oC水浴中振荡Zh后放冰仁停正孵育。上述1 ml混合物加入7ml的乙酸乙酷,妈旋振荡smin,离心.取卜清液5 ml氮气吹干。用300川流动相溶解残渣后,取20川进样分析。3统计学处理两样本比较作t检验,p<0.05表示差异有显着性。结果1河南地区汉族人TPMT基因型分析140例健康志愿者作基因型分析,其中TPMT*1 138例,TPMT* 3C2例,未发现其他变异基因型。TPMT“3C基因突变频率为1 .4%。2 TPMT表型分析140名健康志愿者TPMT的活性呈一相分布,范围为7.49一28.49U/m!pRBcs。平均活性为16.63士3.56U/ml pRBCs,低活性与正常活性分界点lo.OU/mlpRBCs,币常活性和低活性者分别为138名(98.6%)和2名(1.4%),未发现酶缺乏者。3基因型与表型的相关性丁PMT“1 138例,经活性检测为高活性:TPMT*3C2例为中等活性;未发现活性缺乏者。结果显示TPMT的基因型和表型具有相关性。4尿毒症病人TPMT血液透析对TPMT活性的影响30例尿毒症患者均为TPMT*1。TPMT酶活性在血.液透析前平均为(223士6.7) u/mlpRBcs,透析后4小时TPMT活性接近正常水平,平均为(17.1士4.0) u/mlpRBcs,血液透析前后酶活性经统计学处理有显着性差异切<0 .05)。一4一郑州人学2004届硕{学位论文硫喋吟甲纂转移酶的多态性及Jtjl液透析对土U活性的影响结论TPMT基因型分析发现2例TPMT*3C,突变频率较低(l .4%),未检测出其他基因突变类型。TPMT活性呈二相分布,基因型与表型具有相关性。尿毒症病人TPMT活性土调,血液透析可使TPMT活性接近正常水平。4.针对TPMT的多态性对患者
张璘[2]2005年在《版纳微型猪近交系与人肝脏合成蛋白功能匹配研究》文中指出供器官严重短缺是当今移植界所面临的两大难题之一。猪到人异种移植无疑为解决器官短缺这一矛盾提供新的思路。近年随着免疫学机制及猪到人异种移植基础研究的不断深入和基因改造技术的不断改进,已证实猪与人免疫学差异和排斥反应有望得到攻克。但目前国际上有关猪与人脏器生理功能匹配性研究仍鲜有报道。 肝脏不仅是机体最大的解毒器官,生物转化、代谢、分泌和排泄机体内、外源代谢产物及药物,清除机体有毒物质。还是机体最主要的生物合成器官,合成白蛋白、球蛋白,凝血、纤溶和抗凝等血浆中大部分蛋白质,执行着极其重要的生理功能。异种移植术后,供猪肝脏能否替代人肝脏执行常规生理合成功能,能否清除机体内、外源性代谢产物,能否代谢和排泄术后长期大量使用的免疫抑制剂、抗菌及抗病毒药物,都是异种移植能否最终走上临床必须回答的问题。本研究以版纳微型猪近交系(Banna Minipig Inbred Line,BMI)为研究对象,分别测定BMI和人常规肝脏功能及肝脏合成蛋白潜在功能,比较BMI与人肝脏分泌、代谢能力,肝脏合成蛋白含量和功能差异。结果显示:BMI血清总胆红素和直接胆红素水平仅为人1/5-1/3;肝脏酶学水平均较人高,门冬氨酸
参考文献：
[1]. 硫嘌呤甲基转移酶的多态性及血液透析对其活性的影响[D]. 张伟. 郑州大学. 2004
[2]. 版纳微型猪近交系与人肝脏合成蛋白功能匹配研究[D]. 张璘. 四川大学. 2005