【摘 要】目的：本文结合《中华人民共和国药典》对平时工作中检查粉针剂的细菌内毒素在实际操作中发现的和需要注意的问题进行了归纳总结，以保证实验的准确性和有效性。
【关键词】药品；粉针；细菌内毒素
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，检查药品和医疗器械内毒素限量，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。《中华人民共和国药典》1995年版已将此方法作为法定标准收载，2015版《中华人民共和国药典》又将细菌内毒素检查法进行修订。根据多年实际工作经验，笔者认为在细菌内毒素检查中应注意以下问题。
1、实验环境
药典规定试验过程中防止微生物污染，对环境没有详细规定，但在实际实验过程中，实验室应保持洁净，最好是在洁净台上操作，且附近不要有人员随意走动，操作人员要穿戴灭菌口罩，带上无菌手套，动作要仔细，不要碰触安瓿瓶，防止微生物污染[1]。
做实验前一次性安瓿瓶和内毒素检查用水安瓿外壁用75%酒精棉花球擦拭消毒，且要等酒精挥发完方可打开安瓿，以免影响实验结果，取鲎试剂时轻弹瓶壁，使粉末全部落入瓶底，用一次性枪头缓缓吸入细菌内毒素检查用水注入鲎试剂瓶，用封口膜封闭好，放入涡旋仪涡旋15分钟，使其充分溶解整个过程中避免强烈震荡。
2、试验器具
试验过程中所有器具都应符合细菌内毒素要求，之前检查用器皿是重复利用的，每次使用前均需要进行消毒灭菌处理，耗时耗人力，且容易处理不当引起污染，现实验均使用一次性器具，且均符合细菌内毒素检查要求，在打开一次性无菌枪头时，要注意人手直接触碰枪头，防止造成枪头污染，影响实验结果。在检查不同批次药品时，要及时更换新的枪头，以免污染下一批药品。
3、试剂与供试品
3.1供试品溶液的制备
药品中的粉针一般都是将药物与试剂混合后，经消毒干燥形成的粉状物品装入安瓿中，所以实验前需要进行溶解稀释过程，一般用细菌内毒素检查用水稀释，检查用水要符合灭菌注射用水标准，内毒素含量小于0.005EU/ml。其规格一般为2ml，5ml，100ml选择，当实验室中做大批量的检品时，建议选择100ml规格的检查用水，一方面可以减少污染，另外一方面可以保持实验的一致性。有些粉针是压缩冻干品，溶解过程中可能会有结块的现象，要避免大力振摇，可以把瓶口用封口膜封闭好后放在涡旋仪上轻轻涡旋若干分钟，待其完全溶解，溶液至清澈方可。
3.2 鲎试剂的保存和选择
鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测［2］。冻干的鲎试剂应保存在2～8℃下，一般储存在医用冷藏箱中，防止长时间放置在高于25℃的温度条件下导致因贮藏不当，质量下降引起的误差，且整个实验应控制在2个小时之内，防止鲎试剂的质量下降影响实验结果。现市售的鲎试剂灵敏度有0.125Eu/ml，0.25 Eu/ml，0.5Eu/ml等，选择合适的鲎试剂对实验的成功与否有着至关重要的作用。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆一般遵循着简化“稀释步骤”的原则来选择，特殊的品种区别对待。
3.3 最大有效稀释倍数（MVD）的确定
粉针是通过MVD时的供试品浓度来确定，即最小有效稀释浓度，公式为
C=λ/L
以注射用头孢哌酮钠（按C25H27N9O8S2计算1.0g）为例，《中国药典2015年版二部》规定，每1mg头孢哌酮中含内毒素的量应小于0.050EU，即L值为0.050EU/mg，λ为鲎试剂的标示灵敏度，取灵敏度0.25EU/ml的鲎试剂，则最小有效稀释浓度
C=λ/L=0.25EU/ml/0.050EU/mg=5mg/ml
即注射用头孢哌酮钠（按C25H27N9O8S2计算1.0g）稀释到5mg/ml，即200倍；
取本品 1 支，加内毒素检查用水 5 ml，混匀，备用（浓度 200 mg/ml）①，
取上液 0.2 ml，加内毒素检查用水 1.8 ml，混匀，备用（浓度 20 mg/ml）②，
取上液 0.2 ml，加内毒素检查用水 0.2 ml，混匀，备用（浓度 10 mg/ml）③，
取上液 0.3 ml，加内毒素检查用水 0.3 ml，混匀，即得（浓度 5 mg/ml）④。
值得注意的是，由于实验要制备供试品阳性对照溶液，要求最终供试品溶液的浓度与供试品阳性对照溶液中供试品的浓度保持一致，则稀释过程中步骤③和步骤④为2倍的关系，制备供试品阳性对照溶液时取步骤③储备液加上等量的内毒素标准溶液即可。
4结果判定
内毒素检查须阴性对照溶液均为阴性，供试品阳性对照溶液和阳性对照溶液均为阳性，试验方为有效 供试品溶液管均为阴性，判供试品符合规定，如均为阳性，判供试品不符合规定 若有一管为阴性，另一管为阳性，需进行复试，复试时供试品溶液需做4 支平行管，若均为阴性，判供试品符合规定，否则判供试品不符合规定[3]。
5讨论
5.1实验室温度不易过高，以免反应提前，影响结果。水浴温度应在（37±1）℃，时间为（60±2）分钟。否则影响实验结果。
5.2检测时试管应竖直放置，保温和拿取试管过程应避免受到振动，造成假阴性结果。保温 1 个小时后，将试管轻轻取出，缓慢倒转180°，凝胶不变形，不从管壁滑落为阳性。如果动作幅度较大将影响结果。
5.3 对于已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放置在冰冷的表面上或于2～8℃的冰箱内存放24h以内；亦或在复溶并冻结后将其放在-20℃，可存放28天，但只能复溶一次。
参考文献：
[1]盈坤，房霞，雷光.细菌内毒素检查法中应注意的问题[J].医药导报，2006，25（11）：1217-1218.
[2]姚 巍，杜宏伟.鲎试剂检测细菌内毒素的体会[J].科技论坛，2015，2（22）：45．
[3]张义伟．细菌内毒素检查的几点体会［J］.中国实用医药，2010，5（3）：86-87.
论文作者:许倩,郑正,蒋菲
论文发表刊物:《中国蒙医药》2017年第11期
论文发表时间:2017/9/28
标签：内毒素论文; 细菌论文; 试剂论文; 溶液论文; 用水论文; 阳性论文; 浓度论文; 《中国蒙医药》2017年第11期论文;