阚方明[1]2017年在《HBV相关肝纤维化组织的蛋白质组学和转录组学研究》文中进行了进一步梳理研究背景:肝纤维化(Liver fibrosis)是一种世界范围内的高发病率与高死亡率的肝脏疾病,由于肝纤维化具有可逆性,针对肝纤维化的研究已成为近年来肝脏疾病研究的热点。乙型肝炎病毒(HepatitisB virus,HBV)感染是引起肝纤维化的重要因素之一。但是,HBV持续性感染引起的肝纤维化的机制仍未明确。因此,进一步阐述HBV相关肝纤维化的分子机制,对于诊断和治疗具有重要的意义。目前,蛋白质组学和转录组学在肝脏及其相关疾病研究中得到了广泛的应用。应用蛋白质组学方法,已经鉴定到了一系列与肝纤维化相关的分子标志物,肝纤维化的机制也被不断完善。高通量测序技术(RNA-Seq)也被广泛应用于疾病发病机制的研究以及分子标志物的筛选等方面。但是,将RNA-Seq技术应用于HBV相关肝纤维化发病机制研究的报道尚少。因此,综合利用高通量的蛋白质组学和转录组学方法,研究肝纤维化过程中基因和蛋白质的变化,将有助于发现新的潜在的分子标志物,并进一步阐述肝纤维化的分子机制。研究目的:1、应用蛋白质组学方法,分析HBV持续性复制并伴有肝纤维化的模型小鼠肝脏组织中蛋白质的表达变化,鉴定出与肝纤维化相关的差异表达的蛋白质。2、应用转录组学方法,分析HBV持续性复制并伴有肝纤维化的模型小鼠肝脏组织中基因的转录变化,鉴定出与肝纤维化相关的差异转录的基因。3、运用生物信息学方法综合分析蛋白质组学和转录组学数据,进一步阐述HBV相关的肝纤维化的分子机制。实验方法:1、将AAV8-1.2HBV重组病毒尾静脉注射C57BL/6小鼠。在AAV8-1.2HBV重组病毒注射后的不同时间点采集小鼠血液及肝脏组织样本,检测血清和肝组织中HBV DNA以及肝纤维化相关指标的变化,通过免疫组织化学染色等方法分析模型小鼠肝组织的病理变化及肝纤维化进程。2、在AAV8-1.2HBV重组病毒注射后的1、3、6个月,对小鼠肝脏组织总蛋白质进行二维凝胶电泳分析。经过图像分析后,采集差异表达的蛋白质点,进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定;对差异表达的蛋白质进行gene ontology、KEGG pathway以及蛋白与蛋白相互作用分析。3、在AAV8-1.2HBV重组病毒注射后的1、3、6个月,采集小鼠肝脏组织样本并提取总RNA、构建cDNA文库。使用2x150bp配对末端构型进行测序并与参考基因组比对。测序结果进行基因表达水平分析,获得差异基因,并进行gene ontology、KEGG pathway以及蛋白与蛋白相互作用分析。4、综合分析转录组学和蛋白质组学结果,找到重迭的差异表达的蛋白质,并进行DAVID聚类分析以及Western Blot和RT-qPCR验证。通过生物信息学分析,进一步阐述HBV相关肝纤维化的机制。在HSC LX-2细胞系中,应用RT-qPCR和siRNA技术对炎症相关基因Nlrp1进行初步的研究。结果:1、AAV8-1.2HBV重组病毒注射后的1～6个月,小鼠的肝脏组织和血清中均可以检测出较高浓度的HBVDNA,模型小鼠表现出病毒血症。病理切片及肝纤维化指标检测显示,小鼠肝组织没有明显的急性炎症反应,但是出现了慢性炎症反应和肝脏脂肪变性,HBsAg和HBeAg积累,肝组织形成了肝纤维化。2、通过蛋白质组学分析,鉴定出173个差异表达的蛋白质。生物信息学分析表明,差异表达的蛋白质主要定位于细胞的线粒体,参与了 Reactive oxygen species、ATP的合成等生物过程,并且被富集在NOD-like receptor signaling pathway、RIG-I-like receptor signaling pathway 以及 apoptosis 等信号通路中。蛋白与蛋白相互作用结果显示,差异表达的蛋白在氨基酸代谢,免疫调节和氧化应激反应中发挥作用。3、通过转录组学分析,共鉴定到213个一致上调转录的基因以及109个下调转录的基因。生物信息学分析表明,一致上调转录的基因主要参与酸代谢,被富集到了细胞外组分中,并且参与了 Drug metabolism-cytochrome P450等信号通路;一致下调的基因主要参与了脂质代谢,并且被富集到过氧化物酶体及微体中,主要参与了脂肪细胞因子等信号通路;蛋白与蛋白相互作用结果显示,PI3K/AKT、JaK/STAT等信号通路异常。4、将差异表达的蛋白与差异转录的基因进行匹配分析,发现28个重迭的差异表达的蛋白质。28个重迭的蛋白高度富集到谷胱甘肽代谢、氧化还原反应、天然免疫以及Wnt信号通路中。参与氧化压力调控的蛋白质CAT、GSTP1、PRDX1、NXN、BLVRB以及IDH1的转录和表达均发生了明显的改变。上述蛋白质可能通过泛素化修饰来调节其活性,特别是UBC可能是重要的调节蛋白。在HSCLX2细胞系中,沉默Nlrp1能够抑制TGF-β1的表达。结论:1、本研究建立了乙型肝炎病毒持续性复制并伴有肝纤维化的小鼠模型,该模型表现出病毒血症、慢性炎症以及肝脏的脂肪变性和肝纤维化,与人乙型肝炎病毒慢性感染所引起的肝纤维化更为接近,为慢性乙型肝炎相关的肝纤维化机制的研究提供了良好的动物模型。2、本研究应用蛋白质组学和转录组学方法,从蛋白质和RNA两个水平对HBV相关肝纤维化的发病机制进行了分析,揭示了氧化压力在肝纤维化生成过程中的重要作用,以及CAT、BLVRB、NXN、PRDX1以及IDH1对氧化压力的调控作用。这一结果为深入理解HBV相关肝纤维化的发生发展机制奠定了基础。3、在肝纤维化机制的初步研究,应用siRNA沉默Nlrp1能够抑制TGF-β1的表达。
强晖[2]2003年在《肝纤维化相关基因的筛选及其功能初步研究》文中研究表明研究背景及目的 肝脏损伤与肝纤维化的关系密切，各种病因所致的肝脏损伤引起局部的炎症，继而成纤维样细胞增生并由此导致肝内细胞外基质成分(extracellular matrix,ECM)异常沉积形成肝纤维化。肝纤维化是慢性肝病共有的重要病理特征，也是进一步向肝硬化发展的主要中间环节，属可逆性病变。目前对肝硬化尚缺乏有效的治疗手段，因此对肝纤维化的研究成了近20年世界医学攻关的一个热点。有关肝纤维化发生机制的研究取得了长足的进展，但迄今为止肝纤维化发生的确切机制尚未明确，阐明肝纤维化发生机制并寻求有效的治疗方法具有重要临床意义。 肝纤维化发病机制的复杂性日趋明显，需要用更新的技术手段来阐明。cDNA微阵列技术(cDNA microarray technology)，又称基因芯片技术(gene chip technology)，可同时检测成百上千个基因的表达。自从九十年代初以美国Affymetrix公司Fodor等首先开展基因芯片技术以来，该技术已被成功地应用于基因功能研究的各个领域，进行的大规模基因表达已成为研究病理生理过程的卓有成效的研究方法。但有关cDNA微阵列技术研究肝纤维化发病机制的报道极少。应用该技术寻找急、慢性肝损伤时差异表达的基因，将有助于阐明肝纤维化的发病机制，并为诊断和治疗肝纤维化提供新的靶点。为此我们进行了以下研究筛选肝脏损伤相关基因，并利用RNA干扰技术初步研究其在肝纤维化中的作用。实验包括四部分：1)cDNA微阵列筛选急性肝损伤相关基因；2)cDNA微阵列筛选肝纤维化相关基因；3)有丝分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路相关基因在肝纤维化形成过程中的表达；4)细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)基因在大鼠肝星状细胞中的作用。 实验方法 一．cDNA微阵列筛选急性肝损伤相关基因 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，分别用95％肝切除术和皮下注射四第二军医大学博士论文中文摘要氯化碳(c arbon tetrachioride，Ccl4)两种方法制备急性肝损伤大鼠模型，随机分为手术造模组(n=10)、手术对照组(n=10)、CCI;造模组(n=5)和Ccl‘对照组 (n=5)。手术造模组大鼠行95%肝切除，手术对照组剖腹牵拉肝组织后缝合，术后48hr取肝组织;CCI;造模组大鼠皮下注射60%(v/v)cCI;，CC14对照组皮下注射等体积精制橄榄油，注射后48hr取肝组织。将上述4组大鼠肝组织的mRNA提取后，制备成cDNA探针，与含1 176条大鼠基因的微阵列进行杂交及扫描，计算机数据处理分析后两组数据比较。同时比较造模组和对照组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(Al丁)、天门冬酸氨基转移酶(AST)、凝血酶原时间(PT)和肝组织病理学的变化。采用半定量逆转录聚合酶链反应(reversetranscription pol卿erase ehain reaetion，盯一PeR)验证部分基因的表达。 二.cDNA微阵列筛选肝纤维化相关基因 雄性SD大鼠85只，随机分为二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，nNIN)造模组(n=20)、DMN对照组(n=15)、CCI;造模组(n=30)和CC14对照组(n=20)，分别用DMN和cCI;诱导大鼠肝纤维化。DMN组于用药1周、2周、3周分别提取肝组织总RNA，CC14组于用药2周、4周、6周、8周分别提取肝组织总RNA，4组分别分离纯化mRNA，逆转录并用[a一33PldATp制备探针，与含1 176个基因的大鼠cDNA微阵列杂交及洗涤，信号检测，微阵列图像分析，计算机软件处理数据，将所得的数据进行比较。数据分析，总结与肝纤维化形成相关的信号通路。采用半定量RT一PCR验证部分基因的表达。 叁.MAPK信号通路相关基因在肝纤维化形成过程中的表达 采用Northem印迹法(Northem Blot)验证部分MAPK信号通路相关基因如ERK一、蛋白激酶C一eta(protein kinase C eta type，pKC一eta)和核糖体蛋白56激酶(rsbosomal protein 56 kinase，RSK)在转录水平的表达;采用免疫组织化学法检测信号通路关键基因一ERK在肝纤维化形成过程中蛋白水平的表达和定位及其与I、111型胶原表达的相关性。 四.ERK基因在大鼠肝星状细胞中的作用 免疫细胞化学法检测信号通路核心基因一ERK分别在原代培养的肝星状细胞(hepatie stellate eell，HsC)和活化的HsC株Hse一T6中的表达和定位。设计和合成针对ERKI mRNA靶序列的小干扰胭A(small inierfering RNA，51胭A)，第二军医大学博士论文中文摘要构建干扰RNA的真核表达载体，电穿孔转入HSC一T6，G418筛选建立稳定表达细胞株。对RNA干扰前后的HSC一T6，分别用RT一PCR、Westem blot及免疫细胞荧光染色法检测ERKI的表达变化;MTS检测加入血小板衍生生长因子(platelet一derived growth factor，pDGF)前后细胞增殖情况的变化;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡指数的变化。 实验结果 一cDNA微阵列筛选急性肝损伤相关基因 急性肝损伤造模组与对照组外周血转氨酶有明显差异，造模组ALT和AST较对照组升高5倍以上(尸<0.05);大鼠肝大部切除前后PT有明显差异，手术前PT为8.42士1.43 se。，手术后PT为27.46士14.08 see，手术后PT较术前组延?
李晔[3]2016年在《华支睾吸虫sPLA2相互作用蛋白质的筛选鉴定及其功能研究》文中提出华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,Cs)是一种致病性吸虫,主要由食入感染华支睾吸虫囊蚴的“鱼生”感染,成虫寄生于人及其他哺乳动物肝胆管系统,虫体的机械性刺激和分泌/排泄物可以刺激胆管上皮及结缔组织增生,引起胆道炎症、胆管阻塞、甚至胆管癌、肝硬化、肝癌,全世界均有患者发病和死亡,但主要流行于东亚地区包括中国、韩国和越南。目前中国有1300万患者左右。近年来,华支睾吸虫病发病呈上升趋势,已成为我国流行最广、危害最大的食源性寄生虫病之一,2005年广东省已将其列为重点防治的叁大地方病之一,2006年卫生部已将其列为重点防治的寄生虫病。对华支睾吸虫引起肝纤维化和肝硬化的分子机制进行深入研究,对防治华支睾吸虫病具有重要的意义。肝纤维化是由于肝细胞外基质(ECM)合成和降解失衡,ECM过度沉积而发生的,肝星状细胞(HSC)活化、增殖是肝纤维化的关键事件。已有实验证明华支睾吸虫分泌排泄产物(Cs ESP)通过使肝星状细胞活化增殖导致肝纤维化产生,还可使胆管上皮细胞(BEC)增生、癌变致胆管癌的发生,其中Cs ESP的成分之一分泌型磷脂酶A2(s PLA2)能引起HSC的活化增殖,这种作用不能被其酶活性的作用底物卵磷脂所阻断,而只能被其特异性抗体所阻断,显示Css PLA2发挥使HSC活化增殖的作用不是通过酶活性而是通过结合相关受体实现的,但与其作用的受体蛋白及其活化HSC的具体分子机制仍不清楚。因此探究华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2(Css PLA2)相互作用的蛋白质及其相关的信号通路,对进一步了解华支睾吸虫引起肝纤维化的有重要意义。研究目的和意义基于探究和华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2(Css PLA2)相互作用的蛋白质及与其相互作用相关的信号通路,对进一步了解该蛋白分子在华支睾吸虫引起肝纤维化中的作用有重要意义。本课题以下列研究为目标,初步探讨Css PLA2相互作用蛋白质的筛选与其功能:(1)酵母双杂交初步筛选出与Css PLA2相互作用蛋白质;(2)对筛选出与Css PLA2相互作用蛋白质进行免疫共沉淀、GST Pull-down等体外实验进一步验证;(3)探究Css PLA2及其相互作用蛋白质结合后对人肝星状细胞系LX2细胞效应及其可能涉及的相关细胞信号通路。研究方法1.利用酵母双杂交筛选与Css PLA2相互作用的蛋白质。构建诱饵载体(p GBKT7-s PLA2),并转化到酵母菌Y2HGold,诱饵蛋白自身激活测试、毒性测试及表达验证后,含诱饵载体的酵母Y2HGold与含人肝c DNA文库载体(p GADT7)的酵母Y187进行杂交(mating),杂交后的产物涂布于营养缺陷型培养基生长,选取生长出的酵母菌落,扩大培养提取质粒后PCR产物送测序。对测序结果进行初步分析,筛选出和Css PLA2直接相互作用蛋白质。2.免疫共沉淀(CO-IP)验证Css PLA2及筛选出的蛋白质间相互作用将Css PLA2及相互作用候选蛋白质TM7SF3分别克隆到真核表达载体p EGFP和pc DNA6,构建好的重组载体利用Lipofectamine 2000瞬时共转染转染到293T细胞,以单独转染重组Css PLA2表达载体和重组相互作用蛋白质表达载体作为对照组。转染成功后293T细胞以RIPA液裂解,细胞裂解液与Protein A琼脂糖珠在4°C共孵育过夜后离心沉淀后洗涤,再用抗c-Myc抗体及抗PLA2抗体分别进行Western blotting分析。3.GST Pull-down验证Css PLA2及筛选出的蛋白质间相互作用将Css PLA2及相互作用蛋白质TM7SF3分别克隆到表达载体p MAL-c2x和p GEX-4T-1,在大肠杆菌中表达,用亲和层析法纯化目的蛋白,并做SDS-PAGE分析。带MBP标签的Css PLA2和带GST标签的蛋白质GST-TM7SF3混合物用Amylose resin进行亲和层析纯化,以MBP蛋白、GST蛋白分别与MBP-Css PLA2混合后在Amylose resin中亲和层析纯化的产物作为对照组,纯化后的产物均用抗GST抗体进行Western blotting分析。4.对Css PLA2相互作用蛋白质在LX2细胞上进行免疫组化定位免疫组化法测定Css PLA2相互作用蛋白质TM7SF3在LX2细胞上的细胞定位,LX2细胞与或不与抗TM7SF3抗体孵育后经苏木素染色,洗涤后观察细胞染色情况及黄褐色颗粒分布位置。5.检测Css PLA2及筛选出的蛋白质对LX2细胞的作用及其涉及的相关信号通路LX2细胞分别用重组Css PLA2蛋白、重组Css PLA2及抗TM7SF3抗体混合物及PBS孵育24h后,CCK-8法分别测定LX2细胞增殖情况,实时荧光定量PCR检测TGF-β、ERK、JNK and NF-κB等与肝纤维化相关的信号通路的表达变化。研究结果1.酵母双杂交筛选与Cs PLA2相互作用的蛋白质酵母双杂交初步筛选出5个可能与Css PLA2相互作用的蛋白质,其中1个定位于细胞膜(TM7SF3)、1个为分泌蛋白质(hemopexin,isoform CRA_a)、3个定位于线粒体(metallothionein-2、aminoacylase-1 isoform b、cytochrome c oxidase subunit I)。排除定位于线粒体不能与Css PLA2直接结合的蛋白质以及分泌游离于血液中的蛋白质,选定有可能与Css PLA2直接作用的定位于细胞膜上的蛋白TM7SF3进行进一步验证。2.CO-IP验证Css PLA2及筛选出的蛋白质间相互作用重组后Css PLA2和TM7SF3蛋白均能在293T细胞中表达。单独转染p EGFP-Css PLA2的293T细胞裂解液经Protein A agarose进行免疫沉淀再洗涤后只能被抗PLA2抗体识别,单独转染pc DNA6-TM7SF3细胞裂解液经Protein A agarose进行免疫沉淀再洗涤后既不能被抗c-Myc抗体识别,也不能被抗PLA2抗体识别,只有p EGFP-Css PLA2和pc DNA6-TM7SF3共转染后的293T细胞裂解液经Protein A agarose进行免疫沉淀再洗涤后,能被抗c-Myc抗体和抗PLA2抗体同时识别,显示Css PLA2和TM7SF3蛋白存在相互作用。3.GST Pull-down验证Css PLA2及筛选出的蛋白质间相互作用MBP-Css PLA2和GST-TM7SF3在大肠杆菌中表达,相对分子质量分别约为42k Da和70k Da。只有MBP-Css PLA2和GST-TM7SF3蛋白质混合物经只能沉积含MBP标签蛋白Amylose resinpull down后的产物能被抗GST抗体识别,Css PLA2和TM7SF3蛋白存在相互作用。4.对Css PLA2相互作用蛋白质在LX2细胞上进行免疫组化定位免疫组化法测定Css PLA2相互作用蛋白质TM7SF3在LX2细胞上的细胞定位,LX2细胞与或不与抗TM7SF3抗体孵育后经苏木素染色,洗涤后观察细胞染色情况及黄褐色颗粒分布位置。只有与抗TM7SF3抗体孵育后LX2细胞显现棕黄色,且黄褐色颗粒主要集中于细胞膜上。5.检测Css PLA2及筛选出的蛋白质对LX2细胞的增殖作用及有关的信号通路CCK-8检测结果显示Css PLA2孵育24h后相比PBS对照组OD450结果显示PBS孵育组LX2细胞OD450约为1.2,Css PLA2孵育组LX2细胞OD450约为1.5,LX2细胞增殖率较PBS组升高了25%,而Css PLA2和抗TM7SF3抗体混合物孵育组LX2细胞OD450约为1.0,细胞增殖率较Css PLA2孵育组降低了33%。结果显示Css PLA2能够使LX2细胞增殖,抗体阻断TM7SF3后Css PLA2对LX2细胞增殖作用减弱,间接验证了TM7SF3和Css PLA2共同作用使LX2细胞增殖。抗TM7SF3抗体阻断TM7SF3后,Css PLA2对LX2细胞活化增殖作用受抑制。Css PLA2孵育LX2细胞24h后,相比空白对照组,肝纤维化相关信号通路,包括ERK、JNK、NF-k B、TGF-Smad等通路关键基因表达水平也上调,抗TM7SF3抗体阻断TM7SF3后,相比Css PLA2孵育LX2细胞上述通路关键基因表达水平下调。结论1.酵母双杂交筛选出和Css PLA2相互作用的人蛋白质TM7SF3等。2.免疫共沉淀、GSTPull-down进一步验证Css PLA2与人TM7SF3的相互作用。3.免疫组化对TM7SF3在人肝星状细胞系LX2细胞上定位,主要位于细胞膜。4.通过TM7SF3抗体阻断等反向验证Css PLA2致肝纤维化所涉及的相关信号通路,包括ERK、JNK、NF-k B、TGF-Smad等通路。
陈超[4]2012年在《肝纤维化相关microRNA的筛选及其功能研究》文中研究表明研究背景与目的肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化必经的病理改变。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纤维化发生、发展的关键细胞。目前研究认为静息型HSC激活转变为活化型HSC，是肝纤维化发生的中心环节。因此，肝星状细胞活化机制是目前肝纤维化防治的一个研究热点。microRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。microRNA通过碱基互补配对的方式识别靶基因mRNA，并根据互补程度的不同降解靶基因mRNA或者阻遏靶基因mRNA的翻译。microRNA参与多种生物调节途径，包括器官发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。目前国内外关于microRNA在肝星状细胞活化过程中调节作用的报道还很少。因此，本论文研究目的旨在研究microRNA在肝星状细胞活化过程中的调节作用，以深入阐明肝纤维化发病机制中microRNA的重要性，也为肝纤维化的早期干预提供新的思路。本研究通过分离大鼠原代肝星状细胞和构建DMN大鼠肝纤维化模型，应用高通量microRNA芯片技术，对肝星状细胞活化过程(静息状态—半活化状态—完全活化状态)和DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织(S0—S4期)进行microRNA谱检测，筛选并验证与肝纤维化相关的microRNA；miR-335证实在肝星状细胞活化过程中显着降低，通过构建miR-335过表达慢病毒载体，研究miR-335对肝星状细胞增殖、活化与迁移功能的影响，并探讨其可能的机制。研究共分叁个部分：⑴大鼠肝星状细胞的分离鉴定与培养；⑵肝星状细胞活化过程(静息状态-半活化状态-完全活化状态)和DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织(S0-S4期) microRNA芯片谱其生物信息学分析；⑶miR-335过表达慢病毒载体抑制肝星状细胞活化与迁移及其相关机制研究。方法一、 HSC的分离培养与鉴定雄性Sprague-Darwley大鼠(400g-600g)，分离门静脉并插管，采用酶消化—密度梯度离心法，依次灌注链酶蛋白酶—胶原酶，37℃原位消化，12%Nycodenz密度梯度离心获得HSC，含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中培养，隔天更换培养液。328nm紫外光下观察HSC自发荧光，细胞免疫荧光检测细胞Desmin与α-SMA表达，real-time PCR检测细胞TypeⅠcollagen与α-SMA表达，鉴定HSC纯度。二、肝星状细胞活化过程(静息状态—半活化状态—完全活化状态)和DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织(S0—S4期) microRNA芯片谱及其生物信息学分析(一)肝星状细胞活化各期microRNA芯片谱及生物信息学分析HSC活化各期microRNA芯片检测：肝星状细胞体外培养2天(d2)作为静息状态HSC；培养7天(d7)作为半活化状态状态HSC；培养14天(d14)作为完全活化状态HSC。差异microRNA生物信息学分析：Gene ontology (GO)分析—应用GO分析软件对差异microRNA进行功能分析，得到可能的富集功能，寻找差异microRNA可能与哪些基因功能改变相关；pathway分析—基于KEGG等数据库，得到显着富集的生物信号通路或者代谢通路，寻找差异microRNA可能与哪些细胞通路改变相关。(二) DMN肝纤维化动物模型构建、各期肝纤维化组织microRNA芯片谱及生物信息学分析DMN肝纤维化动物模型构建及肝纤维化各期肝组织microRNA芯片检测：1%DMN(10ug/kg)每周连续叁天腹腔注射，连续四周。每周处死一批大鼠，进行肝组织病理检测及肝功能检测。差异microRNA生物信息学分析：Gene ontology (GO)分析、pathway分析和microRNA-gene-network。叁、 miR-335过表达慢病毒载体抑制肝星状细胞活化与迁移及其相关机制研究(一) miR-335过表达慢病毒载体的构建及验证miR-335过表达慢病毒载体的构建：将miR-335前体结构插入pLV-CMV-MCS-GFP-FLAG miRNA表达载体(pLV-miR-335)，然后进行病毒质粒的包装、扩增与浓缩，最后形成有效的miR-335过表达慢病毒载体；miR-335过表达慢病毒载体有效性验证：以不同MOI值(MOI取5到50)将miR-335过表达慢病毒载体转染HSC，应用荧光显微镜评估其转染效率，然后应用real-time PCR的方法检测转染前后miR-335表达水平变化。(二) HSC增殖的检测在96孔培养皿内按1×106cells/ml密度种植原代HSC，无血清DMEM同步化24小时，miR-335过表达慢病毒载体转染细胞3-4天后，应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖率。(叁) HSC细胞迁移的检测1、划痕实验：在6孔培养皿内按1×105cells/ml密度种植HSC，无血清培养基同步化24小时，miR-335过表达慢病毒载体转染细胞3-4天后，用Tip(100ul)尖端同一方向垂直划痕，分别在12h和36h后显微镜下拍照，计算细胞迁移率＝(作用前划痕内面垂直距离－作用后划痕内面垂直距离)/作用前划痕内面垂直距离×100％。2、Transwell：在24孔板Transwell小室中按1×104cells/well密度种植HSC，无血清DMEM同步化24小时，miR-335过表达慢病毒载体转染细胞3-4天后，用500ul含20%FBS的培养基趋化HSC24小时，结晶紫染色，在显微镜下随机选取5个视野计算迁移细胞数目。(四) HSC活化的检测1、应用real-time PCR的方法检测肝星状细胞TypeⅠcollagen与α-SMA mRNA水平的表达；2、应用Western Blot的方法检测肝星状细胞TypeⅠcollagen与α-SMA蛋白水平的表达。四、统计学分析数据用均数±标准差表示，数据由SPSS16.0软件统计包处理。多组间的比较用One-WayANOVA方差分析。P<0.05认为有统计学差异。结果一、原代大鼠HSC的分离与鉴定1、328nm紫外光下自发荧光及Desmin、α-SMA细胞免疫荧光检测静息与活化HSC细胞纯度达95%以上，能满足实验需要。2、应用real-time PCR检测体外培养2天、7天以及14天的HSC活化标志物TypeⅠcollagen与α-SMA mRNA的表达。与2天相比，TypeⅠcollagen与α-SMAmRNA在7天时轻度升高，在14天时显着增加，因此，将HSC2d作为静息状态HSC，7d作为半活化状态HSC，14d作为完全活化状态HSC。二、DMN肝纤维化动物模型构建随着DMN给药时间的延长，肝功能逐渐降低，肝纤维化程度逐渐加重，至第四周给药后，已能观察到明显的肝硬化甚至伴有失代偿症状(出现腹水)。根据肝组织病理结果，DMN给药第一周作为肝纤维化S1期，给药第二周作为肝纤维化S2期，给药第叁周作为肝纤维化S3期，给药第四周作为肝纤维化S4期。叁、肝星状细胞活化各期microRNA芯片谱及生物信息学分析1、17个microRNA (miR-345-5p、miR-152、miR-199a-5p、miR-218、miR-125b-5p、miR-214、miR-34c、miR-34b、miR-199a-3p、miR-425、miR-221、miR-301a、miR-222、miR-193、miR-31、miR-143、miR-145)在肝星状细胞活化过程中表达逐渐升高；14个microRNA(miR-101a、miR-335、miR-877、miR-139-5p、miR-150、miR-126*、miR-192、miR-450a、rno-miR-497、rno-miR-338、rno-miR-10a-5p、rno-miR-378*、rno-miR-195、miR-126)在肝星状细胞活化过程中表达逐渐降低。2、生物信息学分析：(1)GO分析：28个GOs被肝星状细胞活化过程中上调的microRNA调节，31个GOs被肝星状细胞活化过程中下调的microRNA调节；(2)GO-Map分析：GO-Map显示最主要的GOs为神经元分化、信号转导、囊泡介导的运输、细胞处理、细胞分化、细胞增殖正向调控、应激反应、G蛋白偶联受体信号通路、蛋白质氨基酸磷酸化以及细胞迁移；(3)pathway分析：Phosphatidylinositol signaling system、Wnt signaling pathway、mTOR signalingpathway、Focal adhesion、ECM-receptor interaction、Notch signaling pathway、T cellreceptor signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、Regulation of actincytoskeleton、Insulin signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signalingpathway、Hedgehog signaling pathway等可能被肝星状细胞活化过程中上调的microRNA所调节；TGF-beta signaling pathway、mTOR signaling pathway、Wnt signaling pathway、Adherens junction、Non-small cell lung cancer、Pancreatic cancer、Bladder cancer、Phosphatidylinositol signaling system、Prostate cancer、Glioma、SNARE interactionsin vesicular transport、O-Glycan biosynthesis、Hedgehog signaling pathway、Focaladhesion、VEGF signaling pathway、MAPK signaling pathway、Insulin signalingpathway等可能被肝星状细胞活化过程中下调的microRNA所调节。四、DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织(S0-S4期) microRNA芯片谱及其生物信息学分析1、10个microRNA (miR-34b、miR-34c、miR-34a、miR-221、miR-146b、miR-214、miR-199a-5p、miR-199a-3p、miR-223、miR-324-5p)在肝纤维化过程中表达逐渐升高；5个microRNA (miR-878、miR-193、miR-378、miR-92a、miR-19a)在肝纤维化过程中表达逐渐降低。2、生物信息学分析(GO分析和pathway分析)：(1)GO分析：15个GOs被肝纤维化过程中表达上调的microRNA调节，10个GOs被肝纤维化过程中表达下调的microRNA调节。(2)pathway分析：Glycerophospholipid metabolism、Pyruvate metabolism、Lysine degradation、Proteasome、Reductive carboxylate cycle (CO2fixation)、Benzoate degradation viaCoA ligation、Riboflavin metabolism、Focal adhesion、PPAR signaling pathway、MAPK signaling pathway、mTOR signaling pathway等可能被肝纤维化过程中表达上调的microRNA调节；Butanoate metabolism、Arginine and proline metabolism、Cell cycle、Glioma、Insulinsignaling pathway、MAPK signaling pathway、Focal adhesion、Regulation of actincytoskeleton、ECM-receptor interaction、Fatty acid metabolism、TGF-beta signalingpathway等可能被肝纤维化过程中表达下调的microRNA调节。(3) microRNA-gene-network分析：得到网络中关键的microRNA以及被调控最多的靶基因。五、miR-335过表达慢病毒载体构建及验证1、应用real-time PCR技术证实，miR-335、miR-150的表达在HSC活化过程中显着下调，miR-221、miR-143、miR-145的表达在HSC活化过程中显着上调，与芯片检测结果符合。2、选取miR-335进行功能研究，构建miR-335过表达慢病毒载体，MOI值为50时，miR-335过表达慢病毒载体HSC转染效率达90%以上，real-time PCR检测miR-335过表达慢病毒载体转染HSC后miR-335的表达量增加175倍，恢复到静息状态HSC水平，证实miR-335过表达慢病毒载体构建成功。六、miR-335过表达慢病毒载体对HSC活化的影响miR-335过表达慢病毒载体转染HSC后明显抑制HSC活化标志物TypeⅠcollagen与α-SMA mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。real-time PCR和Westernblot结果显示，α-SMA mRNA和蛋白的表达被miR-335过表达分别抑制了70%和31%；TypeⅠcollagen mRNA和蛋白表达分别被抑制了53%和20%。七、miR-335过表达慢病毒载体对HSC迁移的影响1、Transwell结果显示，miR-335过表达抑制HSC迁移的40%(P<0.05)；2、细胞划痕实验结果显示，miR-335过表达抑制HSC迁移的45%(P<0.05)。八、miR-335过表达慢病毒载体对HSC增殖的影响正常组、阴性对照组、miR-335过表达组叁组细胞应用CCK-8法检测细胞增殖率，连续监测5天，叁组细胞增殖率之间无统计学差异。九、miR-335过表达慢病毒载体对TNC表达的影响1、TNC mRNA和蛋白的表达量在HSC活化过程中显着升高；2、miR-335过表达显着降低TNC mRNA和蛋白的表达量。real-time PCR和Western blot结果显示，TNC mRNA和蛋白的表达量分别被抑制了76%和74%。十、TNC对HSC迁移功能的影响给予外源性TNC (20ug/ml; CC115; Chemicon)，HSC增值率未见明显改变，但HSC迁移率提高50%。结论一、在肝星状细胞活化过程中，17个microRNA在肝星状细胞活化过程中表达逐渐升高，14个microRNA在肝星状细胞活化过程中表达逐渐降低；在肝纤维化进展中，10个microRNA在肝纤维化过程中表达逐渐升高；5个microRNA在肝纤维化过程中表达逐渐降低。生物信息学分析显示，多个和肝纤维化发生密切相关的基因功能以及细胞信号转导通路如细胞迁移、TGF-beta signaling pathway、VEGF signaling pathway等等均受到这些肝纤维化相关microRNA的调控，提示microRNA可能在细胞和组织层面上都参与了肝纤维化发生发展的调控。二、miR-335的表达量在肝星状细胞活化过程中显着降低，miR-335过表达显着抑制肝星状细胞的活化及迁移，可能是通过下调TNC的表达量而实现。
韩晓辉[5]2017年在《与肝纤维化发病相关的长链非编码RNAs的筛选鉴定及功能的初步研究》文中研究表明目的近年来,长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)的研究成为热点。已证实,lnc RNAs通过调节基因的表达参与多种生物进程。但肝纤维化发病过程中lnc RNAs的作用尚不清楚。本研究利用基因芯片分析技术分析肝纤维化模型小鼠CCl4组和正常组中lnc RNAs的表达差异,筛选出显着差异表达的lnc RNAs,并对其功能进行初步的研究,明确了lnc RNAs在肝纤维化发病及发展过程中的作用。方法1.四氯化碳(CCl4)诱导建立小鼠肝纤维化模型:将20只SPF级雄性、8周大的balb/c小鼠随机平均分成两组,一组为实验组,连续腹腔注射CCl4六周;一组为对照组,腹腔注射橄榄油;每周2次,六周后取材。2.取两组小鼠肝组织进行Haematoxylin-eosin staining(HE染色)、天狼猩红染色、免疫组织化学染色(α-SMA和Col1α1),观察其病理学改变。3.羟脯氨酸试剂盒测定实验组和对照组小鼠组织中羟脯氨酸的含量。4.q RT-PCR和免疫荧光检测实验组和对照组小鼠肝组织中α-SMA和Col1α1的表达量。通过以上试验证明肝纤维化小鼠模型建立成功。5.各选取5只正常组和肝纤维化组小鼠的肝组织送质检,质检合格后用于芯片分析。6.对芯片结果进行分析,筛选出差异表达的lnc RNAs和m RNAs。7.根据差异分析、GO分析、pathway分析、和lnc RNA-m RNA共表达分析、临近基因分析、micro-RNA结合位点分析等筛选lnc RNAs。8.建立肝纤维化小鼠CCl4模型(balb/c和C57),并对芯片结果进行验证。9.q RT-PCR检测同一lnc RNA在不同细胞(HSC、HC和kuffer)和不同器官中的表达情况。10.Coding Potential Calculator(CPC)软件分析筛选出的lnc RNAs蛋白编码能力。11.构建包含有lnc RNAs ORF区域,且带有荧光蛋白表达基因的质粒,检测是否有荧光的表达,从而确定lnc RNAs是否具有蛋白编码功能。12.利用c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)扩增c DNA的5'和3'末端并测序。13.核浆分离检测lnc RNAs在胞浆和胞核中的分布情况。14.q RT-PCR检测lnc RNAs在纤维化小鼠的原代HSCs、HCs以及正常小鼠原代HSCs培养激活过程中的表达。15.TGF-β刺激小鼠原代肝星形细胞、原代肝细胞和小鼠正常肝细胞系AML12细胞,检测lnc RNAs的表达变化。16.检测肝纤维化病人组织和血液中lnc RNA的表达情况。17.对筛选出的lnc RNA分别进行敲除和过表达,检测肝纤维化相关基因的表达情况。结果1.对照组小鼠肝脏标本质地柔软、红润有光泽、体积较小;与对照组相比,实验组小鼠肝脏标本则质地变硬、色泽度下降、表面出现结节、体积变大。2.HE染色和天狼猩红染色显示,对照组小鼠肝组织标本的肝小叶结构完整,肝细胞排列整齐且呈放射状;与对照组相比,实验组肝细胞排列紊乱,体积变大,胞质疏松呈现网状,肝小叶结构被破坏,且胶原沉积增多。3.羟脯氨酸测定结果显示,与对照组相比,实验组小鼠肝组织样本中羟脯氨酸含量增加到四倍左右。4.免疫组化、q RT-PCR和免疫荧光结果显示,实验组小鼠肝组织中α-SMA和Col1α1的表达量明显升高。5.对照组和实验组小鼠肝组织质检合格,用于后续芯片处理。6.芯片结果显示,与对照组相比,实验组有266 lnc RNAs和1007 m RNAs被上调,447 lnc RNAs and 519 m RNAs被下调。7.根据差异分析、GO分析、pathway分析、lnc RNA-m RNA共表达分析等筛选出10个lnc RNAs和10个m RNAs对芯片结果进行验证;然后综合临近基因分析、micro-RNA结合位点分析及其长度等,进一步筛选出一个上调(ENSMUST00000158992)和一个下调(NONMMUT045304)的lnc RNA进行后续研究。8.CCl4模型(balb/c和C57)小鼠肝组织的q RT-PCR结果与芯片一致,证明芯片结果可靠。9.q RT-PCR结果证明,NONMMUT045304在肝脏中富集,同时根据其在肝纤维化中的作用将其命名为lnc-LFAR1(Liver Fibrosis Associated lnc RNA1);而ENSMUST00000158992没有肝脏特异性;两者在HSCs、HCs和Kuffers中均表达。10.RACE结果显示ENSMUST00000158992长度为325bp,包含一个外显子,无poly A尾;lnc-LFAR1长度为734bp,包含一个外显子,且具有poly A尾。11.核浆定位证明lnc-LFAR1既存在于胞浆,又存在于胞核;ENSMUST00000158992主要存在于胞核。12.Coding Potential Calculator(CPC)软件分析显示,lnc-LFAR1包含有一个55aa的开放阅读框,缺少Kozak序列(转录起始的一个重要原件);ENSMUST00000158992包含有一个68aa的开放阅读框,缺少Kozak序列。13.荧光检测试验证明,lnc-LFAR1没有检测到绿色荧光,即无蛋白编码功能。14.在纤维化小鼠的原代HSCs和HCs,以及正常小鼠原代HSCs培养激活过程中检测到lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992的表达均显着增加。15.TGFβ处理后,lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992在正常小鼠的原代HSCs、HCs和AML12细胞中的表达量明显升高。16.ENSMUST00000158992在肝纤维化病人血液中表达显着增加。17.干扰掉lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992后,促肝纤维化相关基因被下调,且抑制TGFβ对上述基因的上调;过表达lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992的结果与干扰结果一致。结论1.CCl4诱导小鼠肝纤维化模型构建成功。2.与正常小鼠相比,纤维化小鼠肝组织中有266个lnc RNAs和1007个m RNAs上调,447个lnc RNAs和519个m RNAs下调。3.Lnc-LFAR1在肝脏中富集,且在纤维化小鼠肝脏中低表达;ENSMUST00000158992在肝纤维化小鼠肝组织中高表达。4.Lnc-LFAR1长度为734bp,包含一个外显子,且具有poly A尾,既存在于胞浆,又存在于胞核;ENSMUST00000158992长度为325bp,包含一个外显子,无poly A尾,主要存在于胞核;且两者均无蛋白编码能力。5.lnc-LFAR1和ENSMUST00000158992通过促进HSCs的激活进而促进肝纤维化的发生和发展。
杜静华[6]2016年在《微小RNAs差异表达对非酒精性脂肪性肝炎相关肝纤维化的影响及分子调控机制研究》文中进行了进一步梳理非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是近年发病率逐渐增加的慢性肝脏疾病,属于代谢异常相关性肝病,包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH),可进展为肝硬化或并发肝细胞癌,严重危害人类健康,因此,NAFLD早期诊断及有效治疗是防止进展为终末期肝病的重要措施。肝穿刺活检是目前诊断NAFLD的可靠方法,但由于为创伤性检查,临床应用有一定局限性。NASH相关肝纤维化是NAFLD疾病谱中重要的病理阶段,探明其发病机制,寻求特异有效的分子诊断标志及治疗靶点至关重要。Micro RNAs(mi RNAs)是长约19-25个核苷酸的非编码小RNA,由70-100nt双链茎环前体经RNA酶Dicer合成,能够识别靶m RNA的3’端非编码区(3’-untranslated region,3′-UTR),导致翻译阻遏或m RNA降解。近年来研究表明mi RNAs在NAFLD发病过程中存在差异表达,而有关mi RNAs对NASH相关肝纤维化的影响研究甚少。血红素氧合酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)是肝脏发生氧化应激损伤时,阻止炎症反应,发挥保护氧化组织损伤的关键基因,而HO-1在NASH相关肝纤维化发生发展过程中对mi RNA的作用至今未见报道。本研究通过建立NASH相关肝纤维化动物模型,应用基因芯、生物信息学、双荧光素酶报告基因、原代细胞分离培养及si RNA转染等技术方法,阐明mi RNAs对NASH相关肝纤维化的作用及机制。并进一步探讨HO-1的靶向调控对关键mi RNA的影响,观察HO-1是否能够通过调节相关mi RNA发挥对脂肪性肝纤维化的调控作用,为该病的病因探索及疾病防治提供新思路。第一部分NASH相关肝纤维化小鼠肝组织差异表达mi RNAs的筛选与验证目的:筛选及验证NASH相关肝纤维化小鼠肝组织差异表达的mi RNAs。方法:选用8周龄雄性C57BL/6J小鼠,采用胆碱-蛋氨酸缺乏(methionine-choline deficient,MCD)饮食建立NASH相关肝纤维化小鼠模型,观察小鼠肝脏生化学及肝组织病理学变化,采用Western blot技术检测小鼠肝组织纤维化相关因子的表达变化,利用LC Sciences micro RNA Microarray-20.0 Mouse mi RNA基因表达谱芯片筛选NASH相关肝纤维化差异表达mi RNAs,并采用实时定量PCR进行验证。结果:MCD饮食建立NASH相关肝纤维化小鼠模型1肝脏生化学变化:NASH相关肝纤维化小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)显着高于对照组,P<0.05。2肝脏组织病理学特征:NASH相关肝纤维化小鼠肝组织切片呈现肝细胞大泡性脂肪变性,伴点灶状坏死及炎细胞浸润,可见窦周纤维化及汇管区扩大。3肝组织纤维化相关因子的表达变化:Western blot结果显示,MCD组小鼠肝组织纤维化相关基因的表达变化与肝损伤程度相一致,伴随肝损伤程度的不断加重,纤维化相关基因转化生长因子(transforming growth factorβ1,TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Smad4、4型胶原(Collagen Type 4,Col-4)、基质金属蛋白酶2/9(matrixmetallo-proteinase-2/9,MMP-2/9)的表达显着增加,而基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP-1)、Smad7得表达显着降低。4 mi RNAs芯片结果:采用mi RNAs芯片筛选NASH相关肝纤维化肝组织中差异表达mi RNAs,筛选出37个差异表达mi RNAs,其中表达上调19个(mi R-15b-5p、mi R-150-5p、mi R-106a-5p等),下调18个(mi R-146a-5p、mi R-203-3p、mi R-130a-3p等)。5差异表达mi RNAs的验证:应用RT-PCR方法检测,结果显示NASH相关肝纤维化小鼠肝组织中mi R-15b-5p表达较对照组明显上调,而mi R-146a-5p及mi R-203-3p表达明显下调,尤以mi R-146a-5p下调显着,与芯片结果一致(P<0.05)。结论:1 NASH相关肝纤维化小鼠肝组织中mi RNAs差异表达明显,提示mi RNAs可能参与了该病的发病过程。2 mi R-146a-5p在MCD组小鼠的肝组织中表达较正常对照组小鼠明显降低,提示mi R-146a-5p可能参与了NASH相关肝纤维化的调控。第二部分差异表达mi RNAs的生物信息学分析及mi R-146a-5p的靶基因验证目的:探明差异表达mi RNAs在NASH相关肝纤维化中的靶基因及其生物学分析。方法:采用Target Scan、Pic Tar及mi Randa叁种常用的靶基因预测软件对差异表达的mi RNAs的靶基因进行预测。Gene Ontology(GO)对靶基因集合进行GO注释描述,同时应用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路数据库分析差异表达mi RNAs可能参与调节的信号通路。利用双荧光素报告基因系统验证mi R-146a-5p与其靶基因的靶向调节关系。结果:1生物信息学分析:对Target Scan、Pic Tar及mi Randa预测差异表达mi RNAs的靶基因进行GO分析结果显示,差异表达mi RNAs靶基因的功能显着富集于转录调控、转录酶活性、蛋白结合及磷酸化、Wnt信号通路及其负性调控等,而KEGG信号通路分析结果显示差异表达的mi RNAs靶基因参与的信号通路显着富集于胰岛素信号通路、凋亡、Wnt信号通路、Toll样受体信号通路及m TOR信号通路等。2 mi R-146a-5p的靶基因预测:应用叁种miro RNA靶基因预测软件(Target Scan、PITA和mi Randa)共同预测mi R-146a-5p的靶基因,其中Wnt1 3′非编码区(3′-Untranslated Regions,3′-UTR)及Wnt5a 3′-UTR均存在mi R-146a-5p的结合位点。3靶基因验证:双荧光素酶报告基因显示,与空白对照组相比,Wnt1基因3′-UTR野生型质粒与mi R-146a-5p模拟物(mimics)共转染293T细胞后,报告基因的荧光素酶活性显着降低,与mi R-146a-5p抑制物(inhibitor)共转染后,酶活性呈相反趋势改变。而mi R-146a-5p mimics、mimics control、mi R-146a-5p inhibitor、inhibitor control对Wnt1基因3′-UTR突变型质粒荧光素酶活性无明显影响。4肝组织mi R-146a-5p靶基因表达:NASH相关肝纤维化小鼠肝组织中mi R-146a-5p靶基因Wnt1及Wnt5a蛋白较正常对照组显着增多(p<0.05),与mi R-146a-5p的表达负相关。结论:1 NASH相关肝纤维化肝组织中差异表达的mi RNAs可能通过调控多种生物学功能及信号通路而影响脂肪性肝纤维化的形成。2 mi R-146a-5p能与Wnt1 3’UTR及Wnt5a 3’UTR特异性结合,提示Wnt1及Wnt5a为mi R-146a-5p的靶基因。第叁部分mi R-146a-5p在NASH相关肝纤维化中的作用及机制研究目的:深入阐明mi R-146a-5p对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)功能的调控,探明mi R-146a-5p对NASH相关肝纤维化发生发展的作用。方法:采用链霉蛋白酶-胶原酶远未消化肝脏,经Percoll密度梯度离心,分离小鼠原代HSC,分别培养1d、3d、7d。采用实时定量RT-PCR及Western blot检测原代HSC活化过程中,mi R-146a-5p及靶基因的表达变化。应用肝星状细胞系HSC-T6及LX-2细胞,将50n M mi R-146a-5p mimics及100n M inhibitor转染HSC-T6细胞,采用CCK8(Cell Counting Kit 8)测定各组细胞活力,采用实时荧光定量PCR及Western-blot分析mi R-146a-5p及靶基因、肝纤维化相关基因m RNA及蛋白的表达情况;同时利用si RNA技术沉默Wnt1及Wnt5a,实时荧光定量PCR及Western-blot分析mi R-146a-5p及靶基因、肝纤维化相关基因m RNA及蛋白的表达情况。结果:1 HSC活化过程中mi R-146a-5p及靶基因的表达变化:在HSC培养1d、3d及7d,mi R-146a-5p表达随HSC活化而逐渐降低,而靶基因Wnt1及Wnt5a的表达伴随HSC活化而逐渐增加;2过表达mi R-146a-5p对HSC增殖的影响:CCK8结果显示,转染50μM mi R-146a-5p mimics后,HSC-T6的细胞活力明显降低(P<0.01);3过表达或抑制mi R-146a-5p对HSC活化及分泌胶原功能的影响;过表达mi R-146a-5p能够显着抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、1型胶原(Collagen Type 1,Col-1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)m RNA及蛋白的表达,而增加Smad7 m RNA及蛋白的表达(P<0.01);抑制mi R-146a-5p的表达能够明显增加α-SMA、Col-1、MMP-2的表达,而抑制Smad7的表达(P<0.01)。4过表达或抑制mi R-146a-5p对HSC内靶基因Wnt1、Wnt5a及下游信号分子的影响:过表达mi R-146a-5p能够明显抑制靶基因Wnt1、Wnt5a蛋白的表达变化,而m RNA的表达无明显差异,同时其下游β-catenin、NAFT5的表达显着降低,而GSK-3β的表达显著增加;抑制mi R-146a-5p能够显着增加靶基因Wnt1、Wnt5a蛋白的表达变化,而m RNA的表达无明显差异,同时其下游β-catenin、NAFT5的表达显着增加,而GSK-3β的表达显著降低;5 si RNA沉默靶基因对下游信号通路及肝纤维化相关因子的影响:分别转染si-Wnt1及si-Wnt5a后,Wnt1及Wnt5a的m RNA及蛋白表达水平显着降低,同时其下游基因β-catenin、NAFT5的表达显着降低,而GSK-3β的表达显著增加,α-SMA、Col-1、MMP-2的表达明显降低,而Smad7的表达则明显增高。结论:1 mi R-146a-5p能够抑制HSC的增殖、活化及胶原分泌;2 mi R-146a-5p能够抑制HSC内靶基因Wnt1、Wnt5a及Wnt信号通路。第四部分血红素氧合酶-1靶向调控在NASH相关肝纤维化中对mi R-146a-5p及靶基因的影响目的:阐明靶向调控HO-1基因在NASH相关肝纤维化发病过程中对mi R-146a-5p及靶基因的影响。方法:采用HO-1激动剂血晶素(Hemin)及抑制剂锌原卟啉(zinc protoporphyrin,Zn PP)腹腔注射干预NASH相关肝纤维化小鼠模型,观察小鼠血清酶学改变及肝组织炎症、脂肪变及纤维化程度;采用实时定量RT-PCR及Western blot检测HO-1诱导或抑制对mi R-146a-5p、靶基因Wnt1、Wnt5a及Wnt信号通路关键分子、肝纤维化相关因子m RNA及蛋白的表达的影响。结果:1 HO-1对小鼠肝脏生化学的影响:HO-1激动剂Hemin能够显着降低MCD饮食喂养小鼠血清ALT、AST水平,而HO-1抑制剂Zn PP能够进一步加重肝组织损伤,ALT、AST水平进一步增高。2 HO-1对小鼠肝组织病理学的影响:肝组织病理学显示Hemin能够明显改善小鼠肝组织肝脂肪变、炎症及纤维化,而Zn PP则加重小鼠肝损伤;3 HO-1对mi R-146a-5p、靶基因及其下游信号通路的影响:Hemin能够明显上调mi R-146a-5p表达,并下调其靶基因Wnt1、Wnt5a表达,同时调控下游信号分子β-catenin、GSK-3β及NAFT5的表达;而Zn PP能够显着下调mi R-146a-5p的表达,上调Wnt1、Wnt5a、β-catenin及NAFT5的表达,而下调GSK-3β的表达。结论:1 HO-1能够减轻NASH相关肝纤维化肝损伤、炎症及纤维化;2 HO-1能够调控mi R-146a-5p及其靶基因的表达而参与NASH相关肝纤维化的发生与发展。
王静[7]2014年在《樟芝中Antrodin B分离及其抗肝纤维化的机制研究》文中研究说明肝纤维化是指由慢性炎症导致的肝组织结构变化及大量纤维瘢痕的形成，进一步可发展为肝硬化及肝癌，目前无有效药物，因此，研究抗肝纤维化药物具有现实意义。本课题通过体外细胞模型从6种药食用真菌液态发酵菌粉中筛选抗肝纤维化的化合物，并研究其抗肝纤维化的作用机制，为未来研究抗肝纤维化药物提供初步的理论依据。本论文以TGF-β1活化的肝星状细胞CFSC-8B为研究对象，通过天狼猩红染色方法检测胶原含量，构建肝纤维化细胞模型。结果表明10ng/mLTGF-β1作用CFSC-8B48h，染色液体积200μL为最佳的建模条件；利用SB431542和Silybin两个阳性药物及其它11种具有抗肝纤维化活性的化合物及蛋白质因子验证了此方法的可靠性；进而利用这一细胞筛选模型以抗肝纤维化活性为导向，通过硅胶色谱及HPLC进行分离纯化，利用紫外、质谱及核磁等技术，并和已有文献比对，从樟芝菌粉中分离并鉴定了两个单体化合物Antrodin A和Antrodin B。天狼猩红染色结果表明Antrodin B可显着抑制TGF-β1诱导的胶原生成，且具有剂量依赖性。为进一步阐明Antrodin B抗肝纤维化的作用机制，本课题使用MTT、WST-1、细胞划痕、细胞小室迁移、荧光定量PCR、蛋白质印迹等方法，分别进行了细胞活性、细胞增殖、细胞迁移、肝纤维化相关基因及信号通路中蛋白表达情况的研究，结果表明：Antrodin B与CFSC-8B共孵育48h的IC50值为59.99μM；10ng/mL PDGF-BB作用CFSC-8B细胞48h为最佳细胞增殖模型；Antrodin B在一定剂量（6、12、25μM）下，可显着抑制PDGF-BB刺激的CFSC-8B增殖，抑制PDGF-BB或TGF-β1诱导的细胞迁移，能显着抑制PDGF-BB或TGF-β1刺激的HSC活化标记α-SMA及胞外基质CollagenI、Collagen III及Fibronectin基因表达；进一步实验结果显示Antrodin B（6、12μM）可下调PDGF-BB刺激的磷酸化细胞外信号调节激酶（ERK）、磷酸化氨基末端激酶（JNK）及磷酸化丝裂原激活蛋白激酶（P38）蛋白磷酸化表达水平，也可抑制TGF-β1诱导的Smad2、Smad3蛋白磷酸化。本研究通过建立快速简便的肝纤维化体外细胞筛选模型，以活性为导向从樟芝中分离得到具有较好抗肝纤维化活性的单体化合物Antrodin B，并揭示Antrodin B可抑制PDGF-BB诱导的细胞增殖、TGF-β1及PDGF-BB诱导的细胞活化、细胞迁移及胞外基质沉积，其机制可能与负调控PDGF-BB/MAPK和TGF-β1/Smad2/3信号通路有关，Antrodin B可作为潜在的治疗肝纤维化的药物分子进行进一步研究。
王洋[8]2017年在《miR-130a-3p调节对非酒精性脂肪性肝纤维化的作用及分子机制》文中进行了进一步梳理非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是发达国家最常见的肝脏疾病。全球患病率在25%左右,我国也高达15%。NAFLD正成为全球关注的公共健康问题之一。NAFLD与胰岛素抵抗和代谢综合征有关,针对胰岛素抵抗状态的2型糖尿病而应用的治疗方法对于治疗NAFLD有一定的效果,例如控制体重,二甲双胍和噻唑烷二酮类药物的应用等。在肥胖人群中NAFLD患病率高达80%,非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)是NAFLD非常严重的病理进程,约占所有NAFLD患者15%-25%,被认为是导致肝硬化的主要原因。miRNA是内源的,非编码的约19-25个核苷酸的非编码小RNA片段。根据个体序列的不同它能够识别其靶m RNA的3’端非编码区(3’-untranslated region,3′-UTR)特异性结合位点,从而导致翻译阻遏或m RNA降解。miRNA在细胞增殖,发育,分化和凋亡中起到重要的调控作用。miRNA在许多慢性肝病的发展中也起到了重要的作用,包括病毒性肝炎,药物诱导的肝损伤和自身免疫性肝病等。本研究通过胆碱-蛋氨酸缺乏(Methionine-choline deficient,MCD)饮食建立NASH相关肝纤维化动物模型,应用m RNA芯片、生物信息学分析、双荧光素酶报告基因系统、星状细胞模型培养、实时定量PCR(QRT-PCR)、蛋白印记(Western blot)、MTT、流式细胞学、si RNA转染及靶标蛋白恢复试验等技术方法。通过肝星状细胞实验,从星状细胞活化、增殖、凋亡及胶原分泌等多方面阐明miR-130a-3p通过直接调控TGFBRs对NASH相关肝纤维化的作用及机制。本研究结果有助于肝纤维化的发病机制的深入理解,并为治疗NAFLD提供潜在可能的药物新靶点。第一部分小鼠MCD模型的NASH相关肝纤维化后肝组织差异表达miRNAs的筛选与验证目的:筛选MCD模型的NASH相关肝纤维化小鼠肝组织显着差异表达的miRNAs,并进行验证。方法:选用MCD饮食饲喂8周龄雄性C57BL/6J小鼠,构建NASH相关肝纤维化小鼠模型。评价小鼠血清生化学及肝组织病理学指标变化,选用LC Sciences micro RNA Microarray-20.0 Mouse miRNA基因表达谱芯片分析NASH相关肝纤维化差异表达miRNAs。通过统计学筛选后,采取实时定量PCR进行验证。结果:1血清ALT及AST水平,NASH相关肝纤维化小鼠MCD模型组显着高于对照组(P<0.01)。2实验小鼠肝组织病理学:MCD模型NASH相关肝纤维化小可见脂肪变性肝细胞及“风帆样膨大”现象,坏死灶偶见,伴区带不均一性增强,以叁区为主,肝窦周间隙纤维组织增生。与正常对照组差异显着。3 NASH相关肝纤维化小鼠肝组织miRNAs差异表达谱:NASH相关肝纤维化小鼠肝组织有37个差异表达的miRNAs(P<0.05),其中miR-582-3p、miR-210-3p、miR-211-5p、miR-7215-5p、miR-216a-5p等19个miRNAs在模型组的肝组织中表达明显上调;miR-335-5p、miR-130a-3p、miR-7236-3p、miR-146a-5p、miR-30a-5p等18个miRNAs在模型组的肝组织中表达明显下调。4差异表达miRNAs的验证:实时定量PCR结果显示:miR-582-3p表达较Control组明显上调,miR-130a-3p及miR-335-5p表达明显下调,均有显着差异(P<0.05),与芯片结果一致。第二部分差异表达miRNAs的生物信息学分析及靶基因的选择与验证目的:生物信息学方法分析预测miRNAs在NASH相关肝纤维化中的靶基因并进行双荧光及组织学的验证。方法:采用生物信息学方法并进行GO(Gene Ontology)分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)信号通路分析。并进行靶基因预测,结合NASH发病机制的相关通路确定目标靶基因。应用双荧光素酶报告基因系统证实miR-130a-3p与靶基因TGFBR1和TGFBR2特异结合性。在小鼠模型组织中进行靶基因及相关因子的原位杂交、免疫组化验证及m RNA和蛋白的验证。并且在NASH患者的组织中进行印证。结果:1差异表达miRNAs靶基因预测及生物信息学分析:共注释19069潜在目的靶基因,其中671个基因只与下调miRNAs相关,920个基因只与上调miRNAs相关,17478个基因与下调及上调miRNAs均相关。下调差异表达miRNAs靶基因的功能显着富集于细胞骨架,离子结合,RNA调节代谢过程,Wnt信号通路和TGF-β/SMAD信号通路、凋亡通路及ECM-受体相互作用信号通路等。上调差异表达miRNAs靶基因的功能显着富集于线粒体,DNA结合,转录,Wnt信号通路和MAPK信号传导、胰岛素信号通路、ECM-受体相互作用及凋亡通路等。2 miR-130a-3p与靶基因特异性结合验证:应用五种miro RNA靶基因预测软件(Targetscan、miRanda、miRDB、PITA和RNA22)共同预测miR-130a-3p的靶基因,其中TGFBR1 3′-UTR及TGFBR2 3′-UTR均存在与miR-130a-3p的结合位点。采用双荧光素酶报告基因验证靶基因与miR-130a-3p的结合关系,结果显示:与对照组相比,TGFBR1/2基因3′-UTR野生型质粒与miR-130a-3p mimics共转染HK 293T细胞后,显着降低报告基因的荧光素酶活性(P<0.05),与miR-130a-3p inhibitor共转染后,显着增加报告基因的荧光素酶活性(P<0.05)。而miR-130a-3p mimics、mimics control、miR-130a-3p inhibitor、inhibitor control对TGFBR1及TGFBR2基因3′-UTR突变型质粒荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)。3 miR-130a-3p与靶基因及相关因子在肝组织中的证实:3.1)在小鼠组织中的验证:3.1.1)肝组织纤维化相关基因TGFBR1、TGFBR2、smad2、smad3、Col-1及Col-4 m RNA及蛋白表达水平MCD组与对照组相比表达明显增多(P<0.05)。3.1.2)肝组织切片MCD组与对照组相比,原位杂交结果提示miR-130a-3p表达明显减少。免疫组化结果提示:TGFBR1、TGFBR2、Col-1及Col-4表达明显增多。3.2)在患者组织切片中的印证:NASH患者相关肝纤维化肝组织显示大泡肝细胞脂肪变性为主,可伴有点灶状坏死及炎症细胞浸润,肝窦周间隙纤维组织增生。与对照组相比,NASH患者相关肝纤维化患者组的肝组织原位杂交结果提示:miR-130a-3p表达明显减少。免疫组化结果提示:TGFBR1、TGFBR2、Col-1及Col-4表达明显增多。第叁部分miR-130a-3p在NASH相关肝纤维化中的作用及机制研究目的:深入阐明miR-130a-3p对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)功能的调控,探明miR-130a-3p对NASH相关肝纤维化发生发展的作用。方法:通过肝星状细胞HSC-T6进行体外培养,检测HSC活化过程中miR-130a-3p及靶基因的0d、1d、3d及7d表达变化。同时,将miR-130a-3p模拟物(Mimics)转染至肝星状细胞系过表达,MTT检测增殖、流式细胞分析法(Annexin V/PI)及相关凋亡因子检测凋亡率。采用实时荧光定量PCR及Western-blot分析其靶基因以及下游信号分子及肝纤维化相关因子的表达变化。详细探讨miR-130a-3p通过作用其靶基因TGFBR1及TGFBR2对脂肪性肝纤维化的作用机制。结果:1肝星状细胞活化过程中(0d、1d、3d及7d)miR-130a-3p及靶基因的表达变化:1.1)miR-130a-3p表达1d较0d,7d较3d显着降低(P<0.05)。1.2)m RNA表达:TGF-β1,1d较0d、3d较1d、7d较3d显着增加(P<0.05);α-SMA,3d较1d显着增加(P<0.05);Smad2,7d较3d显着增加(P<0.05);Smad3,7d较3d显着增加(P<0.05)。蛋白表达:TGF-β1,1d较0d、3d较1d、7d较3d显着增加(P<0.05);α-SMA,1d较0d、3d较1d、7d较3d显着增加(P<0.05);Smad2,1d较0d、3d较1d、7d较3d显着增加(P<0.05);Smad3,3d较1d、7d较3d显着增加(P<0.05)。1.3)m RNA表达:TGFBR1,3d较1d、7d较3d显着增加(P<0.05);TGFBR2,3d较1d显着增加(P<0.05)。蛋白表达:TGFBR1,1d较0d、3d较1d、7d较3d显着增加(P<0.05);TGFBR2,1d较0d、3d较1d、7d较3d显着增加(P<0.05)。2肝星状细胞中miR-130a-3p的过表达[miR-130a-3p mimics(M)组、Control(C)组及mimics control(MC)组]:2.1)miR-130a-3p m RNA水平:M组较C组及MC组明显增加(P<0.05),转染48 h后较转染初期(0 h)明显增加(P<0.05)。2.2)增殖率:48h、72h,M组较C组及MC组明显降低(P<0.05)。2.3)肝星状细胞凋亡的影响:2.3.1)凋亡率:M组较C组及MC组明显增加(P<0.05);2.3.2)凋亡相关因子:m RNA表达:Caspase-3、Caspase-9及PARP-1,M组较C组及MC组明显增加(P<0.05);蛋白表达:Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9及Cleaved PARP-1,M组较C组及MC组明显增加(P<0.05)。2.4)miR-130a-3p过表达对肝星状细胞活化及分泌胶原功能的影响:m RNA及蛋白表达:TGF-β1、Smad2、Smad3、Col-1、Col-4、MMP-2及MMP-9,M组较C组及MC组明显增加(P<0.05)。2.5)TGFBR1及TGFBR2 m RNA及蛋白表达,M组较C组及MC组明显增加(P<0.05)。第四部分miR-130a-3p靶基因TGFBR1及TGFBR2的敲减及功能恢复实验目的:证实TGFBR1和TGFBR2在肝纤维化中的重要作用,并确定TGFBR1和TGFBR2为miR-130a-3p在NASH相关肝纤维化中主要的靶点。方法:通过肝星状细胞HSC进行体外培养,并应用si RNA转染技术沉默TGFBR1及TGFBR2,进行敲减实验。将miR-130a-3p mimics与TGFBR1及TGFBR2野生型质粒共转染至肝星状细胞系,进行靶标蛋白恢复试验。检测星状细胞活化时靶基因TGFBRs、TGF-β/SMAD下游信号分子及肝纤维化相关因子的变化。进一步证实miR-130a-3p通过作用其靶基因TGFBR1及TGFBR2对脂肪性肝纤维化作用机制的确切性。结果:1 si RNA沉默TGFBR1及TGFBR2对TGF-β/SMAD下游信号分子及肝纤维化相关因子的作用[Control(C)组、si-Control(SC)组、si-TGFBR1(S1)组、si-TGFBR2(S2)组及(si-TGFBR1+si-TGFBR2)(SA)组]:1.1)si RNA沉默TGFBR1及TGFBR2沉默效率的检测:m RNA及蛋白表达:TGFBR1,S1组、SA组均较C组显着减少(P<0.05);TGFBR2,S2组、SA组均较C组显着减少(P<0.05)。1.2)si RNA沉默TGFBR1及TGFBR2对TGF-β/SMAD下游信号分子的影响:m RNA及蛋白表达:TGF-β1,S1组、S2组及SA组较C组无明显变化(P>0.05);α-SMA,Smad2及Smad3,S1组、S2组及SA组均较C组及SC组显着减少(P<0.05)。1.3)si RNA沉默TGFBR1及TGFBR2对肝纤维化相关因子的作用:m RNA及蛋白表达:MMP-2、MMP-9、Col-1及Col-4,S1组、S2组及SA组均较C组及SC组显着减少(P<0.05)。2采用miR-130a-3p mimics与TGFBR1及TGFBR2质粒共转染进行恢复试验的结果[Control(C)组、mimics-Control(MC)组、miR-130a-3p mimics(M)组、miR-130a-3p mimics+TGFBR1(M1)组、(miR-130a-3p mimics+TGFBR2(M2)组及miR-130a-3p mimics+TGFBR1+TGFBR2(MA)组]:2.1)对TGFBR1及TGFBR2的影响:m RNA表达:TGFBR1,M组较C组表达显着减少(P<0.05),MA组较M组表达显着增多(P<0.05)。TGFBR2,M组较C组表达显着减少(P<0.05),M2组及MA组均较M组表达显着增多(P<0.05)。蛋白表达:TGFBR1,M组较C组表达显着减少(P<0.05),M1组及MA组较M组表达显着增多(P<0.05);TGFBR2,M组较C组表达显着减少(P<0.05),M2组及MA组均较M组表达显着增多(P<0.05)。2.2)对TGF-β/SMAD下游信号分子及肝纤维化相关因子的作用:m RNA表达:TGF-β1,M组较C组比较无统计学意义(P>0.05);Smad2,M组较C组比较显着减少(P<0.05)、MA组较M组表达显着增多(P<0.05);Smad3,M组较C组显着减少(P<0.05)、MA组较M组显着增多(P<0.05);Col-1,M组较C组显着减少(P<0.05)、MA组较M组显着增多(P<0.05);Col-4,M组较C组显着减少(P<0.05)、MA组较M组显着增多(P<0.05)。蛋白表达:TGF-β1,M组较M1组显着减少(P<0.05)、M组较M2组显着减少(P<0.05)、M组较MA组显着减少(P<0.05);Smad2,M组较C组显着减少(P<0.05)、M2组较M组显着增多(P<0.05)、MA组较M组显着增多(P<0.05);Smad3,M组较C组显着减少(P<0.05)、M2组较M组显着增多(P<0.05)、MA组较M组显着增多(P<0.05);Col-1,M组较C组显着减少(P<0.05)、M1组较M组显着增多(P<0.05)、M2组较M组显着增多(P<0.05)、MA组较M组显着增多(P<0.05);Col-4,M组较C组显着减少(P<0.05)、M1组较M组显着增多(P<0.05)、M2组较M组显着增多(P<0.05)、MA组较M组显着增多(P<0.05)。结论:1 MCD饮食能够成功建立C57BL/6J小鼠NASH相关肝纤维化动物模型,为充分研究该病发病机理提供了良好保证。2小鼠肝脏组织中miRNAs在NASH相关肝纤维化进程中变化显着。差异表达的miRNAs可能参与了NASH相关肝纤维化的发生发展,并参加病理机制的调控。3 miR-130a-3p在NASH相关肝纤维化肝组织中及肝星状细胞活化过程中表达显着降低,能抑制星状细胞增殖、活化及分泌胶原、并且诱导凋亡,从而延缓或阻止肝纤维化的进展。4敲减TGFBRs实验和Rescue实验结果提示,miR-130a-3p延缓NASH相关肝纤维化发生发展的作用可能主要是通过特异性抑制靶基因TGFBR1及TGFBR2而实现的。
参考文献：
[1]. HBV相关肝纤维化组织的蛋白质组学和转录组学研究[D]. 阚方明. 北京协和医学院. 2017
[2]. 肝纤维化相关基因的筛选及其功能初步研究[D]. 强晖. 第二军医大学. 2003
[3]. 华支睾吸虫sPLA2相互作用蛋白质的筛选鉴定及其功能研究[D]. 李晔. 中山大学. 2016
[4]. 肝纤维化相关microRNA的筛选及其功能研究[D]. 陈超. 第二军医大学. 2012
[5]. 与肝纤维化发病相关的长链非编码RNAs的筛选鉴定及功能的初步研究[D]. 韩晓辉. 天津医科大学. 2017
[6]. 微小RNAs差异表达对非酒精性脂肪性肝炎相关肝纤维化的影响及分子调控机制研究[D]. 杜静华. 河北医科大学. 2016
[7]. 樟芝中Antrodin B分离及其抗肝纤维化的机制研究[D]. 王静. 江南大学. 2014
[8]. miR-130a-3p调节对非酒精性脂肪性肝纤维化的作用及分子机制[D]. 王洋. 河北医科大学. 2017
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