郭爱林[1]2001年在《肝癌抗原肽的分离、纯化、鉴定及抗原肽疫苗的研究》文中指出原发性肝细胞癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，尤其是非洲撒哈拉以南及亚洲太平洋沿岸地区的发病明显高于其他地区。在中国，每年有14万人死于肝癌，占全部恶性肿瘤死亡的18.8％，仅次于胃癌，居第2位。肝癌5年生存率仅为3％，在所有肿瘤中是最低的。我国肝癌死亡人数占全球的40％左右，居各国肝癌死亡率之首。过去30年中，尽管综合应用手术、放化疗等多种治疗手段，患者生存率提高并不多，探索新的治疗方法势在必行。 理想的治疗方式应当是既能够清除机体内多发性的肿瘤病灶，又能够特异性地区分肿瘤细胞与正常细胞。免疫治疗由于具备上述特点，成为一种具有吸引力的治疗方法。另外，免疫治疗具有记忆性，能够长时间保持对靶细胞的反应性，使用肝癌疫苗对于肝癌转移治疗具有高效性和特异性，可以长时间的防止肿瘤复发，延长患者生命。当前免疫治疗已在肝癌治疗中占据越来越重要的地位，抗原肽疫苗更是免疫治疗发展的重中之重。 T细胞在抗肿瘤免疫反应中起着关键作用。肿瘤抗原肽是肿瘤抗原经过抗原递呈细胞（APC）加工后，由HLA分子递呈给T细胞抗原受体（TCR）的短肽，是肿瘤激发机体特异性免疫反应的物质基础。肿瘤抗原肽的研究不仅对阐明免疫应答的机理和肿瘤免疫逃避机制具有十分重要的理论意义，而且对肿瘤的发病学、诊断、治疗以及疫苗制备都具有重要的应用意义，是当今国际肿瘤免疫学研究的一个热点，也是一个难点。鉴定抗原肽的方法主要有CTL扫描cDNA文库法，生物 第四军医大学博士论文专用纸＊ 化学法（包括酸洗脱．质谱法）和反向免疫法。 质谱技术应用于蛋白质研究是九十年代分子生物学的重大进展，它不仅可以 精确测定蛋白质的分子量（误差＜0刀1W，而且可以直接进行测序，具有时间短、 不受末端是否封闭及是否经过翻译后修饰等的限制，特别适用于微量样品研究 （Anol级X 成为蛋白质组研究的两大支撑技术之一。将毛细管电泳④E）或高效液 相色谱仪（HPLC）与电离子喷雾串联质谱瞩SI－MS－MS）联用，可以实现多肽混合样 品的在线分离测序，使抗原肽的大规模筛选成为可能，因此在抗原抗原肽研究中 应用越来越多。 本研究试图通过应用酸洗脱．质谱法鉴定HLA相关抗原肽，为发展肝癌特异 性疫苗奠定基础。 我们首先对肝癌细胞系HHCC、SMMC7721、9204、HepGZ进行HLA二类分 子配型，再使用IFN－Y刺激4株肝癌细胞系表达HLA分子，应用流式细胞仪检 测HLA－I类分子表达情况，选择高表达HLA－I类分子的细胞系作为研究对象，接 着大规模培养肿瘤细胞，应用柠檬酸缓冲液洗脱细胞表面HLA－I类分子结合的抗 原肽，Sephadex G25柱脱盐并初步分离抗原肽，p－HPLC进一步洗脱分离抗原肽。 应用HLA·AZ阳性志愿者外周血与所用肿瘤细胞混合培养，诱导肿瘤特异性CTL。 洗脱的抗原肽与TZ细胞进行抗原肽重建，流式细胞仪检测HLA·I类分子表达情 况，再应用肿瘤特异性CTL杀伤肽负荷TZ细胞，检测CTL识别能力。HJPLC－MS 联用初步鉴定能够被CTL识别的抗原肽重建多肽组分，MS／MS测序目标离子峰。 对于无法确定残基是亮氨酸／异亮氨酸，采用下列方法确定：l）因特网氢基酸同永 源性序列检索，根据检索结果确定残基序列；2）仍然无法确定的序列（如氨基酸 突变），则根据多肽峰的位置，RP－HPLC收集该峰，经过13轮纯化，证实为单一 物质后，多肽测序仪测序八西安美联公司、北京赛百盛公司和上海生化所均接收 样品测序）：3）无法进行多肽测序仪测序的样品州－末端封闭或量不够），对干赖 氨酸／谷氨酚胺进行多肽样品乙酚化处理，再液质联用进行测序。4）对于亮氨酸／ 异亮氨酸，根据遗传密码简并性合成多条可能的引物，利用PCR进行单链多态一 第6页共6页 第四军医大学博士论文专用纸． 致性序列分析法确定mRNA序列，推导出氨基酸残基。 应用多肽合成仪合成己测序的候选多肽，TZ负荷多肽刺激PBMC诱导特异 性CTL，流式细胞仪检测CTL表型，4h5℃r杀伤实验检测杀伤肿瘤细胞活性， 单克隆抗体封闭实验检测杀伤是否由HLA刁类分子介导。通过上述步骤检验候选． 多肽的抗原性。RT－PCR分析肿瘤抗原表达情况，对于克隆的cDNA进行测序。 最后，应用DC负荷抗原肽体外诱导肝癌特异性CTL，进行体外DC负荷抗原肽 疫苗的研究。 结果 四株细胞系均为 HLA－AZ阳性，其中 HHCC表型?
黄胜兰[2]2014年在《AFP基因修饰的DC细胞的分泌的exosome抗肿瘤作用研究》文中研究指明【目的】原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中国常见的恶性肿瘤之一。由于肝癌起病隐匿，缺乏有效的早期诊断方法，而且复发率高、预后差，因而总的治疗效果并不理想，目前肝癌生物治疗逐渐成为研究热点之一。其中，树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗的实验研究已取得相当大的进展，然而在实际应用仍存在很多不足，效果往往不如预期理想,其中缺乏有效抗原刺激是重要的影响因素之一，为此众多学者尝试运用不用抗原负载方式增强DC疫苗诱导抗肿瘤免疫反应,这其中包括人工合成的抗原肽、全肿瘤裂解物、基因载体转染DC等等，虽然基因转染DC可在一定程度上解决抗原来源问题，但基因载体在人体应用的安全性未能得到保障，因此最近人们尝试用新型亚细胞瘤苗exosome等来调节或替代DC功能。Exosome是DC细胞分泌一种膜性囊泡,其重要特性是携带DC细胞的各种功能蛋白,因而具有相应的诱导主动免疫应答功能，其抗肿瘤作用已经在非小细胞肺癌、黑色素瘤等治疗中取得一定的效果,但应用于肝癌的研究尚处于探索阶段。本实验首先构建携带AFP基因慢病毒质粒，包装成慢病毒感染DC，分离纯化DC分泌的exosome，分析exosome的特异性抗肿瘤免疫作用。为开拓新型非细胞性肝癌疫苗提供实验依据，避免直接病毒基因导入人体，以便研制出更具临床应用前景的肿瘤疫苗。【方法】1.应用慢病毒质粒系统和包装细胞Lenti-X293T，构建包装能使AFP稳定表达的重组慢病毒颗粒。2.取健康人外周血，分离培养单核细胞，用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4及LPS诱导培养DC，显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪鉴定DC表型。3.分别用合成的已知序列的AFP肽、肝癌细胞株HepG2反复冻融全抗原、携带AFP重组慢病毒颗粒负载DC，分别制备DC疫苗。4.用超滤及密度梯度离心法提取纯化DC分泌的exosome，制备exosome疫苗，透射电镜下观察exosome形态，western blot分析其功能蛋白分子。5. WST-1法比较叁种DC疫苗、exosome疫苗刺激T淋巴细胞增殖情况，LDH法比较叁种DC疫苗、exosome疫苗诱导的CTL对HepG2特异性细胞毒效应，ELLSA法比较DC疫苗、exosome疫苗活化T淋巴细胞培养上清中分泌INF-γ的浓度。6．将携带AFP抗原的exosome致敏DC，WST-1法、LDH法、ELISA法检测DC抗肿瘤免疫学活性。【结果】1.成功构建了慢病毒表达载体PRV3-AFP，能有效的感染树突状细胞并使其分泌AFP蛋白。2.mDC成典型的树突状细构，表面HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD1a分子的表达明显高于imDC。3.成熟DC分泌的exosome(Dex)在电镜下为直径在50nm-100nm之间圆形或椭圆形小体，携带与DC功能相关的分子：ICAM-1、HLA-DR、CD86分子。4.慢病毒感染的DC刺激T淋巴细胞增殖能力显着高于AFP肽、全抗原处理组（P<0.05），前者刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ和对肝癌细胞HepG2特异性杀伤作用显着高于其他两组（P<0.05）。5.慢病毒处理组制备的DC疫苗和其分泌exosome疫苗比较，exosome疫苗刺激T淋巴细胞增殖能力和诱导的T细胞对HepG2细胞特异性杀伤能力稍强于DC疫苗（P<0.05），exosome疫苗刺激T细胞分泌IFN-γ能力和与DC疫苗比较差别无显着意义（P>0.05）。6. exosome致敏的DC能更有效的刺激T淋巴细胞增殖和产生细胞毒作用。【结论】1.成功构建AFP慢病毒，慢病毒负载DC和AFP肽、细胞裂解抗原负载方式比较能更有效的诱导抗肿瘤免疫，是一种更为有效的制备DC疫苗方式。2. Dex作为一种具有抗原提呈能力的亚细胞结构，可诱导外周血中T细胞增殖并发挥特异性抗肿瘤作用。exosome致敏的DC能产生更有效的抗肿瘤免疫作用。
马杰[3]2005年在《人HSP70在毕赤酵母中的表达鉴定及大规模发酵和纯化工艺研究》文中认为本研究利用基因重组技术构建了人HSP70 真核表达载体pPICZα/hhsp70,电转化毕赤酵母X-33 后,筛选出稳定高效的分泌表达rhHSP70 的工程菌株。经SDS-PAGE,Western blot,亲和层析和离子交换层析纯化及N-端氨基酸测序分析证明rhHSP70 与天然hHSP70 具有相同的序列和理化性质。同时利用固相多肽合成法合成了人HER2/neu蛋白的CTL表位P106-114和P369-377,并在体外与rhHSP70形成复合物,用rhHSP70-多肽复合物和GM-CSF+多肽分别免疫小鼠,进行诱导HER2/neu蛋白特异性CTL的实验研究。结果表明:rhHSP70-多肽复合物比GM-CSF+多肽更有效地促进T淋巴细胞分泌IFN-γ,诱导特异性CTL杀伤表达人HER2/neu蛋白的小鼠乳腺癌细胞,并使肿瘤组织出现大范围的坏死和凋亡,对乳腺癌模型小鼠的治疗作用也明显优于GM-CSF+多肽。说明rhHSP70 具有与天然hHSP70 相同的免疫活性。进而在80L发酵条件下,进行了rhHSP70 表达条件的优化,并建立一种适合于大规模纯化rhHSP70 的新方法。本实验的创新之处在于:1)首次在毕赤酵母中高效表达了rhHSP70 ;2)首次证实将HER2/neu蛋白的CTL表位P106-114和P369-377与hHSP70 结合形成复合物,可诱发机体强大的特异性免疫反应,用于乳腺癌的免疫治疗;3)建立了大规模发酵和纯化rhHSP的新方法。
叶菁[4]2003年在《热休克蛋白70与MAGE-1融合基因疫苗和蛋白疫苗的构建及体内抑瘤效应的研究》文中研究指明随着现代的细胞和分子免疫学的发展，人们已经基本明确机体在肿瘤的免疫识别和免疫调节过程中的分子机制，在此基础上，研究特异性的肿瘤疫苗正逐渐成为肿瘤生物治疗的重要手段。但是由于缺乏特异抗原和有效的抗原递呈，以及MHC的限制和肿瘤异质性等原因，使现有肿瘤疫苗的使用范围和效果相当有限。Hsp70是一个高度保守的蛋白，其在蛋白的转运、折迭以及抗原的加工递呈过程中均具有重要作用。研究表明，Hsp70可作为一种分子载体，增强与其结合蛋白的抗原性。MAGE-1是一种广泛证实的肿瘤特异性抗原，其在多种肿瘤中均有表达，而在正常组织细胞(除睾丸外)均不表达。本研究构建以Hsp70为疫苗载体，MAGE-1为靶抗原的肿瘤DNA疫苗与蛋白疫苗，并研究疫苗对机体细胞及体液免疫的作用，以及对小鼠肿瘤模型的治疗作用。 1．采用RT-PCR从HepG2细胞总RNA中克隆MAGE-1的基因，经测序，与GeneBank公布的序列一致；对MAGE-1基因编码的蛋白的理化性质进行分析表明MAGE-1的前100个氨基酸残基的疏水性较高，并可能含有一个跨膜序列，其后100个氨基酸残基的抗原性较高；通过Blast软件对MAGE-1编码的蛋白进行特异性分析表明，MAGE-1蛋白的后100一个氨基酸残基具有相对较高的特异性；构建MAGE一的全长和分段原核表达质粒，并分别进行表达，结果显示，MAGE上的全长表达量甚低，而截去前10o个氨基酸残基后M人＊B1乃7习09—）的表达量明显升高：通过对 MAGEA 门）进行原核表达与分离纯化，获得 MAGEJ （194309a）的纯化蛋白，制备 MAGE－l的抗血清，琼脂双扩实验显示，抗血清经1：32稀释后能够与＊＊＊卜1门9个309—）形成抗原抗体沉淀：采用固化 GST蛋白的 Sephrose 4B进行交叉吸附，中和抗血清中针对 GST蛋白的成分后，ELISA表明，抗血清在 1：10，000的情况下能够与抗原结合，Western Blot结果显示抗血清能够与 MAGE．l特异性结合，而不与GST蛋白结合。 工 构建MAGEA的逆转录病毒质粒pLXSN－MAGE刁，经包装细胞PA3包装后，感染小鼠 BI6细胞，经筛选获得 BI6－MAGE－l细胞，RT－PCR检测有 MAGE－l的转录，Western Blot检测到与 MAGE－l抗血清结合的46kDa的蛋白。采用PCR从结核杆菌标准株H37Rv的基因组中克隆HsP70基因，除含有一个苍蝇已突变外其余序列与GeneBank公布的一致；构建MAGE1的真核表达质粒pCDNA－MAGE＊，HSp70的真核表达质粒pCDNA－HSp70，以及二者的融合真核表达质粒pCDNA－MAGE刁；分别采用DNA疫苗免疫C57BL／6 ’J’鼠，采用IFN－Y ELISPOT及培养上清中几上的 ELISA检测结果显示，融合DNA疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞中针对 BI6－MAGEJ的特异性 T细胞数量相对于其它各组明显增加中阿对5）；采用LDH释放实验对脾淋巴细胞毒性的检测，结果显示融合 DNA疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞对 BI6．MAGE1细胞的杀伤明显升高，而对以 细胞的杀伤相对于其它组并没有明显变化中＞0刀5人间接ELISA结果显示，融合DNA疫苗免疫的小鼠血清中抗MAGE－l的抗体水平没有明显增高。在小鼠的肿瘤模型的治疗实验中， — —一一显示融合 DNA疫苗对 BI6－MAGE－l肿瘤模型具有良好的治疗作用。 3．分别对HSp70和MAGEq进行原核表达与分离纯化，获得HSp70和MAGE4的纯化蛋白；构建MAGE＊与HSp70融合基因原核表达质粒pGEX－MAGE八，并进行原核表达和分离纯化，获得MAGEq与HSp70的融合蛋白；分别采用蛋白疫苗免疫 C57BL／6小鼠lFN． ELISPOT和IL毛 ELISA检测结果显示，融合蛋白疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞中针对B16－MA GEq的T细胞数量明显升高中功．05）；LDH释放实验结果显示，融合蛋白免疫的小鼠，脾淋巴细胞对 BI6－MAGE1的毒性明显增强 b＜0刀5＊而对＊ 细胞的杀伤作用较弱。间接ELISA结果显示，融合蛋白能够提高机体对M人＊E1的抗体水平平＜0刀5人 本研究成功地克隆了MAGE－l的基因，并进行了原核表达，在国内首次制备了 MAGE．1的抗血清，发现 MAGE．l的前 100个氨基酸残基中可能存在的跨膜序列对蛋白的原核表达具有一定的影响。本研究首次构建了MAGE4与HSp70的融合DNA疫苗，研究结果显示其能够激活小鼠的细胞免疫反应，对小鼠肿瘤模型具有良好的治疗作用。融合DNA疫苗对小鼠的体液免疫作用较弱。本研究首次制备了MAGE＊与HSp70的蛋白疫苗，研究结果表明融合蛋白疫苗能够激活小鼠的细胞免疫和体液免疫反应。 综上所述，我们首次构建了MAGE一 融合DNA疫苗及融合蛋白疫苗，两种疫苗均能够激活机体的抗肿瘤免疫效应，此外HSp70作为一种疫苗载体，可明显增强MAGE．l的免疫原性，为新型肿瘤疫苗研究奠定了基础。
蒋燕明[5]2005年在《卵巢癌相关抗原的筛选及鉴定》文中研究说明肿瘤抗原的寻找一直是肿瘤免疫学研究中面临的重要课题。Sahin 报告的SEREX(Serological analysis of recombinant eDNA expression libraries)方法是从体液免疫的角度寻找肿瘤抗原,为寻找肿瘤抗原提供了一种全新的途径。以应用于许多类型的肿瘤抗原的筛选,发现了一些新的肿瘤排斥抗原,显示出该方法具有良好的应用前景。卵巢癌在女性恶性肿瘤中死亡率居于第一位,其中最常见的晚期上皮性卵巢癌5 年生存率长期停留在20～30%左右,其主要原因是卵巢癌发病部位隐蔽,难以早发现,早治疗,预后差。目前的诊断方法有限,寻找新的更具优势的肿瘤抗原用于诊断是急需研究的课题。用SEREX 方法筛选卵巢癌肿瘤抗原的研究在国内外较少。本研究所用卵巢癌eDNA 表达文库由本课题组构建,该文库已应用SEREX 和SSH 相结合的筛选肿瘤抗原基因的技术策略,并获得了180 个卵巢癌肿瘤抗原基因克隆。本文对其中45 个卵巢癌候选抗原基因在34 例卵巢癌患者和34 例正常人血清中相应IgG,IgM 抗体的检测、分析发现,其中6 个抗原克隆的IgG 血清抗体的阳性率均明显的高于相应正常人血清中的阳性率,4 个抗原克隆的IgM 血清抗体的阳性率均明显的高于相应正常人血清中的阳性率。分析筛选的阳性卵巢癌抗原与卵巢癌患者的临床病理关糸发现,lO 个卵巢癌抗原在卵巢癌血清中的自身抗体与其病理学类型及组织学分级无相关性。分析这些抗原的自身IgG抗体与卵巢癌临床分期的关系发现,不同抗原的抗体在卵巢癌的不同期别可发生明显的升高。这些结果说明卵巢癌的发生是一个多阶段、多步骤、多基因参与的过程。我们的研究发现数个卵巢癌抗原的血清IgM 抗体在卵巢癌早期阶段就发生了明显的升高,提示这些肿瘤抗原的自身抗体可能成为卵巢癌早期诊断的血清学标志物。本研究把10 个抗原克隆联合起来分析发现,分别用IgG 抗体和IgM 抗体检测都能提高卵巢癌诊断的敏感性和特异性:而同时用IgG 抗体和IgM 抗体检测,则能够在保证特异性不变的前提下,明显提高了诊断的敏感性和准确性。这个发现为将来研究卵巢癌肿瘤标志物,用以诊断卵巢癌提供了一个新的方向。得到的其中7 个阳性克隆的序列进行生物信息学分析,经与GeneBank 和SEREX 数据库比较、分析发现这7 个卵巢癌候选肿瘤抗原基因可以分为4 类:①1 个与已知卵巢癌相关基因同源的基因,可能是乳腺癌或卵巢癌癌性突变的靶位;②3 个与一些具特殊功能蛋白的基因同源的基因:③2 个可能与细胞生长、分化功能有关的基因;④1 个在GeneBank 中无同源序列的新基因。初步分析这些基因均是具有不同功能的功能性基因。
李常颖[6]2010年在《膀胱癌及其癌旁组织gp-96结合肽库的初步探讨》文中提出目的热休克蛋白gp96作为分子伴侣,能够与肿瘤抗原肽形成gp96—肽复合物,参与肿瘤抗原向MHC-I类分子途径的递呈过程,从而激活CD8+T淋巴细胞,产生抗肿瘤特异性免疫应答。因此,gp96—肽复合物疫苗为肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。传统制备gp96的方法虽然已经成熟,但是由于组织来源的限制以及纯化工序过于繁杂,难以进行工业化生产。因此寻找一种快速有效而又高度特异性的方法纯化gp96,成为该疫苗大规模临床应用所要解决的首要问题。研究进一步证实,在gp96—肽复合物中起肿瘤免疫作用的是抗原肽,不是gp96自身,gp96结合的多肽才是疫苗制备和诱导特异性免疫应答的分子基础。因此,对gp96结合肽库的鉴定和分析,成为构建gp96—肽复合物疫苗、探讨相关作用机理及疫苗人工化生产等急待解决的问题。方法用固相化的gp96蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗gp96蛋白Fab抗体的阳性克隆,酶切及连接反应构建其可溶性表达噬菌粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导特异性抗体的高效表达,并用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性及特异性；所得抗体经纯化后作为偶联配体,吸附纯化膀胱癌及其癌旁组织中的gp96—肽复合物；通过酸洗脱法得到gp96所结合的多肽片段,经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其分子量及氨基酸序列；应用生物信息学技术分析各多肽片段的生物学特性。结果1通过对人天然Fab段噬菌体抗体库的四轮淘选,特异性抗gp96蛋白Fab噬菌体抗体得到了富集；2构建的抗gp96可溶性Fab抗体表达载体,在IPTG的诱导下得到了抗体的高效表达；进一步应用亲和层析技术得到了纯化的抗gp96可溶性Fab抗体；3利用基因工程抗体技术结合免疫亲和层析技术,可以从少量膀胱组织中纯化出实验用量的gp96—肽复合物,每克组织可获得约20μg-50μ.g的gp96—肽复合物；4在膀胱癌及其癌旁组织来源的gp96结合的多肽中,14条多肽的氨基酸序列被鉴定,其中8条来源于膀胱癌,6条来源于癌旁组织,分子量在997.5281Da-2211.33Da之间：5条多肽具有明确的蛋白来源,5条多肽经鉴定具有抗原性。结论1利用基因工程抗体技术结合免疫亲和层析技术,可成功的从有限的组织中分离纯化出实验用量的gp96—肽复合物；2gp96结合肽库中的肽为一些小分子肽片段,长短不一,部分蛋白来源明确,部分多肽具有抗原性,具有潜在的临床应用价值。
王芳[7]2004年在《高特异性HER2/neu手性多肽疫苗实验研究》文中研究说明细胞免疫是机体清除体内变异细胞的主要途径，其中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)发挥关键作用。CTL的激活是通过识别抗原递呈细胞（APC）表面 MHCⅠ类分子递呈的抗原肽，被递呈的抗原一般为9～11个氨基酸的肽段。现已证实，合成肽不需要APC的加工、处理就能直接与APC表面的MHCⅠ类分子结合，与天然的内源性肽在激活免疫系统方面具有同等效力。肿瘤抗原肽的鉴定使直接应用明确的抗原肽作为肿瘤疫苗成为可能。但是合成肽疫苗分子较小，免疫原性较低，在体内半衰期短，容易被酶类降解,导致其诱导的特异性CTL存在时间短，效价低，不易达到使肿瘤消退所需的阈值。为此本研究主要从以下两方面着手突破这种低应答状态：①在不影响合成多肽疫苗与MHC-Ⅰ类分子结合的前提下，在合成多肽中掺入D型氨基酸，使其局部的旋光性发生改变。合成的D型抗原肽对蛋白酶的降解具有抗性，其稳定性提高，体内的半衰期延长，免疫原性增强。②联合应用免疫佐剂GM-CSF，活化巨噬细胞和其它免疫反应细胞，以期获得较强的细胞免疫应答反应。一．HER2/neu多肽疫苗序列的选择、设计与固相合成1．多肽氨基酸序列的选择与设计：应用SYFPETTHI基序法预测系统进行<WP=101>CTL表位初步预测，从抗原肽预测结果中选取两种区段P42-50 (HLYQGCQVV)、P782-790 ( VSRLLGICL)。因为MHC-Ⅰ类分子不同等位基因结合多肽的氨基酸残基变化主要局限在氨基末端，因此，在不改变多肽与MHC-Ⅰ类分子结合的前提下，改变多肽抗原的羧基端氨基酸，将P42-50的羧基端残基L-Leu替换为D-Leu , P782-790的羧基端残基L-Ser替换为D-Ser，合成了具有局部手性特征的多肽D-P42-50，D-P782-790，以期增强多肽在体内稳定性的同时提高其免疫原性。2．多肽合成：采用Fmoc固相多肽合成策略，合成上述四种多肽，L-P42-50，，D-P42-50，L-P782-790和D-P782-790。3．多肽的纯化及鉴定：利用中压反相液相层析对粗肽进行分析及纯化，L-P42-50、D-P42-50的纯度分别为99.2%及98.9% ，L-P782-790、D-P782-790的纯度分别为99.1%和99.0% 。利用激光解吸电离飞行时间质谱测定各色谱峰的分子量，经真空旋转蒸发及冻干获得纯品多肽。结果L-P42-50、D-P42-50总产率分别为63%及45%，，L-P782-790、D-P782-790总产率分别为58%及46%，。二．合成多肽疫苗体内诱导CTL作用研究小鼠乳腺癌模型的建立及多肽疫苗免疫 选用雌性BALB/c小鼠接种D2F2细胞,分别为对照组、GM-CSF组、L-P42-50、L-P42-50+ GM-CSF组、D-P42-50、D-P42-50+ GM-CSF组、L-P782-790、L-P782-790+ GM-CSF组、D-P782-790、D-P782-790+ GM-CSF组。1．与对照组小鼠相比，L-P42-50+GM-CSF组、L-P782-790+GM-CSF组、D-P42-50+GM-CSF组和D-P782-790+GM-CSF组小鼠脾细胞重量增加差异显着（P﹤0.05, P﹤0.05, P﹤0.01, P﹤0.01），对淋巴细胞增殖的促进作用差异显着（P﹤0.05, P﹤0.05, P﹤0.01, P﹤0.01），分泌IFN-γ的T淋巴细胞数明显增多（P﹤0.05, P﹤0.05, P﹤0.01, P﹤0.01），对D2F2乳腺癌细胞的特异杀伤作用差异显着（P﹤0.05, P﹤0.05, P﹤0.01, P﹤0.01）。这四种多肽联合应用GM-CSF 都能促进小鼠T细胞增殖，促进T细胞分泌IFN-γ及激活CTL杀伤乳腺癌细胞，说明这两种预测的L型多肽在体内与MHC-Ⅰ类分子相结合产生复合物，与T细胞受体结合，激活CTL<WP=102>细胞，对乳腺癌细胞产生杀伤作用。2．D-P42-50+GM-CSF组和L-P42-50+GM-CSF组、D-P782-790+GM-CSF组L-P782-790+GM-CSF相比，小鼠脾细胞重量的增加差异显着（P﹤0.05, P﹤0.05），对淋巴细胞增殖的促进作用差异显着（P﹤0.05, P﹤0.05）,分泌γ-IFN的T淋巴细胞数增多（P﹤0.05, P﹤0.05）,诱导对D2F2乳腺癌细胞的特异杀伤作用也有显着差异（P﹤0.05, P﹤0.05）。D-P42-50和D-P782-790辅以GM-CSF可显着促进小鼠T细胞增殖，促进T细胞分泌IFN-γ及激活CTL杀伤乳腺癌细胞，说明这两种经改造的手性多肽与MHC-Ⅰ类分子结合的能力并没有发生改变，与L型多肽一样，在体内与MHC-Ⅰ类分子相结合产生复合物，与T细胞受体结合，激活CTL细胞，对乳腺癌细胞产生杀伤作用。D-P42-50和 D-P782-790多肽在局部上具有了手性特征，具有了不同于体内肿瘤细胞所表达的HER2/neu多肽的结构特征，在一定程度上增加了免疫原性，从而使其更能够有效地诱导CTL。本研究的淋巴细胞增殖实验和CTL杀伤活性测定结果也肯定了这一实验设计的可行性和有效性。叁．合成多肽疫苗体内抑瘤实验研究BALB/c小鼠接种小鼠乳腺癌细胞D2F2后，进行多肽疫苗接种。接种肿瘤细胞42天后处死小鼠，取肿瘤组织进行光镜及电镜观察。1．小鼠肿瘤组织体积和重量：与对照组小鼠相比，L-P42-50+GM-CSF组、L-P782-790+GM-CSF组、D-P42-50+GM-CSF组和D-P782-790+GM-CSF组的肿瘤重量和体积明显低于对照组，有显着性差异（P﹤0.05, P﹤0.05, P﹤0.01, P﹤0.01），而且D-P42-50+GM-CSF组和D-P782-790+GM-CSF组的肿瘤重量和体积与L-P42-50+GM-CSF组和L-P782-790+GM-CSF组相比，有显着差异（P﹤0.05, P﹤0.05）。NaCl组、GM-CSF 组、L-P42-50 组、D-P42-50组、L-P782-790组和 D-P782-790组小鼠与对照组相比无显?
贺菽嘉[8]2010年在《胶质瘤相关抗原MAGE-D4基因重组、表达特性分析及抗体血清学检测》文中研究说明目的分析MAGE-D4 mRNA和蛋白在胶质瘤以及其他类型肿瘤组织中的表达情况,探讨血清MAGE-D4自身抗体出现的意义,初步了解MAGE-D4在肿瘤发生发展中的作用,为评价其用于肿瘤的辅助诊断和靶向治疗的可能性提供依据。方法1.采用生物信息学方法对MAGE-D4蛋白的同源性、理化性质、跨膜区域、二级结构、结构域、功能性位点、亚细胞定位及抗原表位进行分析和预测。2.采用RT-PCR方法获得MAGE-D4a全长编码区cDNA,构建MAGE-D4原核重组质粒,经测序正确后转化至Rosetta(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导融合蛋白的表达,表达的重组蛋白用Amylose Resin亲和层析分离纯化并进行质谱鉴定。3.用MAGE-D4融合蛋白免疫家兔,分离纯化抗血清;获得的抗血清分别用间接ELISA和Western Blot检测其效价和特异性。4.用RT-PCR和免疫组织化学技术,从mRNA和蛋白水平了解MAGE-D4基因表达的特点,并对其与肿瘤临床病理参数之间的关系进行初步分析。5.用重组MAGE-D4融合蛋白的间接ELISA法,检测胶质瘤等6种肿瘤及正常人血清中抗MAGE-D4抗体的阳性率,初步分析抗体出现的意义。结果1.生物信息学分析结果显示,MAGE-D4是一种不稳定的弱酸性可溶蛋白,无跨膜螺旋,无信号肽;二级结构以α螺旋(59.6%)和无规卷曲(23.8%)为主,在第334-368、450-480氨基酸位置处存在2个卷曲螺旋区域;最邻近距离法预测MAGE-D4蛋白定位于细胞核(55.5%);MAGE-D4蛋白序列中含有MAGE家族的保守结构域,含有N-糖基化位点、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶、酪氨酸激酶、酪蛋白激酶Ⅱ、蛋白激酶C等磷酸化修饰位点以及多种功能性基序,提示其在细胞生长、黏附及信号传导方面具有潜在功能;MAGE-D4蛋白可能存在多种HLA-A2限制性T细胞表位。2.获得了MAGE-D4的原核表达质粒,通过优化体外培养条件,融合蛋白的表达量可达到菌体总蛋白的47.7%,并且部分以可溶形式存在,亲和层析后得到纯度较高的融合蛋白,经质谱鉴定确定与目的蛋白相符。3.制备的MAGE-D4多克隆抗体纯化后的效价大于1﹕64000,能与MAGE-D4融合蛋白特异性识别并结合。4.在各种肿瘤组织中MAGE-D4 mRNA的表达率分别为:胶质瘤85.48%(53/62)、脑膜瘤76.92%(20/26)、肝癌71.70%(38/53)、结直肠癌81.03%(47/58);肝癌及结直肠癌癌旁组织中MAGE-D4表达频率低于相应的癌组织(P<0.05),分别为50.94%(27/53)及41.38%(24/58)。在所检测的11株肿瘤细胞中,肝癌、鼻咽癌、舌癌、卵巢癌等肿瘤细胞中表达MAGE-D4,而胃癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞中不表达。免疫组织化学结果显示,MAGE-D4蛋白主要定位在胞浆;胶质瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、胃癌和结肠癌组织中MAGE-D4蛋白的阳性率分别为77.8%(21/27)、69.6%(16/23)、66.7%(2/3)、50%(1/2)和100%(2/2);3例正常脑组织和27例肺癌癌旁组织均未检测到MAGE-D4蛋白的表达。统计学分析显示胶质瘤及非小细胞肺癌中MAGE-D4蛋白表达与临床病理参数之间无显着性关联。5.肿瘤病人血清中MAGE-D4抗体的总阳性率为19.34%(47/243),其中肝癌为29%(10/35),肺癌为27%(8/30),结直肠癌为19%(12/64),胶质瘤为18%(9/51),胃癌为17%(5/30),脑膜瘤为9%(3/33);72例正常人血清中未检出MAGE-D4抗体。结论MAGE-D4在肿瘤组织中具有较高的表达频率,而在癌旁组织和正常组织中表达频率较低或不表达,提示它可能是一种肿瘤相关抗原基因。MAGE-D4在多种类型的肿瘤患者体内能引起体液免疫反应,有望成为肿瘤辅助诊断和免疫治疗的分子标记物。
罗彬[9]2010年在《OY-TES-1表达对肿瘤生物学行为的影响及其抗体血清学分析》文中认为我们前期的研究发现癌-睾丸抗原OY-TES-1在肝癌中高表达,在正常组织中限制性表达,并且能够引起机体的体液免疫反应,提示它是一个颇有运用开发前景的靶抗原。本研究初步研究OY-TES-1的表达对肝癌细胞的部分生物学功能的影响;了解恶性肿瘤(结直肠癌)和良性肿瘤(脑膜瘤)中OY-TES-1的表达情况及其抗体出现的情况,探讨将其应用于辅助诊断及肿瘤免疫治疗的可行性。第一部分OY-TES-1对肝癌细胞生物学行为影响的体外实验研究目的:构建OY-TES-1真核表达载体pEGFP-N1/OY-TES-1,稳定转染至肝癌细胞株HepG2,体外观察OY-TES-1对HepG2生长、增殖及迁移的的影响。方法:根据人OY-TES-1基因序列设计引物,以pMAL-C2/OY-TES-1重组质粒作为模板进行PCR,扩增出OY-TES-1编码区cDNA,并与pEGFP-N1质粒连接,构建成pEGFP-N1/OY-TES-1重组质粒,经DNA测序鉴定后,用Fugene HD将重组质粒转染至OY-TES-1表达阴性的肝癌细胞株HepG2。G418筛选阳性克隆并扩增、培养、传代,获得稳定转染株。分别用稳定表达重组质粒pEGFP-N1/OY-TES-1、空质粒pEGFP-N1及未转染的HepG2,通过细胞计数、MTT比色法、平板克隆形成、细胞周期测定和划痕修复等一系列细胞功能学实验,观察获得OY-TES-1表达后的HepG2细胞其生长、增殖和迁移改变。结果:测序及序列比对证实,pEGFP-N1/OY-TES-1真核表达载体中插入OY-TES-1的基因序列完全正确。RT-PCR和IHC结果显示:在pEGFP-N1/OY-TES-1重组质粒稳定转染的HepG2细胞中,OY-TES-1的表达较空质粒转染细胞和未转染细胞增强。对pEGFP-N1/OY-TES-1重组质粒和pEGFP-N1空质粒转染及未转染的HepG2细胞进行检测,发现OY-TES-1的转染对HepG2的生长、增殖及迁移能力无明显影响。结论:成功构建了pEGFP-N1/OY-TES-1真核表达载体,OY-TES-1对肝癌细胞株HepG2的生长、增殖及迁移无明显影响。第二部分OY-TES-1在结直肠癌和脑膜瘤的表达及临床意义分析目的:研究OY-TES-1在结直肠癌和脑膜瘤的表达及临床意义。方法:采用RT-PCR和IHC方法,分别检测24例腺瘤组织、60例结直肠癌及相应的癌旁组织、45例脑膜瘤组织OY-TES-1mRNA和蛋白质;结合临床病理资料对实验结果进行统计分析。结果: RT-PCR结果显示,结直肠癌OY-TES-1mRNA阳性率为73.3%,明显高于癌旁组织(55.0%)和腺瘤组织(45.8%)(P<0.05);脑膜瘤OY-TES-1mRNA阳性率为66.7%。免疫组织化学法检测发现,OY-TES-1蛋白在腺瘤组织和结直肠癌癌旁组织中均无表达,结直肠癌和脑膜瘤OY-TES-1蛋白阳性率分别为43.3%和40.0%。统计学分析结果显示,结直肠癌OY-TES-1蛋白的表达与浸润深度和组织分化程度相关(P<0.05),与年龄、性别、组织类型、发病部位、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及Duke’s分期无关;脑膜瘤中OY-TES-1的表达与年龄、性别及组织类型均无关。结论:OY-TES-1蛋白较之其mRNA更具有限制性表达的特点。OY-TES-1蛋白主要在进展期结直肠癌中表达,其表达可能与肿瘤的演进和恶化有关;结直肠癌和脑膜瘤中OY-TES-1的表达均较高,而癌旁组织和癌前病变组织不表达,OY-TES-1对于肿瘤的辅助诊断及免疫治疗可能具有潜在的应用价值。第叁部分结直肠癌和脑膜瘤患者血清OY-TES-1抗体的检测目的:了解结直肠癌和脑膜瘤患者血清中OY-TES-1抗体的出现情况,探讨OY-TES-1血清抗体出现的临床意义。方法:采用ELISA检测25例结肠癌和31例脑膜瘤患者血清中相应的OY-TES-1抗体,以50例正常人血清作为对照。结合临床病理资料对实验结果进行统计分析。结果:ELISA检测未发现正常人血清中有OY-TES-1抗体,结直肠癌和脑膜瘤患者血清抗体阳性率分别为8%和16.3%。OY-TES-1血清抗体的出现与临床资料无明显关系。结论:OY-TES-1在部分结直肠癌和脑膜瘤患者血清出现特异性抗体,其意义尚需进一步的探讨。
周娟[10]2006年在《人食管癌细胞热休克蛋白70肽复合物的提取及其抗瘤活性的研究》文中研究表明研究背景 食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，对食管癌治疗的研究除了手术、放疗和化疗外，最引人注目的是食管癌肿瘤疫苗的研究。肿瘤疫苗输注病人体内后通过激活肿瘤患者自身的免疫系统，引起特异性的抗肿瘤反应，对肿瘤起特异性杀伤作用，达到治愈肿瘤的目的，因而具有高度特异性。 热休克蛋白70是体内广泛表达的一种保守蛋白，是热休克蛋白的一种，在热休克等应激状态下表达增加。研究发现热休克蛋白70与多种肿瘤的发生发展有关，在食管癌的研究中也发现热休克蛋白70与食管癌的肿瘤浸润程度、肿瘤病理类型和淋巴结转移有关。研究人员发现，从肿瘤组织或细胞提取的热休克蛋白具有保护机体抵御同种肿瘤再次攻击的能力，热休克蛋白肿瘤疫苗成为了一种新的肿瘤疫苗。已有研究表明在肝癌、肺癌、胃癌和黑色素瘤等肿瘤中提取的热休克蛋白70肽复合物具有在体内外产生抗肿瘤作用的活性，而在食管癌中的研究尚未见报道。 在对热休克蛋白肿瘤疫苗的研究中存在多种肿瘤疫苗形式，其中将热休克蛋白肽复合物与DC联合或者将热休克蛋白肽复合物与肿瘤抗原相结合的疫苗形式为常见的疫苗方式，但对于不同肿瘤，肿瘤疫苗的不同应用形式效果不同。在研究肿瘤疫苗的抗肿瘤作用中，找到最佳的肿瘤疫苗形式，也是决定肿瘤疫苗能
参考文献：
[1]. 肝癌抗原肽的分离、纯化、鉴定及抗原肽疫苗的研究[D]. 郭爱林. 第四军医大学. 2001
[2]. AFP基因修饰的DC细胞的分泌的exosome抗肿瘤作用研究[D]. 黄胜兰. 福建医科大学. 2014
[3]. 人HSP70在毕赤酵母中的表达鉴定及大规模发酵和纯化工艺研究[D]. 马杰. 吉林大学. 2005
[4]. 热休克蛋白70与MAGE-1融合基因疫苗和蛋白疫苗的构建及体内抑瘤效应的研究[D]. 叶菁. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[5]. 卵巢癌相关抗原的筛选及鉴定[D]. 蒋燕明. 广西医科大学. 2005
[6]. 膀胱癌及其癌旁组织gp-96结合肽库的初步探讨[D]. 李常颖. 天津医科大学. 2010
[7]. 高特异性HER2/neu手性多肽疫苗实验研究[D]. 王芳. 吉林大学. 2004
[8]. 胶质瘤相关抗原MAGE-D4基因重组、表达特性分析及抗体血清学检测[D]. 贺菽嘉. 广西医科大学. 2010
[9]. OY-TES-1表达对肿瘤生物学行为的影响及其抗体血清学分析[D]. 罗彬. 广西医科大学. 2010
[10]. 人食管癌细胞热休克蛋白70肽复合物的提取及其抗瘤活性的研究[D]. 周娟. 郑州大学. 2006
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