刘刚[1]2003年在《肝细胞生成素（HPO）结构与功能的研究》文中研究说明肝细胞生成素(Hepatopoietin，HPO)是一种新型肝细胞生长因子，HPO在肝实质细胞中表达，具有刺激肝再生、缓解CCl_4和D-氨基半乳糖引起的肝损伤以及刺激原代肝细胞及肝癌细胞增殖等作用。 自从1997年我国率先克隆出人HPO(hHPO)的cDNA，并在体外重组表达HPO(rhHPO)后，已经证明了rhHPO具有缓解肝损伤、刺激肝细胞及肝癌细胞增殖，治疗重症肝衰竭等作用。近年来的研究表明，在原代培养的大鼠肝细胞以及人肝癌细胞表面存在HPO特异性受体，HPO能够与其受体结合通过MAPK途径刺激肝癌细胞增殖，而且在体外培养的肝癌细胞系中存在刺激其自主性生长的HPO自分泌循环。这些研究结果表明HPO的受体结合活性对于其发挥生物学功能是至关重要的。近年来的研究表明，HPO可以利用FAD为辅基，作为一种氧化还原酶在细胞内发挥作用，HPO空间结构—α螺旋锥形束的揭示也表明了HPO具有结合FAD的活性。那么HPO分子中哪些区段参与其受体的结合活性，进而影响其生物学活性?又有哪些区段在FAD的结合活性中发挥了重要的作用?这些区段在HPO锥形空间结构中具有何种意义?此外，由于在HPO的序列中并没有发现经典的信号肽序列，HPO是以何种机制分泌以维持其自分泌循环，在HPO中是否具有类信号肽的序列来指导其分泌，都是悬而未决的问题。 近年来的研究表明，FGF-9、IL-1β、TRX等多种蛋白，与HPO一样没有经典的信号肽序列，但仍可以借助其它机制分泌到细胞外发挥生物学功能，人们称这一类分泌途径为非经典分泌途径(non-classical secretory pathway)。这就提示我们，HPO可能同这些蛋白类似，具有其独特的分泌机制。 为此，本论文选择人肝癌细胞系HepG2，人肺腺癌细胞系GLC-82作为靶细胞，围绕HPO的结构与其受体结合功能、体外刺激增殖活性和FAD结合活性的关系，以及HPO的分泌机制展开研究。 首先构建、表达了HPO及其系列缺失体，建立了利用FACS分析HPO受体结合活性的体外检测方法。将HPO及其缺失体经FITC标记后，FACS分析结果以及体外刺激增殖结果表明，(1)参与组成HPO锥形结构N-末端无规卷曲的1～10位中文摘要氨基酸残基对于HPO的受体结合活性具有一定的贡献，如果缺失这一段序列，会使其受体结合活性大大下降，相应的体外刺激增殖活性也随之降低。进一步的研究发现，这一段序列对于HPO的受体结合活性并不是必需的，当HPOI一20氨基酸残基缺失后，其受体结合活性会有所提高。(2)参与组成HPO锥形结构中a5螺旋的106一115位氨基酸残基对于HPO的受体结合活性是必需的，如果缺失这一段序列，会使其受体结合活性完全丧失，其体外刺激增殖活性也大大下降。(3)参与组成HPO锥形结构C一末端环状结构的116一125位氨基酸残基对于HPO的受体结合活性具有一定的抑制作用，如果缺失这一段序列，其受体结合活性会显着提高。(4) HPO发挥体外刺激增殖活性与其相应的受体结合活性是密切相关的。如果HPO缺失体的受体结合活性下降，相应的体外刺激活性也随之降低。但对于HPO△CIO的研究发现，它虽然具有很高的受体结合活性，但其体外刺激活性与HPo相比，却下降了17.19%。这说明HPO发挥体外刺激增殖活性是通过HPo特异性受体来介导的，但HPO受体结合活性和体外刺激增殖活性并不完全一致。(5)HPO序列的C一末端对其受体结合活性的贡献要比N一末端大，而且HPO发挥受体结合活性需要HPO锥形空间结构的完整性。 HPO不仅在细胞外具有刺激肝细胞增殖，调节肝再生的作用，它还具有细胞内作用。研究表明，HPO是一种黄素氧化酶，而FAD辅基对于其酶活性是必需的。为此，我们研究了HPO缺失体在FAD结合活性上的差别。对于HPO及其缺失体的FAD结合活性的分析结果表明，(1) HPO的确具有结合FAD的活性。当缺失参与组成HPO锥形结构中Ql螺旋的大部分氨基酸残基，或参与组成HPO QS螺旋的106一125位氨基酸残基，或组成锥形结构C一末端环状结构的全部氨基酸残基缺失后，它们的FAD结合活性完全丧失。而对于不参与HPO锥形空间结构组成的1一10位氨基酸残基缺失后，所得缺失体仍然能够结合FAD。说明HPO结合FAD的活性是建立在HPO锥形空间结构的基础上的。如果在HPO序列中缺失掉组成其锥形结构所必需的氨基酸残基，影响其锥形结构的完整性，就会导致其丧失结合FAD的能力。(2) HPO序列中缺失121~125位氨基酸残基后，由于在这段序列中，并没有参与稳定HPO与FAD结合作用的氨基酸残基，而且其中仅包含锥形结构C一末端环状结构的后4位氨基酸残基，这些氨基酸残基的缺失不会对HPO的锥形结构产生显着的影响，其FAD结合能力依然存在。中文摘要 在对HPO分泌机制的研究发现，HPO虽然没有经典的信号肤序列，却能够以双体的形式从HePGZ细胞中分泌出来。而且特异性阻断经典蛋白质分泌途径(ER一Golgi途径)的抑制剂BFA和莫能菌素对HPo的分泌并没有抑制作用，说明HPO的分泌并不通过ER-Golgi途径，HPO是一种非经典分泌蛋白。 此外，利用作用于非经典分泌途径的药物研究HPO的分泌机制，结果发现优降糖不能抑制HpO的分泌，而AfP、二硝基苯酚(DNp)以及N玩C
周淑萍[2]2007年在《肝细胞生成素基因治疗大鼠肝纤维化的实验研究》文中研究表明肝细胞生成素(hepatopoietin，HPO)是近年来发现的一种肝脏增殖刺激因子，能刺激受损肝细胞的增殖。对HPO受体的研究发现，HPO受体仅分布在肝源细胞的表面，因此，HPO是一种肝脏特异性细胞因子。研究表明，HPO是一种非经典的分泌蛋白质，其分泌途径不经过高尔基体，由于其本身缺乏信号肽序列，其分泌效率不高，细胞表达的HPO主要在于细胞内。这可能是与HPO同时具有细胞内、外功能相适应的一种机制。肝细胞生成素蛋白具有抑制肝纤维化的作用，是一种安全、有效的治疗肝纤维化药物，但重组蛋白进行肝纤维化治疗存在廓清速度快，要反复给药等缺点，采用基因治疗的方法对肝纤维化进行治疗，将会克服上述不足。在利用肝细胞生成素真核表达载体对肝纤维化进行基因治疗的研究中虽然取得了一定的治疗效果，但结果并不理想，其原因可能在于他们的研究中一般是将肝细胞生成素基因直接克隆到非分泌性表达载体中，而由于肝细胞生成素本身无信号肽序列，所以，他们构建的HPO表达载体虽然能够在靶细胞中表达HPO蛋白，但表达的HPO主要存在于细胞浆中，分泌到细胞外的量很少，导致血液中肝细胞生成素达不到有效的治疗浓度，致使治疗效果不理想。要实现HPO基因对肝纤维化良好的治疗效果，必须解决HPO的高效分泌问题，如果不能实现HPO高效分泌表达，则分泌到血液中的HPO可能达不到理想的治疗浓度。在本研究中我们采用外源性信号肽序列引导HPO在真核细胞中通过经典的内质网—高尔基体途径进行分泌，以实现HPO分泌的高效率，达到有效治疗肝纤维化的目的。本研究中分为四个部分，包括有效引导HPO蛋白外源信号肽的确定、CCl_4诱导的大鼠肝纤维化模型的建立、HPO基因预防CCl_4诱导大鼠肝纤维化的实验研究和HPO基因治疗CCl_4诱导大鼠肝纤维化的实验研究。在第一部分中，我们选择了IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)的信号肽、一种高效人工信号肽序列和IgK链信号肽叁种不同的信号肽序列，将它们分别融合表达在HPO的N末端，观察它们引导HPO分泌的效率。将构建的含信号肽的HPO表达载体及不含信号肽的HPO载体瞬时转染COS-7细胞，用Western-blot进行检测。实验结果表明，在选用的这叁种信号肽中，来源于小鼠IgK链信号肽序列引导HPO分泌的效率最高。用Western blot方法直接检测不经浓缩的细胞上清，很容易就能检测到分泌的HPO。而用不含信号肽的HPO真核表达载体瞬时转染后，细胞培养上清中则检测不到分泌的HPO。这充分说明无信号肽的HPO表达载体虽然能够高效表达HPO，但其表达的HPO分泌到细胞外的效率很低。在第二部分中，我们对建立大鼠肝纤维化实验模型进行了摸索。选用健康Wistar大鼠随机分成五组，每组6只，分别用20％、30％、40％、50％四种用橄榄油稀释的CCl_4浓度，按照2ml／kg体重剂量每周定时皮下注射，每周两次，对照组同时注射等量的橄榄油。摸索建立肝纤维化模型所用的CCl_4浓度及诱导时间。连续注射4周、8周后分别处死大鼠，取肝组织用10％甲醛溶液固定后进行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肝细胞损伤及胶原纤维增生程度。在CCl_4注射8周时，各组均有肝纤维化形成，但在40％CCl_4组和50％CCl_4组均有大鼠死亡，而20％CCl_4组大鼠的纤维化形成较轻微，因此确定选用30％作为肝纤维化模型的CCl_4浓度，诱导时间至少8周。第叁部分主要研究含外源信号肽的高分泌型HPO真核表达载体pSec-hhpo及不含信号肽的HPO真核表达质粒pcDNA-hpo对CCl_4诱导肝纤维化大鼠的防治作用。将构建的载体分别注射大鼠，随后用CCl_4进行诱导大鼠肝纤维化，通过对血清中的转氨酶(ALT、AST)、Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)、透明质酸酶(HA)含量、肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量、肝组织中增殖细胞核抗原、α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β的蛋白表达情况进行检测，以及肝组织切片的HE染色、饱和苦味酸-天狼星红-偏振光镜检测肝组织中的Ⅰ、Ⅲ型胶原含量等指标，比较两种质粒对大鼠肝纤维化的防治作用。病理组织切片发现HPO治疗组大鼠肝纤维化程度较模型组明显减轻，显示两种HPO质粒有明显减轻大鼠肝纤维化形成的作用，分泌型HPO质粒作用更加明显，没有明显的纤维化形成；肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量的测定表明两种HPO质粒预防组大鼠肝组织胶原蛋白含量明显低于模型组，HPO可显着降低肝纤维化大鼠的转氨酶水平、血清HA、PⅢNP含量，天狼星红染色显示，模型组有明显的Ⅰ型胶原分布，pcDNA-hpo治疗组大鼠肝组织在中央静脉及汇管区有极少量的胶原纤维形成；pSec-hhpo治疗组与正常对照组大鼠肝组织均未检测到Ⅰ、Ⅲ型胶原的形成；免疫组化检测结果显示pSec-hhpo治疗组大鼠肝脏增殖细胞核抗原阳性细胞数最多，其次为pcDNA-hpo治疗组，模型组大鼠肝脏增殖细胞核抗原阳性细胞较少，证明HPO质粒能够促进受损肝细胞再生，以分泌型HPO质粒作用最为明显。同时，对α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β的蛋白表达情况的检测结果也显示模型组大鼠肝脏成有明显的弥漫性分布，pSec-hhpo治疗组大鼠分布最较少，再次表明pSec-hhpo治疗组大鼠的肝细胞状态最好。通过对以上各项指标的检测，可以发现含信号肽的pSec-hhpo组各项指标均低于模型组，同时肝组织切片的HE染色很直观地显示，pSec-hhpo组无明显的纤维化。动物实验的结果表明，两种HPO真核表达质粒对大鼠肝纤维化都具有一定防治作用，而分泌型HPO表达质粒的疗效更为明显，几乎能够完全预防肝纤维化的形成。第四部分主要是研究含外源信号肽高分泌型HPO真核表达质粒对CCl_4诱导肝纤维化大鼠的治疗作用。先用CCl_4进行诱导大鼠肝纤维化，在造模成功后，分别用pSec-hhpo、pcDNA-hpo两种质粒进行治疗。测定血清AST、ALT活性，透明质酸酶(HA)、羟脯氨酸(Hyp)含量，同时苏木素-伊红(HE)染色光镜下观察肝脏病变程度。通过病理组织切片发现，HPO治疗组大鼠肝组织损伤程度较模型组明显减轻，两种HPO表达质粒均有保护大鼠肝脏的作用，分泌型HPO表达质粒作用更加明显；AST、ALT，HA、Hyp含量测定表明，两种HPO表达质粒治疗组大鼠各项指标均低于模型组。但因治疗时间长，模型组纤维化已恢复，因此，没能体现出分泌型HPO表达质粒对肝纤维化更好的治疗效果，现已改进实验方案，重新试验。
刘刚, 王清明, 陈吉中, 范国才, 陈惠鹏[3]2003年在《HPO结构与受体结合功能关系的初步研究》文中提出肝细胞生成素(HPO)是一种新型细胞因子,在肝再生过程中具有重要的调控作用,研究发现在肝源细胞表面有其特异性受体。为了研究HPO结构与其受体结合功能的关系,构建并表达了HPO及其系列缺失体,利用流式细胞术检测了HPO及其系列缺失体与受体的结合能力。结果表明,在HPO的序列中可能有多个受体结合功能区,其N端的前10位氨基酸残基和C端的第11-20位氨基酸残基对于其受体结合能力是必需的,而C端前10位氨基酸残基对HPO与受体的结合有一定的抑制作用。此外HPO结构的完整性对于其受体结合功能也是必需的。
曹彦, 岳沛彬, 付玉龙, 李长艳, 詹轶群[4]2007年在《线粒体膜间隙蛋白质HPO(Ervlp／Alrp)功能及作用机制的研究》文中认为Erv1p／Alrp 是一类具有重要功能的蛋白,在病毒、酵母、植物以及哺乳动物中保守。该家族蛋白具有依赖 FAD 的巯基氧化酶活性,其高度保守的特征性 CXXC motif 是其巯基氧化酶活性所必须的。肝细胞生成素(HPO)作为酵母 Erv1p 的同源分子,前期研
李英贤[5]2003年在《肝细胞生成素生物学作用的调控机制研究》文中进行了进一步梳理肝细胞生成素(HPO)是与肝脏的再生密切相关的细胞因子，本课题鉴定并证明了两个具有氧化还原酶活性的分子与之存在直接的相互作用，分别为巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和硫氧还蛋白(TRX)，并对这两个分子对HPO生物学作用的调控机制进行了研究。 MIF分子是一个典型的促炎性细胞因子，在细胞内具有巯基还原酶的活性，参与细胞凋亡与增殖的调控。我们的研究结果表明，在细胞外，MIF分子以剂量依赖的方式促进肝细胞的增殖，在细胞内具有增强HPO启动子活性的作用。然而，在胞内，JAB1所介导的MIF胞内信号转导途径对肝细胞的增殖表现为抑制的作用，利用JAB1的反义核酸封闭JAB1，可以增强细胞内表达的MIF对HPO启动子活性的增强作用。在肝细胞内，MIF和HPO可以发生物理性的相互作用，并降低了HPO对AP-1活性的增强作用。二者与JAB1的结合区域基本一致，但是JAB1保守的核外转运序列(NES)对它们的结合具有不同的调控作用。在对AP-1活性的调控方面，二者互为负调控分子。 MIF分子在细胞内作为氧化还原酶发挥作用的性质提示，HPO可能是一个受氧化还原调控的分子。实验表明，HPO对细胞的氧化还原状态较为敏感，在氧化胁迫条件下，可以自组装为二聚体的形式；体、内外实验结果表明，HPO分子和作为氧化还原开关的TRX分子在细胞内外存在直接的相互作用。在体外，二者之间存在直接的二硫键的交换，在体内，HPO可以将TRX氧化。二者的相互作用可以导致对氧化还原敏感的转录因子AP-1和NF-κB活性的增强。 上述的实验结果表明，HPO在胞内的氧化还原调控中发挥着重要的作用，在细胞内通过与MIF和TRX的作用，来发挥其促进肝细胞增殖的作用。
陈筱潇[6]2003年在《肝细胞生成素（HPO）巯基氧化酶活性研究及其与细胞信号转导机制的关系》文中研究表明人们对肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration, ALR)的认识过程起源于对肝再生现象的研究。肝脏再生的特殊性使其无论在临床应用中还是在理论研究上都具有巨大的研究价值，激发了人们研究的热情。其中肝脏再生的启动与调控机理尤引人注目。1975年，LaRrecque等首次证实了在断乳乳鼠的肝脏和肝部分切除后的大鼠再生肝脏中，存在一种能特异刺激肝细胞DNA合成的物质，命名为肝刺激物质(hepatic stimulatory substance, HSS)。1993年，本实验室证明人胎肝中存在同类分子，并揭示其为肝细胞基因表达的产物。Hagiya等于1994年发表了大鼠肝再生增强因子(rALR)的分离、纯化与分子克隆的研究结果。本实验室根据大鼠ALR的cDNA序列从人胎肝cDNA文库中获得了肝细胞生成素(hepatopoietin, HPO )的全长cDNA，继而在国际上率先研制出重组人肝细胞生成素(rhHPO)。HPO最初是从再生肝实质细胞胞浆中发现的肝源性生长因子，对同胚层来源的肺、肾脏、脾脏等器官没有增殖刺激作用，并且HPO在睾丸中也有特异高表达，虽然有报导表明ALR在大鼠的精子发生中有重要作用，但机制尚不明了。HPO在肝细胞内有两种存在形式，<WP=5>分子量分别为15 kDa和23 kDa。它们在肝细胞中的分布不同：15 kDa的HPO只存在于胞核中；23 kDa的HPO既存在于胞核，也存在于胞浆中，但主要在胞浆中。本室前期工作证明，在肝细胞表面存在HPO特异性受体，但在其它组织来源的细胞膜上未发现 HPO受体。以自分泌方式（autocrine）分泌到胞外的HPO通过肝细胞表面受体，在EGF受体的介导下，以丝裂原活性调节肝细胞的增殖并激活胞内MAPK信号转导通路。最近，我们又发现胞内生长因子HPO在辅助激活因子JAB1的介导下能够激活AP-1通路，并且该作用不依赖于MAPK信号途径的激活，也不依赖于JNK途径的活化（即c-Jun磷酸化水平的增强）。但是，HPO受体至今尚未成功克隆，HPO胞内胞外的细胞因子作用的分子机制还不是很清楚。我们在前期工作的基础上展开了进一步的探索。ERV1(essential for respiration and vegetative growth)基因是HPO在啤酒酵母中的直系同源基因。ERV1/ALR/HPO同源物在自然界中广泛分布：病毒、原生动物、昆虫、蛔虫、高等植物、高等动物中都存在其同源基因，通称为ERV/ALR家族。近期研究表明，ERV /ALR/HPO家族成员ERV1、ERV2及E10R均属于一类FAD巯基氧化酶(FAD-linked sulfhydryl oxidase)，可催化还原态蛋白质的自由巯基形成二硫键。它们的蛋白序列中都具有一个保守的CXXC (Cys-Xaa-Xaa-Cys)模体(motif)，蛋白链上都以非共价键结合了一分子FAD。CXXC模体的两个半胱氨酸(Cys)形成一个氧化还原的活性二<WP=6>硫键，以FAD作为递氢体，将底物蛋白上一对自由巯基的氢传递到O2上，催化反应最终生成一分子H2O2 及底物蛋白上的一个二硫键。23 kDa的HPO在酵母内可以替代ERV1p的功能，在人肝细胞中也定位于线粒体上。我们推测，主要存在于肝细胞胞浆的23 kDa HPO可能与ERV1有着相同的功能，即参与胞质Fe/S簇的聚集和Fe/S蛋白的成熟。而15 kDa HPO主要发挥其细胞因子作用，参与胞内及胞外的信号转导途径的调节。那么，HPO的胞内胞外作用有什么联系、如何统一， ERV/ALR/HPO家族蛋白的巯基氧化酶催化活性是否与HPO细胞因子功能相关，作为巯基氧化酶的HPO的生理底物又是什么，这都成为我们关注的新焦点。1. HPO 的链内二硫键分析及其与HPO巯基氧化酶活性的关系为了验证15 kDa HPO的巯基氧化酶活性以及保守CXXC模体是否是HPO的酶活性中心（enzyme active site），在前期对重组HPO蛋白的结构研究基础上，我们对HPO二硫键状态进行了质谱分析。结果显示HPO存在两个链内二硫键，它们分别由Cys-67与Cys-70、Cys-90与Cys-96形成。其中Cys-67与Cys-70正是CXXC模体中的两个半胱氨酸，该链内二硫键与ERV/ALR家族其它成员的巯基氧化酶的活性二硫键的报导一致。接着，我们利用点突变的方法构建了HPO的一系列CXXC位点Cys→Ser的突变体，用E. coli BL-21细胞进行原核表达。羧基端带有组氨酸标签（His-tag）的HPO野生型和突变体融合蛋白经纯化后用于FAD的结合测定实验及体外巯基氧<WP=7>化酶活性测定实验（采用目前公认的“Ellman's reagent法”测量底物自由巯基数的改变以测定巯基氧化酶活性）。结果表明，原核表达的HPO野生型和突变体都结合了FAD分子，野生型HPO具有巯基氧化酶活性，而CXXC突变的HPO则完全丧失其酶活性，CXXC模体是HPO酶活必需的结构。2. CXXC对HPO-HPO自身及HPO-JAB1相互作用的影响ERV/ALR家族成员在生物体内通常是以二聚体的形式存在并与其生理功能密切相关。本室前期研究证明HPO能够在体内及体外形成二聚体且与胞外/胞内HPO的细胞因子活性相关。此外，HPO对AP-1的激活依赖于HPO-JAB1的相互作用，因此我们分别检测了真核表达和原核表达的HPO（野生型和突变体）的二聚体状态，通过酵母双杂交实验、His-pull down实验和免疫共沉淀实验观察了HPO（野生型和突变体）与JAB1的结合情况。结果表明CXXC的突变不影响HPO二聚体的形成，也不影响HPO与JAB1的结合。3. HPO巯基氧化酶活性与其胞内/胞外细胞因子作用的关系
闾军[7]2001年在《HPO-205与EDAG基因的克隆与功能研究》文中研究指明哺乳动物新生肝及胚胎肝中存在特异刺激肝细胞增殖的细胞活性因子。1994年Hagiya等报道从新生鼠肝中分离出肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration，ALR)，并完成其分子克隆。Hagiya等报道的ALR mRNA为1.2 kb，编码125个氨基酸组成，分子量约为15 kD的蛋白质，具有刺激肝细胞增殖的活性。随后一些研究发现在鼠肝组织中用Western blot可以检测到2.3-3.0 kD的阳性区带，并认为这可能与ALR具有同源二聚体结构有关。近来有研究发现，ALR实际上存在1.3 kb和2.7 kb两种转录形式，提示可能存在由不同翻译起始位点致不同翻译产物的可能性。1996年我国学者杨晓明等率先克隆出ALR的人类同源分子-肝细胞生成素(HPO)。人HPO由125个氨基酸组成，分子量约1×5 kD。新近，多个实验室报道了不同的人HPO/ALR/ERV1 mRNA序列，分析这些序列我们发现这些序列具有共同的3′端序列，而其5′端则长短不一，并且在编码人HPO起始密码子ATG前同一阅读框架不含有任何终止密码子。提示这些mRNA可能在5′端不完整。进一步分析人HPO基因组序列发现在HPO起始密码子上游同一阅读框上有另外一个ATG，并可形成一个较大的阅读框架。这些分析提示我们在体内可能存在新的HPO形式。 利用5’Race技术从人胎肝组织中分离一种新形式的肝细胞生成素(HPO-205)cDNA，其编码蛋白质氨基酸序列的N端较已报道人肝细胞生成素HPO(hepatopoietin)多80个氨基酸。其推测蛋白质分子量为23 kD。RT-PCR检测HPO m RNA在多种肝癌细胞中表达，Western blot可检测到23 kD HPO-205表达，表明此种形式HPO在自然状态下存在。将构建的HPO-205真核表达载体转染入COS-7细胞，其表达蛋白质能够刺激HepG2肝癌细胞DNA合成；将HPO-205、HPO和荷空表达载体分别转染人低水平表达HPO的Bel-7402肝癌细胞株，发现HPO-205比HPO具有较强的激活MAPK磷酸化的活性。细胞周期分析稳定转染HPO-205，HPO细胞的 博士学位论文HPry205与EDAG基因的克隆与功能研究 增殖周期也支持这一结论。这些结果表明HPO－205具有刺激肝源性细胞增殖的活 性，并提示HPO．2 05可能较HPO有更强的生物学活性。 研究胚胎发育过程中的基因选择性表达即基因特定时相的打开或关闭是阐明生 长发育调控机制的关键。脊椎动物红系造血的迁移是胚胎发育过程中的一个特殊事 件，在脊椎动物，红系造血最早源于卵黄羹的血岛（blood island），此时的细胞 是有核的，随后才迁人胚胎肝脏，大约在出生前转人骨髓造血，这样一个过程是公 认的研究细胞生长和发育的理想模型，因此研究胚胎肝特别是胚胎造血旺盛期肝组 织的选择性基因表达具有重要意义。 以表达性差异显示分析技术（W）获得一种在人胎肝组织中高丰度表达的基 因片段（命名为EDAG），经筛选。DNA文库及5，末端快速扩增技术m地id 孤呕1。f。cat。on of cDNA 5·end）获得其全长 cDNA 2，166 hp，该基因含编码 484个 氨基酸组成蛋白质的ORF，Blast捡索表明编码蛋白质不含任何已知蛋白质功能结 构域，与小鼠y及大鼠RPH基因同源。其W3，端非图译区序列含2拷贝 AUUUA结构，表明该基因稳定性差。体外翻译证明该基因编码蛋白质分子量为 55．3 kD，与理论预测值一致。Northern杂交及PCR检测表明该基因主要表达在成 人骨髓及胚胎肝组织，在K562和Mo7e两株人髓性白血病细胞系中也有较高丰度表 达。H。in及EPO（叮thropoietin）诱导K562细胞向红系分化过程中，EDAG的表 达随细胞的分化迅速下调；这些结果提示EDAG可能是一种与造血细胞分化调控密 切相关的新基因。 构建 EDAG真核表达载体 pcDNA3．工《＋卜EDAG，以脂质体法将其稳定转染人 NIH3T3细胞中，结果发现高表达EDAG的NIH3T3细胞失去了正常的平行走向及接触 抑制现象，侵袭力较正常增强约10倍并获得了锚定不依赖生长能力。将该细胞株 皮下接种裸鼠，受鼠在4周左右100％（6／6）成瘤。这些结果表明EDAG是一种具 有转化活性的新基因，可能与肿瘤发生、发展密切相关。
贺福初, 张成岗, 李勇, 陆承荣, 张令强[8]2006年在《肝细胞生成素等人胎肝来源新基因的系列研究》文中指出拥有正常、稳定的造血功能是机体生理活动正常发挥的物质基础,同时,尽快恢复机体造血功能也是临床上放射病和辐射损伤治疗,以及肿瘤放化疗后机体恢复的关键环节,因此,具有造血功能的组织器官对机体的重要性不言而喻。大量研究发现, 12-26周孕龄的人胎肝是造血、免疫系统干／祖细
杨明, 付汉江, 铁轶, 朱捷, 江红[9]2005年在《肝细胞生成素的RNA干涉研究》文中认为肝细胞生成素(Hepatopoietin,HPO)为我国科学家首先克隆的一种肝源性的生长因子。早期的研究表明,肝细胞生成素在肝再生及特异性刺激肝细胞增殖中发挥重要作用。HPO在细胞中存在两种形式,15KD的HPO125和23KD的HPO205。近来研究发现HPO可能在肝癌的侵袭转移中发挥重要作用。本研究利用RNA干涉的方法成功沉默了HPO205的表达。首先,利用生物信息学的方法分析HPO的DNA序列,找到8条可能的RNA干涉序列。合成这些序列后,退火,连入干涉载体pSilencer 3.1 H1-Hygro,构建成8种RNA干涉
刘刚, 王清明, 陈吉中, 范国才, 陈惠鹏[10]2005年在《肝细胞生成素——一种非经典分泌蛋白》文中指出肝细胞生成素(hepatopoietin ,HPO)是一种分泌蛋白.为了研究肝细胞生成素的分泌途径,利用SignalP软件分析了HPO的氨基酸序列,但HPO序列中没有经典分泌蛋白的信号肽.Western印迹实验证明,HPO能以双体形式从细胞中分泌出来.特异性体外阻断实验表明,布雷菲尔德菌素A(brefeldinA)和莫能菌素(monensin)都不能阻断HPO的分泌,说明HPO并不通过经典的内质网 高尔基体(ER -Golgi)途径分泌;优降糖(glyburide)对HPO的分泌没有抑制作用,说明HPO的分泌并不是由ABC1(ATP bindingcassette)转运子介导的;DNP和NH4Cl也不能刺激HPO的分泌,说明内体 溶酶体系统不参与HPO的分泌.上述结果表明,HPO是一种非经典分泌蛋白(non classicalsecretoryprotein) ,能以双体形式从细胞中分泌出来.但和已知的非经典分泌蛋白IL -1β不同,HPO的分泌并不是通过ABC1转运子介导的,内体 溶酶体系统也不参与其分泌.
参考文献：
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[3]. HPO结构与受体结合功能关系的初步研究[J]. 刘刚, 王清明, 陈吉中, 范国才, 陈惠鹏. 生物技术通讯. 2003
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