贾萌[1]2016年在《LincRNA-p21通过抑制Notch信号诱导的EMT抑制肝癌细胞侵袭转移》文中进行了进一步梳理肝癌作为恶性肿瘤疾病在临床上发病率最高。这是因为肝细胞癌恶性程度较高,发病后,病情进展快速,患者生存时间相对较短,针对肝细胞癌的治疗手段亦发展迅速,但是受到治疗手段的限制,仍有不少患者在发病5年内死亡。最近发展的分子靶向治疗因其高效性和高特异性逐渐吸引人们的注意。一种非编码RNA是转录本超过200个核苷酸长度的长链非编码RNA(lncRNA),非编码RNA以基因位置决定可以分为5种不同类型,这五类包括双向lncRNA、基因间lncRNA、基因内lncRNA、反义lncRNA、正义lncRNA。通过基因组测序分析,我们发现在人类的基因组中存在大量的长链非编码RNA,而其中有将近24000个左右从参与了多种基因相关功能,主要包括转录激活、核内运输、X染色体沉默、转录干扰、染色质修饰等多项生物学活动。通过对长链非编码RNA的研究深入开展,在多种疾病中长链非编码RNA的作用越来越明显,早期阶段microRNA的研究曾经成为热点,而长链非编码RNA在此之后再次走向研究的前沿。大量的研究指出在肿瘤的发生发展过程中长链非编码RNA的异常表达扮演了重要的角色。这是因为在早期的胚胎发育过程中长链非编码RNA参与了调节过程,因此对于肿瘤的细胞增殖特点和多发性潜能具有明显的激活作用。本文的主要重点研究涉及了长链非编码RNA在肿瘤组织中的功能和作用,有助于寻找控制肿瘤生长的长链非编码RNA。肝癌细胞长链非编码RNA相对于正常肝细胞,其表达谱变化显着,其中主要的变化趋势为上调和下调,而下调趋势更为常见。这些出现异常表达的长链非编码RNA可能涉及了多个生物学过程,其中主要包括蛋白翻译、细胞周期、mRNA剪接、基因转录等多种,表明长链非编码RNA可在蛋白质表达和表达后修饰等过程中发挥作用;同时长链非编码RNA参与了多个重要过程的信号传导调节,其中主要包括JAK-STAT、Notch、p53、MAPK等通路。我们首先通过Real-timePCR的方法分析临床样本和细胞样本,我们证实,与健康组织和正常细胞相比,LincRNA-p21在肿瘤组织中发生表达水平大幅度下调,结果暗示LincRNA-p21可能具有抑制肝癌组织生长的作用。我们通过分析肝癌肿瘤组织乙酰化组蛋白与lincrna-p21启动子的结合情况,发现肝癌组织和肝癌细胞乙酰化组蛋白h3水平对比正常肝脏组织和正常细胞,表达表达存在差异性。解释了为什么正常肝脏组织中lincrna-p21的表达水平高于肝癌组织。为了验证lincrna-p21的生物学功能,我们通过细胞转染的方法改变smmc-7721肝癌细胞内lincrna-p21的表达水平。我们构建了过表达lincrna-p21的smmc-7721细胞株,并在rna水平证明了肿瘤细胞smmc-7721转染后发生了明显的lincrna-p21表达水平增高,同时分析了notch信号蛋白hes-1和nicd的表达,结果发现与正常组织相比,表达显着下降,存在统计学意义(p<0.05)。为了进一步验证notch信号通路与emt相关蛋白表达水平之间的关系,我们通过westernblot检测emt相关蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表达水平,于正常组织相比,表达水平明显下降。接下来我们通过sirna的方法构建lincrna-p21抑制细胞株,我们发现hepg2细胞在发生lincrna-p21抑制后notch信号通路相关蛋白hes-1和nicd的表达水平进行分析,我们发现westernblot检测notch信号蛋白hes-1和nicd的表达对比正常肝脏组织,表达显着提高。而在蛋白水平对emt相关蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表达水平进行分析,我们发现westernblot检测emt相关蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表达对比正常肝脏组织,表达显着提高。通过dapt作用于notch信号通路可以有效抑制肝癌细胞的侵袭迁移过程,我们发现抑制发生后notch信号蛋白hes-1和nicd的表达,结果发现与正常组织相比,表达显着下降,emt相关蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表达出现明显下降。表明抑制notch信号通路将提高emt出现频率,可能会增强肝癌的侵袭性。而激活notch信号将取消lincrna-p21过表达对肝癌细胞侵袭转移的抑制作用。再使用jagged1处理所有实验细胞,之后采用transwell检测细胞侵袭和转移,实验结果表明肿瘤细胞的侵袭力明显提高。为了进一步明确lincrna-p21,notch通路以及emt之间的关系,我们通过抑制notch信号来观察对lincrna-p21干扰对肝癌细胞侵袭转移的促进作用的影响,结果表明抑制notch信号将取消干扰lincrna-p21对肝癌细胞侵袭转移的促进作用。然而,我们再使用dapt处理细胞后,经过transwell检测细胞侵袭和转移,我们发现抑制取消后,肿瘤细胞的侵略力明显降低。通过裸鼠肝癌模型来分析LincRNA-p21可能的机制,我们发现裸鼠感染了转染pcDNA-LincRNA-p21质粒的细胞后,体内肿瘤组织的转移情况明显降低,证明LincRNA-p21的过表达对肝脏肿瘤的侵袭和转移具有明显的抑制作用,随后证明了抑制LincRNA-p21的表达水平将有效促进肿瘤的侵袭和转移。综上所述,我们的研究加深了对肝癌转移机制的进一步理解,证明LincRNA-p21对肿瘤微环境的调控起到重要作用,是其一种新的功能。研究提示肝癌的转移过程应该重新认识,即在转移的不同阶段肝癌细胞利用不同的策略实现其恶性播散。EMT在肝癌细胞的早期侵袭过程中起着重要作用,Notch信号通路在肝癌细胞的远端定植过程中起着重要作用。证明在肝癌的侵袭-转移级联反应的早期及晚期阶段LincRNA-p21都有抑制作用,因此LincRNA-p21有潜力作为一种肝癌侵袭转移的分子靶向治疗手段及判断患者预后的基因标志,同时此研究结果对于肝癌的治疗的预防转移具有较高的临床价值。
彭传会[2]2017年在《p53相关的长链非编码RNA在肝细胞肝癌中的作用和机制研究》文中认为目的肝细胞肝癌在我国乃至全世界都拥有很高的发病率和死亡率,寻找精确诊断和治疗肝细胞肝癌的靶标是急需解决的迫切问题。p53是肝癌发生发展中的一个重要的抑癌分子,它与细胞周期阻滞、细胞凋亡和细胞衰老等均有密切的关系。长链非编码RNA作为近年来的研究热点,已经被证实与多种肿瘤生物学行为相关,并且有一些lncRNAs直接或间接受p53调控,并参与介导p53信号通路。llincRNA-p21和PANDA是两个受p53调控的长链非编码RNA,而且都转录于p21的基因座。然而,作为p53相关的两个重要lncRNAs,他们在肝细胞肝癌中的生物学作用和分子机制仍然知之甚少,有待进一步探索。方法首先,我们用qRT-PCR的方法检测lincRNA-p21和PANDA在p53依赖的DNA损伤模型和索拉非尼治疗肝癌的细胞模型中的表达,验证它们与p53的关系,并且在大样本量的肝癌肝切除和肝癌肝移植临床样本中探索它们在肝癌中的表达谱。其次,我们利用siRNA技术在肝癌细胞中敲低lincRNA-p21,使用CCK-8、流式细胞术、transwell等方法分析lincRNA-p21对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响,并用免疫荧光和免疫印迹的方法,分析发挥生物学功能的分子机制。然后,我们利用慢病毒感染技术在肝癌细胞中过表达PANDA,使用CCK-8、EdU、皮下成瘤、细胞周期、衰老染色、免疫印迹、免疫组化等方法,研究PANDA对肝癌的增殖和衰老的影响,并用qRT-PCR的方法找到PANDA的作用靶基因IL8,通过质粒转染技术过表达IL8,观察其对PANDA的功能拯救效果,再通过启动子荧光双报告和RNApull down技术探索PANDA调控IL8的分子机制,并通过临床样本验证IL8与PANDA的共表达关系。结果首先,我们发现lincRNA-p21和PANDA在p53依赖的DNA损伤模型中明显上调,在肝癌肝切除和肝癌肝移植临床样本中的表达量均明显低于相邻的癌旁组织,并且lincRNA-p21在索拉非尼的治疗过程中明显上调。其次,我们观察到,当llincRNA-p21被敲低时,肝癌细胞的活力增强、细胞周期进展加快、细胞迁移和侵袭能力变强、细胞形态和骨架变得更加灵活,并且相关MMP家族蛋白被上调,肝癌细胞由上皮型向间质型转变,同时伴随着EGFR入核增加。然后,我们发现,当PANDA在肝癌细胞中被过表达时,它能促进体外培养肝癌细胞和皮下种植瘤的生长,可能与细胞周期无关,随后我们发现PANDA过表达中衰老的肝癌细胞所占比例降低,相关衰老的标志包括衰老染色、pl6和y-H2AX等均有所降低。其中PANDA的下游靶基因衰老相关的炎症因子IL8明显降低。过表达IL8可以逆转PANDA在肝癌中的作用,并且IL8与PANDA在临床样本中存在着负相关。最后我们发现PANDA能够直接抑制IL8的转录活性,但并不与IL8蛋白质结合。结论lincRNA-p21和PANDA在肝癌中受p53调控,并在肝癌中显着低表达。敲低lincRNA-p21能够促进肝癌细胞活力、周期进展、迁移和侵袭,可能与lincRNA-p21影响肝癌细胞骨架和EGFR的亚细胞定位相关。过表达PANDA能够促进肝癌增殖和抑制肝癌衰老,可能与PANDA能够抑制衰老相关炎症因子IL8的转录活性相关。p53相关的lincRNA-p21和PANDA在肝癌中均发挥着重要的作用,可能成为肝细胞肝癌诊断的新型标志和治疗的潜在靶点。
刘月[3]2016年在《OLA1抑制p53和p21的表达维持细胞增殖和小鼠胚胎的正常发育》文中提出研究目的：Obg-like ATPase 1(OLAl,也称DOC45)是一种p-loop GTP酶,属于TRAFAC(翻译因子相关)类,Obg家族和YchF亚群,可能在细胞中作为翻译因子和核糖体连接蛋白,信号转导,细胞内运输和应激反应的蛋白存在。但是,目前的研究对于YchF/OLA 1蛋白在生命发生发展过程中的作用尚不明确。同时,目前也缺乏研究OLA1功能直接和有意义的模型。研究内容和方法：建立Ola1基因敲除的小鼠(Ola1-/-),以正常基因型小鼠(Ola1+/+)为对照,观察Ola1-/-胚胎和器官的生长和发育,及小鼠的生长；建立和培养原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),从分子水平研究Ola1-/-小鼠出现增殖和发育阻滞的原因；前期的研究中小鼠胚胎发育的阻滞归因于细胞周期检查点蛋白p53和p21在Ola1-/-MEF细胞和胚胎中的累积,那么进一步我们将对OLA1调节p53和p21蛋白表达的分子机制进行初步的探索。研究结果：我们第一次分析了Olal无义突变的小鼠,发现Olal被完全敲除后,会引起小鼠严重但是不完全的围生期死亡。所有的Ola1-/-胚胎均表现为生长迟滞伴随发育延迟,最终导致出生时器官发育不完全,尤其是肺。原代培养的Olal-/-MEF细胞也表现出明显的细胞增殖能力降低,这主要归因于细胞周期中G1到S期的阻滞,而与凋亡无关。这种细胞周期的阻滞是由cyclinD1、cyclinEl和pRb的降低和p53、p21的堆积所致。通过基因转录、polysome profiling和蛋白降解的研究,结果揭示了Olal-/-MEF细胞中p53和p21的累积分别是由蛋白稳定性的增加和翻译效率的提高所引起的。更重要的是,p21的调节是非p53依赖的,这一点,我们在Ola1-/-胚胎中也得以验证。总的说来,我们的数据第一次指出OLA1作为一个翻译性的GTP酶,通过一种特别的翻译／翻译后机制调控p21和p53的表达,Ola-/-细胞中p53的累积归因于蛋白稳定性的增高,而p21的累积归因于p21mRNA中缺乏上游开放阅读框(uORF)的5'UTR变异体翻译的加强,而这些在维持足够的细胞增殖和发育的完整性上有重要的作用。以上结果表明OLA1是Gl/S检查点通路中p53/p21轴的重要调节分子,在细胞增殖、动物和胚胎发育和生物体生长中发挥着至关重要的作用。结论与创新目前为止,OLA1相关的研究仍较少,而在本研究之前,尚没有文章对OLA1在胚胎发育中的作用进行阐述。而OLA1又是一个非常重要的可调控多种通路的重要蛋白,包括在氧化应激中[1],在乳腺癌、结直肠癌、肺癌的运动和侵袭中[2-4]。而研究OLA1在胚胎发育中的作用可以为我们之后研究OLA1的机制,尤其是与肿瘤的关系提供基础和依据,同时我们建立的Ola1基因敲除的小鼠模型和原代培养的MEF细胞可以作为之后OLA1功能和机制研究的重要工具和手段。1.本文第一次报道了Ola1基因敲除的小鼠的表型。Ola1基因敲除的小鼠80%以上会出现围生期死亡,且这种死亡原因主要为肺部发育不成熟导致的肺不张。而另外少量的生存下来的Ola1-/-小鼠生长到成年仍然表现出“个头”明显小于对照组的情况。而这些变化并不会引起小鼠的寿命和生殖方面的影响。2.本文第一次证明了OLA1可以通过抑制p53和p21的表达促进细胞周期,当Ola1被敲除后会出现细胞周期阻滞,而这种阻滞直接导致胚胎的生长发育受阻,并引起小鼠的围生期死亡,说明了OLA1在小鼠胚胎发育中的重要作用。3.本研究为进一步研究OLA1在肿瘤中的作用提供了基础,p53和p21在肿瘤中都是相当重要的,既有抑癌功能,又有促癌作用,而OLA1可以调节p53和p21的蛋白表达,间接表明OLA1与肿瘤有着非常重要的联系。虽然目前一些研究已经揭示了OLA1与肿瘤的相关性,但机制仍然不明确,本文可为这些进一步的肿瘤研究提供基础。
申霄[4]2016年在《脂肪干细胞微环境对衰老成纤维细胞作用及机制的研究》文中研究说明皮肤的老化是人体衰老最突出的表现之一,减缓皮肤的衰老一直是人们追求的目标。其中真皮成纤维细胞是皮肤中主要功能细胞之一,也是皮肤抗衰老的主要目标细胞。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)存在于成熟脂肪组织中,其含量丰富,提取简便,供区易被患者接受,被认为是有极大应用前景的干细胞。多个研究证实脂肪干细胞据报道可旁分泌多种细胞因子,包括炎症因子、血管源性因子、生长因子等等。这些细胞因子构成了ASCs生长的微环境,通过多种途径对周围组织和细胞产生作用和影响。ASCs本身的分化数量相对较少,它们更像组织细胞活动的组织者,而不是参与者。有许多研究表明ASCs生物活性的生长因子可与周围组织和细胞进行信号传导,并表现出对伤口愈合,组织修复和抗衰老的积极作用。但ASCs微环境对成纤维细胞的长时间作用尚未见报道。ASCs微环境是否会改变成纤维细胞的衰老状态,通过何种机制改变,这些问题都尚不清楚。细胞的衰老本身也是细胞的一种自我保护机制,防止细胞在外界刺激下过度增殖甚至形成肿瘤。其中p53/p21通路是调节细胞周期、导致细胞衰老、防止肿瘤发生的重要信号通路。本课题将用人脂肪干细胞及人真皮成纤维细胞进行非接触性间接共培养,进一步研究脂肪干细胞微环境对真皮成纤维细胞的作用,并通过测定成纤维细胞衰老相关性beta-半乳糖苷酶研究成纤维细胞衰老状态的改变,另外还通过p53、p21蛋白的表达,研究ASCs微环境对细胞复制及应激衰老相关的p53/p21信号通路的变化。一、人脂肪干细胞分离、培养、鉴定及与成纤维细胞共培养体系的建立目的:为研究人ASCs微环境与对真皮成纤维细胞的作用,需分离培养ASCs与成纤维细胞,并用Transwell小室构建细胞间接共培养体系。方法:(1)各取5例青年人(年龄<30岁)及老年人(年龄>60岁)整块腹部皮下脂肪组织(约5g)做CD44免疫组织化学染色,每张切片选择4个视野做阳性细胞计数并观察CD44细胞分布。(2)用负压针管抽吸或切除的脂肪组织分离培养ASCs,并用流式细胞仪对CD34、CD44、CD90做细胞鉴定。(3)分离培养人真皮成纤维细胞,并用Transwell小室与ASCs构建间接细胞共培养体系。结果:(1)脂肪组织的免疫组化染色发现CD44+细胞主要位于纤维结缔组织中,与血管内皮细胞紧密联系。(2)用脂肪组织培养的原代ASCs的表面抗原表达为CD34(-)、CD44(+)、CD90(+)。(3)用Transwell小室成功建立ASCs与成纤维细胞间接共培养体系。结论:CD44+细胞主要位于脂肪的纤维结缔组织中,用注射器抽取的游离脂肪组织可以增加胶原酶消化效率,得到足够的原代ASCs,其抗原表达为CD34(-)、CD44(+)、CD90(+)。用Transwell小室可以构建ASCs与成纤维细胞间接共培养体系。二、脂肪干细胞微环境对真皮成纤维细胞功能的影响目的:研究脂肪干细胞旁分泌因子所构成的微环境对不同年龄人成纤维细胞功能的影响。方法:本实验将成纤维细胞分成4个组,分别在培养后24h、48h、72h用细胞增殖比色法MTT(四唑盐)法检测各组成纤维细胞增殖情况;用实时定量(real-time)PCR检测I型胶原,基质金属蛋白酶-1(MMP-1)m RNA在成纤维细胞中的表达。结果:共培养组的青年和老年HDFs的细胞增殖均显着高于相应对照组(P<0.01)。共培养老年HDFs的MMP-1 m RNA表达与对照组比较在48h后均显着降低(P<0.01)。其中共培养组MMP-1表达在48h时显着下降(P<0.01),但在72h时下降趋势停止(P>0.05)。在对照组,MMP-1的表达随着时间延长逐渐升高(P<0.05)。在前48 h中,共培养的老年HDFs的I型胶原蛋白的表达呈现逐渐增加,然后在72h略微下降(P>0.05)。共培养青年HDFs的I型胶原表达在也前48h显着升高(P<0.01),并在72h显着下降(P<0.05)。对照组成纤维细胞的I型胶原的表达在24h和48h无显着差异(P>0.05),而青年对照组I型胶原表达在72h出现下降(P<0.05)。结论:本部分实验结果表明脂肪干细胞微环境可促进共培养的成纤维细胞的增殖,同时减少MMP-1的产生,并增加I型胶原的表达。结果表明脂肪干细胞微环境可促进细胞增殖,改善细胞的功能。但这种促进作用随着共培养时间的进一步延长逐渐减小,表明脂肪干细胞微环境可能无法长时间改善成纤维细胞的功能。叁、人脂肪干细胞微环境对成纤维细胞衰老状态的改变及对p53/p21通路的影响目的:探索ASCs微环境对成纤维细胞衰老状态的作用及对p53/p21通路的影响方法:分别在培养后24h、48h、72h用real-time PCR法检测各组成纤维细胞衰老相关β-半乳糖苷酶m RNA的变化;用western blot法检测各组成纤维细胞p53、p21蛋白的表达。结果:两个对照组成纤维细胞在第一个24h时在SA-β-Gal的表达无显着差异(P>0.05),培养24小时后各组HDFs中SA-β-Gal的m RNA表达水平的逐渐增加(P<0.05)。老年组HDFs的SA-β-Gal的在每个时间点均表现出更高的表达水平(P<0.01)。两个共培养组中的SA-β-Gal的表达较对照组显着增加更显着(P<0.05)。在各时间点ASCs共培养的成纤维细胞的p53蛋白较对照组的表达均显着升高(P<0.05),p21蛋白表达的检测结果表现出与p53蛋白类似的逐渐升高的趋势(P<0.05),但其升高的幅度要小于p53蛋白。并且在第24h时,共培养组与对照组p21蛋白的表达无显着差异(P>0.05)。结论:与脂肪干细胞微环境下共培养的成纤维细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶m RNA表达会升高,并且随着共培养时间的延长这种作用更加明显,同时p53与p21蛋白也随着培养的时间延长而增加,其中p53蛋白升高得更早、更快,表明脂肪干细胞微环境通过p53/p21通路促进了成纤维细胞的衰老。
陈延青[5]2016年在《睾酮与血管衰老关系的实验研究》文中指出1研究背景血管衰老是心血管疾病的首要危险因素。在血管衰老的基础上,衰老相关心血管疾病的发生率和严重程度明显增加。多种病理生理学机制参与血管衰老的形成过程,影响血管壁细胞和细胞外基质重构,并最终导致血管弹性减弱、僵硬度增加。大量证据表明细胞衰老在血管衰老以及衰老相关心血管疾病的发生发展过程中发挥重要作用。在血管衰老动脉模型、人动脉粥样硬化斑块、缺血性心肌病患者冠状动脉粥样硬化斑块中均发现有衰老细胞的存在。并且在对提取自动物衰老血管以及人动脉粥样硬化斑块的血管细胞进行体外培养时发现细胞表现出生长受限和较早进入衰老状态的特征。衰老细胞代谢异常、凋亡增加,引起血管壁细胞和细胞外基质成分的改变,促进了血管衰老形成和血管僵硬度增加。随着年龄的增长,男性雄激素水平逐渐降低。研究表明低睾酮水平与男性心血管疾病高发密切相关,并且低睾酮水平与男性血管衰老的表现如颈动脉内中膜增厚、主动脉钙化、动脉粥样硬化等相关。睾酮替代治疗能够改善衰老相关的血管病变,改善多种心血管危险因素。提示睾酮替代治疗具有广泛的心血管益处,但其机制尚不清楚。近年来,睾酮改善细胞衰老的作用受到关注。研究表明睾酮能够改善快速老化小鼠海马内皮细胞和神经元细胞衰老,改善阿霉素诱导的心肌细胞衰老。但是,睾酮与血管衰老和细胞衰老的关系还尚未完全阐明。Gas6是由生长停滞特异性基因6所编码的一种分泌型蛋白,隶属于维生素K依赖性蛋白家族。Gas6通过与TAM酪氨酸受体家族结合发挥生物学功能,该受体家族包含叁个成员Tyro3、Axl和Mer,其中Tyro3主要分布于脑及中枢神经系统中,Mer仅存在于单核细胞中,Axl分布广泛,并且与Gas6的结合能力最强,介导了Gas6的大部分生物学功能,因此常被称为Gas6/Axl信号通路。大量研究表明Gas6/Axl通路参与了多项心血管疾病的病理生理过程,例如血管损伤修复、钙化、动脉粥样硬化形成、血栓形成等。并且,Gas6基因多态性与急性冠脉综合征及脑卒中密切相关。临床研究表明血清Gas6水平随着年龄增长而降低,并且与血清睾酮水平相关。随着研究的深入,Son等人在体外证实睾酮能够促进Gas6表达,并在Gas6启动子序列上发现有功能的雄激素受体结合位点,睾酮能够通过该位点调节gas6基因的转录过程。并且我们前期研究发现,Gas6/Axl通过对周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制物p16、p21、p27的调节促进细胞周期G1/S期转位从而发挥抗VSMCs衰老的作用。尽管Gas6/Axl在心血管系统中具有重要作用,并兼具接受雄激素调控和延缓细胞衰老的特点,但是Gas6/Axl是否参与睾酮对血管细胞衰老的调节还不清楚。鉴于Ang Ⅱ在促进血管衰老和细胞衰老过程中的重要作用,本研究将选用Ang Ⅱ建立VSMCs诱导衰老模型,探讨睾酮对Ang Ⅱ诱导的VSMCs衰老的影响,及Gas6/Axl通路在睾酮改善VSMCs衰老中的作用。2研究目的(1)采用Ang Ⅱ建立VSMCs诱导衰老模型,探讨睾酮对VSMCs衰老的保护作用；(2)探讨Gas6/Axl/Akt/FoxO信号转导通路在睾酮改善VSMCs衰老过程中的作用。3研究方法3.1原代小鼠血管平滑肌细胞提取和培养选取8-10周龄雄性C57BL/6J小鼠6只,脱颈处死并消毒后转移至超净台内。无菌条件下将主动脉剥离下来并去除外膜,将中膜剪成1 mm2大小的组织块,然后将剪碎的组织块均匀平铺于培养瓶底部。将培养瓶垂直放置于37℃细胞培养箱中贴壁,此过程大约需要120 min。组织块贴壁之后,加DMEM/F12培养基进行培养,绝对静置3天。3-5天后进行换液,此时可有少量细胞长出。之后每2-3天换液一次,7-10天后可见大量细胞长出。3.2 VSMCs诱导衰老模型的建立选用P3-5代的小鼠VSMCs种于6孔板中,用10-6M Ang Ⅱ刺激48小时建立小鼠VSMCs诱导衰老模型。3.3 VSMCs诱导衰老模型的鉴定采用Western blot检测p16INK4a和p21Cipl的表达和β-半乳糖苷酶染色的方法来检测VSMCs衰老情况。3.4 β-半乳糖苷酶染色控制实验结束时细胞密度在70～80%左右,固定液固定后,用p-Gal染液在无C02的37℃恒温箱中孵育过夜,染色结束后用倒置相差显微镜进行观察并拍照保存。3.5 Western blot检测实验结束后,提取细胞总蛋白,Western blot检测小鼠血管平滑肌细胞内Gas6、Axl、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、 MT1-MMP、p-Akt、Akt、p-FoxO1a、FoxO1和β-actin蛋白表达。3.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测实验结束后,收集细胞培养上清液,ELISA检测细胞上清液中Gas6蛋白含量。3.7明胶酶谱检测实验结束后,收集细胞培养上清液,明胶酶谱法检测MMP-2酶活性。3.8 siRNA转染实验FoxO1a-siRNA转染所用细胞为MOVAS细胞系,转染时间为6小时,转染结束后进行后续实验。3.9统计学分析所有结果均以均数±标准差表示。所有统计学分析均采用SPSS 20.0统计软件进行。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用One-way ANOVA统计方法进行。P<0.05作为差异有统计学意义。4研究结果4.1睾酮最适作用浓度和作用时间的筛选与对照组相比,睾酮浓度在30和300nM时能明显降低衰老相关p16INK4a和P21cipl的表达。与对照组相比,30 nM睾酮在24、36、48小时时能显着降低p16INK4a和p21Cip1的表达。因此选择30 nM,24 h作为睾酮最适作用浓度和时间用于后续实验。4.2睾酮对Ang Ⅱ诱导的VSMCs衰老的影响与对照组相比,Ang Ⅱ (10-6 M,48 h)能够显着增加p16INK4a和p21CipI的表达和p-半乳糖苷酶染色阳性细胞数量。与Ang Ⅱ刺激组相比,睾酮能够显着降低Ang Ⅱ诱导的p16INK4a和p21Cipl的表达和β-半乳糖苷酶活性。4.3 Ang Ⅱ对Gas6/Axl表达的影响与对照组相比,Ang II显着降低VSMCs中Gas6和Axl蛋白表达和细胞上清液中Gas6含量。4.4睾酮对Gas6/Axl表达的影响睾酮能够浓度和时间依赖性促进Gas6/Axl的表达。与对照组相比,30、300 nM睾酮能够显着增加Gas6/Axl的表达。与对照组相比,睾酮干预24、36、48 h能够显着增加Gas6/Axl的表达。4.5 Gas6中和抗体Axl-Fc对睾酮改善VSMCs衰老的影响与对照组相比,Axl-Fc能够显着增加p16INK4a和p21Cipl表达,以及p-半乳糖苷酶染色阳性细胞数量。与Ang 11+睾酮干预组相比,Axl-Fc能够明显阻断睾酮降低p16INK4a和p21Cip1表达的作用。4.6 Axl阻断剂R428对皋酮改善VSMCs衰老的影响与对照组相比,R428能够显着增加p16INK4a和p21Cipl表达,以及p-半乳糖苷酶染色阳性细胞数量。与Ang Ⅱ+睾酮干预组相比,R428能够明显阻断睾酮降低p16INK4a和P21cipl表达的作用。4.7睾酮减少Ang Ⅱ诱导的胶原Ⅰ/Ⅲ的表达与对照组相比,Ang Ⅱ能够显着增加胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达。与Ang Ⅱ刺激组相比,睾酮干预能够显着降低Ang Ⅱ诱导的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达。4.8 Axl-Fc对睾酮降低胶原Ⅰ/Ⅲ表达的影响与对照组相比,Axl-Fc能够显着增加胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达。与Ang Ⅱ+睾酮干预组相比,Axl-Fc能够明显阻断睾酮减少胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达的作用。4.9 R428对睾酮降低胶原Ⅰ/Ⅲ表达的影响与对照组相比,R428能够显着增加胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达。与Ang Ⅱ+睾酮干预组相比,R428能够明显阻断睾酮减少胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达的作用。4.10睾酮对Ang Ⅱ诱导的MMP-2表达和活性的影响与对照组相比,Ang Ⅱ显着增加MMP-2表达和活性。与Ang Ⅱ刺激组相比,睾酮能够显着降低Ang Ⅱ诱导的MMP-2表达和活性。与对照组相比,Ang Ⅱ能够显着增加MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值,减少TIMP-2表达。与Ang Ⅱ刺激组相比,睾酮能够显着降低MT1-MMP的表达和MT1-MMP/TIMP-2比值,升高TIMP-2表达。4.11 Axl-Fc对睾酮调节MMP-2表达和活性的影响与对照组相比,Axl-Fc显着增加MMP-2表达和活性。与睾酮刺激组相比,Axl-Fc明显阻断睾酮降低MMP-2表达和活性的作用。与对照组相比,Axl-Fc能够显着增加MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值,降低TIMP-2表达。与睾酮干预组相比,Axl-Fc能够明显阻断睾酮降低MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值和升高TIMP-2表达的作用。4.12 R428对睾酮调节MMP-2表达和活性的影响与对照组相比,R428显着增加MMP-2表达和活性。与睾酮刺激组相比,R428明显阻断睾酮降低MMP-2表达和活性的作用。与对照组相比,R428能够显着增加MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值,降低TIMP-2表达。与睾酮刺激组相比,R428能够明显阻断睾酮降低MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值和升高TIMP-2表达的作用。4.13睾酮对Akt/FoxO信号通路的影响与对照组相比,Ang Ⅱ刺激组Akt和FoxO1a磷酸化水平降低。与Ang Ⅱ刺激组相比,睾酮干预组Akt和FoxO1a磷酸化水平明显升高。4.14 Axl-Fc对睾酮调节Akt/FoxO磷酸化水平的影响与对照组相比,Axl-Fc显着降低Akt和FoxOla磷酸化水平。与睾酮刺激组相比,Axl-Fc明显阻断睾酮升高Akt和FoxO1a的磷酸化水平的作用。4.15 R428对睾酮调节Akt/FoxO磷酸化水平的影响与对照组相比,R428显着降低Akt和FoxO1a磷酸化水平。与睾酮刺激组相比,R428明显阻断睾酮升高Akt和FoxO1a磷酸化水平的作用。4.16 Akt在睾酮调节MMP-2表达和活性中作用与对照组相比,LY294002显着增加MMP-2表达和活性。与Ang Ⅱ+睾酮组相比,Ang Ⅱ+睾酮+LY294002组MMP-2表达和活性都显着升高。与对照组相比,LY294002显着增加MT1-MMP表达和MT1-MMP/TIMP-2比值,降低TIMP-2表达。与Ang Ⅱ+睾酮组相比,Ang Ⅱ+睾酮+LY294002组MT1-MMP表和MT1-MMP/TIMP-2比值显着升高,TIMP-2表达显着降低。4.17 Fox01a-siRNA的转染效率与对照组相比,FoxO1a-siRNA干扰组FoxO1a蛋白表达明显减低。FoxO1a-siRNA对FoxO1a蛋白的抑制率达到70%左右。4.18 FoxO在睾酮调节MMP-2表达和活性中作用与对照组相比,FoxO1a-siRNA干扰组MMP-2表达和活性均明显降低。与Ang Ⅱ刺激组相比,Ang !+FoxO1a-siRNA干扰组的MMP-2表达和活性均明显降低。MMP-2表达和活性在Ang Ⅱ+FoxO1a-siRNA干扰组、Ang Ⅱ+FoxO1a-siRNA干扰+睾酮干预组和Ang Ⅱ+睾酮干预组之间没有统计学差异。与对照组相比,FoxO1a-siRNA干扰组MT1-MMP表达,MT1-MMP/TIMP-2比值明显降低,TIMP-2表达显着升高。与Ang Ⅱ刺激组相比,Ang Ⅱ+FoxO1a-siRNA干扰组MT1-MMP表达,MT1-MMP/TIMP-2比值明显降低,TIMP-2表达显着升高。MT1-MMP和TIMP-2表达以及MT1-MMP/TIMP-2比值在Ang Ⅱ+FoxO1a-siRNA干扰组、AngⅡ+FoxO1a-siRNA干扰组+睾酮干预组以及Ang Ⅱ+睾酮干预组之间没有统计学差异。4.19 Akt在睾酮延缓VSMCs衰老中的作用与对照组相比,PI3K抑制剂LY294002能够促进P16INK4a和p21Cip1表达；与睾酮组相比,睾酮+LY294002组p16INK4a和p21CipI表达显着增加;与Ang Ⅱ+睾酮组相比,Ang Ⅱ+睾酮+LY294002组p16INK4a和P21Cipl表达显着增加。与LY294002 对 p16INK4a表达的调节作用相比,LY294002对p21Cipl表达的调节作用更强。5结论(1)睾酮能够改善Ang Ⅱ诱导的小鼠VSMCs衰老和胶原代谢异常；(2) Gas6/Axl在睾酮延缓Ang Ⅱ诱导的小鼠VSMCs衰老和抑制胶原合成过程中发挥重要作用；(3) Akt/FoxO1a参与了睾酮延缓Ang Ⅱ诱导的小鼠VSMCs衰老和胶原合成过程。1研究背景血管衰老是心血管疾病的独立危险因素和危险性预测因子。随着人民平均寿命的延长和老龄化的加剧,血管衰老的发生率呈逐年上升的趋势。在血管衰老的基础上,动脉粥样硬化、高血压、脑卒中等心血管疾病的发病率和严重程度明显增加。血管衰老的程度在很大程度上决定着老年人心血管系统的健康状况。尽管血管衰老的发生率在逐年升高,并且与衰老相关心血管疾病关系密切,但是血管衰老发生发展的机制仍所知甚少。血管衰老,即使在不合并动脉粥样硬化的情况下,也会引起大动脉管腔扩张、内中膜厚度增加以及弹性的逐渐丧失,而这些改变最终将引起动脉僵硬度增加、单纯收缩压升高、脉压增大以及舒张压的不变或降低。血管的弹性与血管中细胞外基质成分的构成密切相关。血管中细胞外基质成分主要包括胶原、弹力纤维、糖蛋白、蛋白多糖等,其中胶原和弹力纤维的相对含量是决定血管弹性的主要因素。正常情况下,大动脉富有弹性,动脉壁中弹力纤维含量较高、胶原含量较少。衰老可引起动脉壁胶原沉积增多,弹力纤维破坏增加,以及其它细胞外基质成为如整合素、纤维连接蛋白等的增多,这些改变都将促进动脉僵硬度增加。近年来,研究表明细胞衰老在血管衰老发生发展过程中发挥重要作用,细胞衰老的改变情况与血管衰老的程度存在一致性。研究发现,老年人动脉壁中衰老VSMCs合成和分泌基质金属蛋白酶增多,衰老内皮细胞合成和分泌纤维连接蛋白增多。另有研究表明,衰老内皮细胞和VSMCs凋亡增加,而衰老成纤维细胞凋亡减少。衰老细胞的这一系列变化共同引起血管壁中细胞和细胞外基质成分的改变,进而促进血管重构和血管衰老形成。雄激素是维持男性生理健康的重要激素。随着人口老龄化的加剧,将会有越来越多的男性面临雄激素不足的问题。研究认为,睾酮撤退是男性心血管疾病的独立危险因素之一。研究表明低睾酮水平与血管僵硬度增加密切相关,并且在年轻男性以及伴随有血压升高的男性相关性更强。低睾酮水平还与中老年男性颈动脉内中膜厚度增加、颈动脉粥样硬化斑块形成以及冠心病等衰老相关心血管疾病密切相关。睾酮替代治疗能够改善衰老相关的血管病变,改善多种心血管危险因素,提示睾酮替代治疗具有心血管益处,但遗憾的是睾酮改善血管硬化的分子病理学机制仍所知甚少。近年来,睾酮改善细胞衰老的作用被发现。研究表明睾酮具有改善快速老化小鼠海马内皮细胞和神经元细胞衰老,改善阿霉素诱导的心肌细胞衰老的作用。我们在论文Ⅰ中也证实了睾酮改善Ang Ⅱ诱导的VSMCs衰老的作用,并证实Gas6/Axl信号通路在睾酮延缓VSMCs衰老过程中起关键作用。Gas6是由生长停滞特异性基因编码的一种分泌型蛋白,通过与其受体Axl结合发挥其生物学功能。Gas6/Axl在心血管系统中具有广泛的作用,参与血管损伤修复、动脉粥样硬化和钙化形成等多个过程。另外,基因多态性分析显示,gas6基因与急性冠脉综合征以及脑卒中关系密切。研究还发现,Gas6是睾酮的下游效应分子,血清Gas6水平随着年龄和睾酮水平的变化而变化。并且Son等人在Gas6启动子序列上发现了雄激素受体(AR)结合位点,睾酮能够通过AR对Gas6进行调控。我们在论文Ⅰ中也进一步证实了睾酮能够浓度和时间依赖性促进VSMCs合成和分泌Gas6。综上所述,Gas6/Axl信号通路可能通过改善细胞衰老、减轻细胞外基质重构,在睾酮改善血管衰老和血管重构过程中发挥关键作用,但目前尚未见类似报道。因此,我们利用自然衰老的方法建立WT和Axl-/-衰老模型,观察十一酸睾酮(TU)替代治疗对血管衰老的影响,并探讨Gas6/Axl信号通路在TU替代治疗改善血管衰老中的作用以及可能的机制。2研究目的(1)探讨TU替代治疗对血管衰老及血管重构的影响；(2)探讨Axl在TU调节血管衰老和血管重构中的作用；(3)明确TU替代治疗及Axl基因敲除对下游信号分子Akt/FoxO1a磷酸化水平的影响。3研究方法3.1小鼠衰老模型的建立及雄激素的给予90只雄性WT小鼠和90只雄性Axl-/-小鼠分别随机分为3组：年轻组(n=30,3月龄),衰老组(n=30,18月龄),睾酮替代治疗组(n=30,18月龄)。睾酮替代治疗组于15月龄开始给予十一酸睾酮(37.9mg/Kg)颈背部注射,每月一次,一共叁次。衰老组于15月龄开始给予溶媒试剂颈背部注射,方法同睾酮替代治疗组。实验结束后留取标本。3.2超声检测分别于3月龄、15月龄和18月龄行颈动脉和腹主动脉超声检查。检测指标包括内中膜厚度(IMT),收缩期内径(Ds),舒张期内径(Dd)和血流速度等。3.3血压检测分别于3月龄、15月龄和18月龄采用小动物尾部血管检测仪监测收缩压、舒张压、平均动脉压和心率等指标。3.4 Western blot检测提取组织总蛋白,Western blot检测小鼠主动脉Gas6、Axl、p16INK4a、 p21Cip1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、MT1-MMP、p-Akt、Akt、p-FoxO1a、FoxO1和P-actin的蛋白表达。3.5实时定量PCR检测提取小鼠主动脉总RNA,采用实时定量荧光PCR技术检测Gas6、Axl和β-actin的mRNA表达水平。3.6端粒长度的测量提取小鼠主动脉总DNA,采用实时定量荧光PCR技术检测相对端粒长度。3.7酶联免疫吸附试验(EL ISA)检测实验结束后,采用心脏取血的方法留取血清,ELISA检测血清睾酮和Gas6水平。3.8组织病理学检测对小鼠主动脉分别进行HE染色、Masson染色、天狼猩红染色和Verhoeff染色,并统计主动脉中膜胶原和弹力蛋白的含量以及弹力板断裂情况。3.9免疫组织化学染色采用免疫组织化学染色的方法检测胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、MMP-2和MMP-9的表达和分布情况。3.10明胶酶谱采用无蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液提取主动脉总蛋白,利用明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9酶活性。3.11统计分析方法所有结果均以均数±标准差表示。所有统计学分析均采用SPSS 20.0统计软件进行。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用One-way ANOVA方法进行。P<0.05作为差异有统计学意义。4研究结果4.1衰老动物中睾酮和Gas6/Axl表达的改变与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组血清睾酮和Gas6水平显着降低。与WT和Axl-/-衰老组相比,WT和Axl-/- TU替代治疗组血清睾酮和Gas6水平明显升高。与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组小鼠主动脉Gas6明显降低。与WT和Axl-/-衰老组相比,WT和Axl-/-TU替代治疗组Gas6表达明显升高。与WT年轻组相比,WT衰老组小鼠主动脉Axl表达明显降低。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组Axl表达明显升高。Axl-/-基因敲除组Axl表达处于低水平。4.2 TU通过Axl改善血管细胞衰老与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组相对端粒长度明显缩短。与WT衰老组相比,WTTU替代治疗组相对端粒长度轻微延长。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组相对端粒长度无明显改变。与WT和Axl-/-年轻对照组相比,WT和Axl-/-衰老组p16INK4a和p21Cip1表达显着升高。与WT衰老组相比,WTTU替代组p16INK4a和p21Cip1表达明显降低。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组p16INK4a和p21Cip1表达升高更明显。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组p16INK4a和p21Cip1表达无明显改变。4.3 TU替代治疗和Axl基因敲除对衰老血管结构的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组颈动脉和腹主动脉内种膜厚度(IMT)、收缩期内径(Ds)和舒张期内径(Dd)明显增加、扩张幅度(CD)明显减小。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组CD降低更明显。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组颈动脉和腹主动脉IMT减小、CD增大、Ds和Dd变化不明显。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组颈动脉和腹主动脉IMT、 CD、Ds和Dd变化均不明显。4.4 TU替代治疗和Ax l基因敲除对血管僵硬度的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组颈动脉和腹主动脉僵硬系数(β)和血管压力-应变弹力模量(Ep)明显增加,动脉扩张系数(DC)和动脉顺应性系数(CC)明显减少。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组β和Ep升高更明显,DC降低更明显。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组颈动脉和腹主动脉β和Ep减小,DC和CC增大。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/-TU替代治疗组颈动脉和腹主动脉β、Ep、DC口CC变化不明显。4.5 TU替代治疗和Ax l基因敲除对血压的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MAP)和脉压差(PP)明显增加。SBP、DBP、MAP和PP在WT衰老组与Axl-/-衰老组之间没有明显差异。与WT衰老组相比,WTTU替代治疗组PP明显降低,SBP、DBP、MAP变化不明显。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/-TU替代治疗组SBP、DBP、MAP和PP变化不明显。4.6 TU替代治疗和Axl基因敲除对血管纤维化的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组胶原沉积、胶原/弹力纤维比值以及平均主动脉壁结构评分均明显增加,弹力纤维含量降低。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组胶原／弹力纤维比值升高更明显,胶原沉积、弹力纤维含量以及平均主动脉壁结构评分无明显差异。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组胶原沉积、胶原/弹力纤维比值以及平均主动脉壁结构评分均有所降低,弹力纤维含量有所升高。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/-TU替代治疗组胶原沉积、弹力纤维含量、胶原/弹力纤维比值以及平均主动脉壁结构评分无明显差异。与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组胶原Ⅰ/Ⅲ表达明显增加。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组胶原Ⅰ/Ⅲ表达升高更明显。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组胶原Ⅰ/Ⅲ表达有所降低。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组胶原Ⅰ/Ⅲ表达无明显差异。4.7睾酮替代治疗和Ax l基因敲除对MMP2/9表达和活性的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组MMP-2和MMP-9表达和活性以及MT1-MMP表达、MT1-MMP/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值明显增加,TIMP-1和TIMP-2表达降低。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组MMP-9表达和活性以及MT1-MMP/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值升高更明显。与WT衰老组相比,WT TU替代治疗组MMP-2和MMP-9表达和活性以及MT1-MMP表达、MT1-MMP/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值有所降低,TIMP-1和TIMP-2表达有所升高。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组MMP-2和MMP-9表达和活性、MT1-MMP、TIMP-1和TIMP-2表达、以及MT1-MMP/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1比值无明显差异。4.8睾酮替代治疗和Axl基因敲除对Akt/Fxo01a磷酸化水平的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组Akt和FoxO1a磷酸化水平明显降低。与WT衰老组相比,Axl-/-衰老组Akt和FoxO1a磷酸化水平降低更明显。与WT衰老组相比,WT TU替代组Akt和FoxO1a磷酸化水平有所升高。与Axl-/-衰老组相比,Axl-/- TU替代治疗组Akt和FoxO1a磷酸化水平无明显差异。5研究结论(1)TU替代治疗可以改善血管?
王子薇[6]2016年在《胃癌耐药相关microRNA表达谱及miR-17-5p逆转胃癌细胞耐药作用的研究》文中认为背景：胃癌是全球肿瘤致死主要原因之一,在我国是仅次于肺癌死亡率排名第二的恶性肿瘤。化疗是胃癌治疗的重要手段之一。胃癌细胞对化疗药物产生耐药性导致胃癌化疗失败的主要原因之一。胃癌患者如果对化疗出现耐药情况,预后较差,所以明确胃癌细胞产生耐药的分子机制十分重要。microRNA (miRNA)是内源性非编码小RNA分子,它们通过调节靶基因mRNA的翻译或降解而起到调节基因的作用。miRNA在肿瘤中通过对下游靶基因的调节,对其发生与发展起到至关重要的作用。近年来的研究证实了miRNA在抗肿瘤药物的敏感性和耐药性中起了重要作用。以特定的miRNA为治疗靶点,通过比较miRNA表达谱,与肿瘤细胞耐药性密切相关的特定miRNA将被识别,这可能为新的靶向治疗方案开辟途径,从而改善治疗效果。然而miRNA影响胃癌细胞耐药性的作用机制并不明了。因此准确寻找对胃癌耐药细胞影响较大的miRNA并探讨其作用机制,成为亟待解决的重要问题。本研究拟在两种耐药胃癌细胞SGC7901/DDP和BGC823/5-FU中筛选出与亲本细胞表达差异较大的miRNA,并深入探讨其对细胞耐药性的影响作用及其作用机制。目的：在两种耐药胃癌细胞SGC7901/DDP和BGC823/5-FU中分析miRNA表达谱,筛选耐药相关特异性miRNA;研究耐药相关miRNA对胃癌细胞株耐药性的影响；寻找潜在靶点,探讨其作用分子机制,以期为新的靶向治疗方案开辟途径。方法：采用基因芯片技术分别检测胃癌细胞SGC7901及其耐药细胞SGC7901/DDP、胃癌细胞BGC823及其耐药细胞BGC823/5-FU的miRNA的表达差异情况,寻找在两株胃癌耐药细胞中与亲本细胞之间寻找表达差异较大的miRNA,并采用实时定量PCR方法进行验证。通过体外转染抑制序列anti-miR-17-5p序列下调细胞中的miR-17-5p表达,CCK-8法分析转染后细胞对长春新碱、阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂的药物敏感性变化。运用生物信息学工具PicTar和Miranda algorithms预测miR-17-5p的靶基因。构建荧光素酶报告质粒pGL3-p21-3'-UTR验证miR-17-5p与预测靶基因p21的相互作用。通过WesternBlot方法检测胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP和BGC823/5-FU中miR-17-5p对p21的调控作用。流式细胞术检测miR-17-5p对胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP和BGC823/5-FU细胞凋亡和细胞周期的影响。细胞计数的方法检测miR-17-5p对胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP和BGC823/5-FU细胞生长的影响。结果：基因芯片分析结果显示：与SGC7901细胞相比,SGC7901/DDP细胞中miR-17-5p的表达明显上调(P<0.01); BGC823/5-FU细胞中miR-17-5p的表达较BGC823细胞明显上调(P<0.01)。实时定量荧光PCR分析结果显示：耐药SGC7901/DDP与BGC823/5-FU细胞中miR-17-5p表达水平均显着上调(P<0.01)。抑制SGC7901/DDP细胞和BGC823/5-FU细胞中miR-17-5p表达可有效提高细胞对顺铂、阿霉素、长春新碱和5-FU的药物敏感性(P<0.05)。根据生物信息学工具的预测miR-17-5p的靶基因可能为p21。对p21基因3’非编码区报告质粒荧光素酶活性测定显示miR-17-5p可显着降低pGL3-p21-3'-UTR相对荧光酶活性(P<0.05)。在胃癌耐药细胞SGC7901/DDP和BGC823/5-FU中抑制miR-17-5p表达可明显增加p21蛋白的表达(P<0.05)。抑制miR-17-5p表达还可抑制胃癌耐药细胞SGC7901/DDP和BGC823/5-FU的生长(P<0.05),并诱导细胞凋亡(P<0.05)。在胃癌耐药细胞SGC7901/DDP和BGC823/5-FU中抑制miR-17-5p表达可使G1期细胞明显减少,而S期细胞明显增多,引起细胞周期G1-S期阻滞(P<0.05)。结论：与亲代非耐药胃癌细胞相比,miR-17-5p在耐药细胞SGC7901/DDP和BGC823/5-FU细胞中表达显着增高。抑制miR-17-5p表达可明显改善胃癌细胞耐药性,同时抑制胃癌耐药细胞的生长活力、诱导细胞凋亡病引起细胞周期G1-S期阻滞。究其分子机制,miR-17-5p可能是通过调控其靶基因p21的表达影响胃癌耐药细胞的凋亡和增殖。本研究发现miR-17-5p的表达可明显降低胃癌细胞的耐药性,为临床上克服胃癌化疗时细胞耐药性难题提供理论支持和新的分子靶标。
石洁[7]2016年在《慢病毒介导的p21/Waf1 shRNA对膀胱癌特异性溶瘤腺病毒抗膀胱癌的体外实验研究》文中指出目的:在我国膀胱癌的发病率一直居于泌尿系统肿瘤的首位,传统的治疗手段因其肿瘤杀伤能力低和副作用大等缺点,故而治疗效果远未令人满意。选择复制性溶瘤腺病毒治疗肿瘤是极其有前途的基因治疗肿瘤的方法。为此,本课题组构建了膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A,在膀胱癌特异性启动子UPII和增强子PSCAE的控制下,该腺病毒能够选择性的在膀胱癌细胞中进行复制,从而发挥裂解肿瘤细胞的效应。前期的研究证实,我们所构建的腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A,特异性高,其只在膀胱癌细胞中进行复制,对于膀胱癌细胞也有一定的杀伤作用。但UPII启动子的活性相对较低,往往会削弱腺病毒的复制,从而影响其肿瘤杀伤效应。p21/Waf1做为一个经典的细胞周期抑制蛋白,近年来确由于在腺病毒介导的基因治疗中的拮抗作用而受到广泛关注,但p21/Waf1对膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的作用却不得而知。因此,本研究构建了p21/Waf1shRNA的慢病毒表达载体,并建立了稳定转染p21/Waf1 shRNA的人膀胱癌细胞株EJ和5637,检测p21/Waf1对膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的肿瘤杀伤效应、病毒复制、UPII启动子的活性及诱导细胞发生凋亡的影响,并初步探讨了可能的作用机制,为p21/Waf1能否作为膀胱癌基因治疗的一个新靶点提供理论和实验依据。方法:(1)构建人p21/Waf1的慢病毒干扰载体。设计针对p21/Waf1 shRNA的序列,插入含GFP的pMagic 7.1载体,通过PCR和DNA测序技术对重组克隆进行鉴定,将重组病毒质粒和辅助包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并对病毒滴度进行检测。将表达p21/Waf1 shRNA的慢病毒转染EJ和5637细胞,以嘌呤霉素进行筛选,直到获得稳定转入p21/Waf1 shRNA的EJ和5637细胞,检测稳转细胞中p21/Waf1的表达。(2)p21/Waf1对Ad/PSCAE/UPII/E1A肿瘤杀伤效应的影响。应用MTT比色法检测p21/Waf1敲减后腺病毒对人膀胱癌细胞株EJ和5637体外增殖效应的影响。(3)p21/Waf1对Ad/PSCAE/UPII/E1A滴度的影响。利用腺病毒滴度快速检测法检测p21/Waf1敲减后腺病毒滴度的变化;检测与病毒复制密切相关的指标E1A和hexon的表达。(4)p21/Waf1对UPII启动子活性的影响。首先检测p21/Waf1对EJ和5637细胞中AR表达水平的影响;接下来利用脂质体转染的方法将携带荧光素酶报告基因的重组质粒Rp-PSCAE-UPII-Luc分别转染EJ和5637细胞,以pCMV-β-gal作为内对照,荧光素酶报告系统检测p21/Waf1敲减后UPII启动子活性的变化。(5)p21/Waf1对Ad/PSCAE/UPII/E1A诱导凋亡的影响。利用流式细胞仪检测p21/Waf1敲减后Ad/PSCAE/UPII/E1A对EJ和5637凋亡的影响,分析凋亡信号转导通路相关因子的表达。结果:(1)成功构建了表达p21/Waf1 shRNA的重组慢病毒载体,获得滴度为4.12×108Tu/ml的慢病毒。(2)慢病毒的转染效率均>90%,获得稳定转染p21/Waf1 shRNA的EJ和5637细胞,p21/Waf1 shRNA能显着降低EJ和5637细胞中p21/Waf1的表达。(3)Ad/PSCAE/UPII/E1A对p21/Waf1敲减的EJ和5637细胞增殖的抑制效应明显增强。(4)p21/Waf1敲减的EJ和5637细胞中腺病毒的滴度显着增强。(5)在p21/Waf1敲减的EJ和5637细胞中,腺病毒复制的相关指标E1A和hexon的表达明显上调。(6)在p21/Waf1敲减的EJ和5637细胞中AR的表达明显上调;荧光素酶活性检测显示,p21/Waf1敲减后的细胞内Luc的活性显着增强。(7)Ad/PSCAE/UPII/E1A均能诱导EJ和5637细胞发生凋亡,p21/Waf1敲减后的细胞凋亡显着增加。(8)Ad/PSCAE/UPII/E1A可以通过上调Fas、Bax、caspase 3、caspase 8的表达,下调Bcl-2的表达促进EJ和5637细胞发生凋亡;但EJ和5637的野生型细胞和p21/Waf1敲减的细胞相比时,在p21/Waf1敲减组中,Fas、caspase 3、caspase 8的表达上调,而Bax和Bcl-2的表达与野生型细胞相比无明显变化。结论:(1)成功构建了表达p21/Waf1 shRNA的重组慢病毒,且能有效感染膀胱癌细胞EJ和5637。(2)慢病毒介导的p21/Waf1 shRNA能显着降低EJ和5637细胞中p21/Waf1的表达。(3)在p21/Waf1敲减的EJ和5637细胞中,Ad/PSCAE/UPII/E1A的肿瘤杀伤效应显着增强。(4)在EJ和5637细胞中,敲减p21/Waf1可以增强UPII启动子的活性。(5)在EJ和5637中,敲减p21/Waf1能够通过增强腺病毒复制及诱导细胞凋亡增加从而使Ad/PSCAE/UPII/E1A的肿瘤杀伤显着增强。
林正铧[8]2017年在《HoxC10在胃癌中的作用及其转录调控p21的分子机制研究》文中认为研究背景与目的同源盒(homeobox,Hox)基因家族分为A、B、C和D四簇,排列在一条同源DNA链上,其编码的同源蛋白是转录因子,通常在转录水平调控靶基表达。若Hox基因异常表达,会导致个体发育和组织器官形成过程中出现异常,并可能导致细胞恶性转化形成肿瘤。目前HoxC10与肿瘤的相关研究报道较少。有研究发现HoxC10在乳腺癌原发灶中表达上调,化疗失败后远处转移灶中的HoxC10表达水平升高更明显,HoxC10的高表达与接受化疗的乳腺癌(雌激素受体阴性)患者的预后不良相关。另一项研究发现HoxC10在宫颈癌组织中呈现高表达,并与宫颈癌细胞的侵袭转移密切相关。迄今为止,HoxC10影响肿瘤生物学行为的具体分子机制尚未阐明,也无HoxC10在胃癌中作用的相关研究报道。胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一。目前认为胃癌的发生发展是多因素多阶段的过程,涉及一系列癌基因激活和抑癌基因失活等分子变化。寻找胃癌发生发展的关键分子及其相互关系,对于进一步阐明胃癌的发病机制,提供更加精确的临床预测指标和治疗方案具有重要的意义。我们前期利用胃癌组织基因芯片筛选,首次发现HoxC10在胃癌组织中较癌旁组织高表达。为了阐明HoxC10在胃癌中的功能和分子作用机制,我们做了进一步研究。研究内容和方法1、HoxC10在胃癌组织中的表达及临床意义:通过对来自浙江大学附属邵逸夫医院和浙一医院的2个胃癌临床队列进行检测,分析HoxC10在胃癌和相应癌旁非肿瘤组织中的表达水平差异及其与胃癌患者临床病理参数间的相关性;运用The Cancer Genome Atlas(TCGA)癌症基因信息数据库、KM-plotter生存分析数据库进行佐证,明确HoxC10在胃癌发生发展中的临床意义。2、HoxC10对胃癌细胞生物学行为的影响:改变HoxC10的表达(过表达或敲减)并结合体外细胞功能试验和体内裸鼠胃癌移植瘤动物模型,研究HoxC10在胃癌恶性生物学行为(细胞增殖、周期调控、侵袭和迁移)中的作用。3、HoxC10潜在下游靶基因的筛选及验证:采用表达谱基因芯片技术,筛选HoxC10基因潜在的下游靶基因并采用实时荧光定量PCR进行验证;结合表达改变情况和转录因子结合位点信息学预测,筛选出p21进一步研究。4、HoxC10在p21转录调控中的作用及分子机制研究:通过改变HoxC10的表达,结合荧光定量PCR、免疫印迹等技术,在细胞、组织水平验证HoxC10和p21的表达相关性;免疫印迹技术检测在敲减HoxC10后,p21下游周期相关信号通路关键分子的表达改变;利用应用双荧光素酶报告基因检测、染色质免疫共沉淀等技术,探讨并揭示胃癌HoxC10对p21的转录抑制分子调控机制。研究结果1、HoxC10在胃癌组织中的表达及临床意义(1)新鲜冰冻胃癌及其配对癌旁非肿瘤组织样本(n=70),通过实时荧光定量PCR技术发现HoxC10在胃癌组织中的mRNA表达水平显着高于癌旁组织(高表达比例为 91.43%,64/70,P<0.01)。免疫印迹法(Westernblotting)检测 HoxC10 的蛋白表达,证实了较癌旁配对非肿瘤组织,胃癌组织中HoxC10的蛋白水平亦明显增高。分析HoxC10的表达水平与患者临床病理特征间的相关性,发现HoxC10的表达水平与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期显着相关(P<0.01)。(2)胃癌组织石蜡标本,定制组织芯片。通过免疫组化分析发现HoxC10在胃癌组织中普遍高表达(91.3%,137/150,P<0.01),HoxC10的蛋白表达与患者性别、肿瘤浸润深度及肿瘤分期显着相关(n=195,P<0.01)。Kaplan-Meier生存分析发现,胃癌组织中HoxC 10高表达的患者预后较差,风险比为2.223(95%CI 1.361-4.186)。多因素COX回归分析,发现HoxC10的高表达是胃癌预后差的一个独立预测因素。(3)比对分析TCGA数据库胃癌和癌旁组织中的差异基因,发现胃癌组织中HoxC10表达上调高达122倍(n=33,P<0.01)。在KM-plotter胃癌数据库(n=876)中,HoxC10高表达的患者预后差,风险比为1.8(95%C1 1.5-2.16)。2、HoxC10对胃癌细胞生物学行为的影响(1)CCK8、克隆形成等细胞增殖实验,发现过表达HoxC10显着促进胃癌细胞的增殖,而干扰HoxC10则抑制细胞的增殖。(2)采用流式细胞周期检测,发现过表达HoxC10后胃癌细胞周期G1-S期转换明显加快,干扰HoxC10后细胞阻滞在G1期。应用细胞周期同步化药物诺考达唑(Nocodazole)处理细胞,进一步证明敲减HoxC10使胃癌细胞周期阻滞在G1期。(3)采用双重染色流式细胞凋亡检测,发现过表达HoxC10抑制胃癌细胞的凋亡,而敲减HoxC10的表达则促进细胞凋亡。(4)Transwell试验表明过表达HoxC10能够显着促进胃癌细胞的迁移、侵袭能力,而HoxC10表达下调则抑制细胞的迁移、侵袭。(5)胃癌皮下移植瘤模型,发现过表达HoxC10后裸鼠瘤体的生长较对照组明显增快,而干扰HoxC10可减慢瘤体的生长速度。3、HoxC10潜在下游靶基因的筛选及验证(1)在胃癌细胞BGC中敲减HoxC10并做表达谱基因芯片分析,以差异倍数>1.3为界,并结合差异基因的功能分析,我们筛选出一系列差异表达的mRNA,如ELF5、PRDM2、AKT3、CDKN1A(p21)、SLC39A10、ZEB1、NRP2 等。(2)采用实时荧光定量PCR技术在胃癌细胞中进行验证。其中PRDM2、AKT3和p21等在敲减HoxC10的胃癌细胞株中显着上调,ZEB1、NRP2等显着下调(P<0.05)。(3)借助Genomatix和JASPAR两个在线转录因子结合位点预测数据库,分析发现HoxC10与p21启动子区存在多个可能的结合位点。4、HoxC10在p21转录调控中的作用及分子机制研究(1)在多株胃癌细胞中改变(过表达和敲减)HoxC10的表达,发现过表达HoxC10,p21的表达水平相对下调,而敲减HoxC10后,p21的表达相对上调;在裸鼠胃癌移植瘤组织中,免疫组化分析HoxC10和p21的表达情况,发现二者呈负相关;在稳定敲减HoxC10的胃癌细胞中,p21及其下游周期相关信号通路的关键分子CDK2、CDK4、c-Myc、CyclinD1、pRb 等的表达发生改变。(2)采用双荧光素酶报告基因技术,分析HoxC10表达改变对p21转录活性的影响。结果发现过表达HoxC10明显抑制p21的转录活性,而干扰HoxC10的表达,p21的转录活性增强。(3)设计针对p21基因启动子区的引物,采用染色质免疫共沉淀技术,进一步鉴定发现HoxC10与P21启动子区存在结合位点。研究结论1、在胃癌组织中HoxC10普遍高表达,且与肿瘤浸润深度、肿瘤分期及临床预后相关,HoxC10高表达是胃癌预后差的一个独立预测因素。2、HoxC10可调控G1细胞周期、抑制胃癌细胞凋亡,促进胃癌细胞增殖和裸鼠移植瘤形成,促进胃癌细胞迁移和侵袭能力,从而发挥促癌基因的作用。3、筛选发现系列HoxC1O可能调控的下游重要肿瘤相关基因,其中HoxC10能与p21的启动子区结合并抑制其转录活性,影响其下游周期相关信号分子的表达,从而影响胃癌细胞的增殖和周期调控。
刘爱玲[9]2016年在《虫草菌液抑制CSE诱导的人支气管上皮细胞衰老的机制研究》文中研究说明研究背景慢性阻塞性肺疾病是一种进展性致残性疾病,在有害因素的刺激下,气道和肺产生异常炎症反应。COPD的主要特点是持续气流受限和不完全可逆的的气道炎症。对COPD的细胞学、分子学以及遗传学病因仍缺乏充分的了解,目前的治疗都存在其不足,不能有效延缓疾病的进展或降低死亡率。目前的研究证实,在老龄化人群中,因衰老过程加速可同时患有有多种疾病,被称为共生疾病(multimorbidity)。包括COPD、冠心病、代谢性疾病以及神经系统退变等慢性退行性疾病,他们有着共同的发病机制,与细胞的衰老加速密切相关。细胞衰老是由各种压力导致不可逆的生长停滞状态的过程。老化过程中衰老细胞积聚,导致一系列衰老相关性疾病。研究证实,细胞衰老是共生疾病的共同原因。引起细胞衰老加速的机制涉及到端粒的缩短,PI3K/AKT/mTor通路的活化,自噬受损,线粒体功能障碍,干细胞耗竭,免疫衰老等。很多这些途径由慢性氧化应激驱动。氧化应激是引起细胞衰老的重要原因。在有氧代谢过程中产生的活性氧簇(reactive oxygenspecies, ROS)对大多数细胞都具有毒性作用。在正常情况下,机体内ROS的产生和ROS清除系统处于动态平衡状态。如果ROS产生增多或/和机体清除ROS能力的下降,机体就会出现氧化应激(oxidative stress)。当机体处于氧化应激状态时,体内组织细胞ROS量相对升高,超过机体的清除能力,可导致机体组织脂质过氧化水平升高,引起DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常,对机体造成损害。在COPD患者中,氧化应激主要来源于烟雾中的氧化剂和体内活化的炎症细胞,吸烟与ROS及氧化应激密切相关。ROS活化PI3K,通过AKT激酶活化mTor,激活PI3K/AKT/mTor通路。PI3K/AKT/mTor通路作为细胞内非常重要的信号转导途径,参与调控细胞的生长、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等过程。在细胞的衰老过程中,该通路也起着至关重要的作用。PI3K/AKT/mTor通路活化后,通过ULK1的激活和抑制SIRT1的活性,进而加速细胞衰老。综上所述,抑制细胞衰老的加速,对COPD以及其他共生疾病有一定的治疗作用。近年来,从我国传统中草药中提取药物治疗慢性疾病已经成为当前国内中医药现代化的重要组成部分。冬虫夏草(Cordyceps sinensis),又名虫草,是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合物,是世界上目前最稀有珍贵的药用真菌之一,有极高的医疗保健作用和经济价值,具有抗衰老、抗病原微生物、抗恶性肿瘤、扩张血管、改善动脉硬化症、调节内分泌、呼吸、免疫、神经系统及肾脏和肝脏等多种功效。现在对于虫草的研究主要集中在化学成分和药理作用。虫草中含有核苷、多糖、甾醇、蛋白质、氨基酸、多肽等,在抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗凋亡和免疫调节等方面发挥重要作用。但冬虫夏草的具体作用机制尚不清楚。有研究发现冬虫夏草可以降低人肺上皮细胞的氧化应激损伤,抗氧化是冬虫夏草的重要作用机制。呼吸系统中的氧化应激主要来源于烟雾,与细胞衰老密切相关。本实验拟研究虫草菌液对于CSE(香烟烟雾提取物,Cigarette Smoke Extract)诱发的细胞衰老的抑制作用及其机制。从细胞分子机制延缓COPD细胞的衰老,对以后COPD病人的疾病预防及治疗提供一定的价值。研究目的1.探讨CSE对人支气管上皮细胞存活率的影响。2.研究CSE诱导人支气管上皮细胞衰老。3.研究冬虫夏草菌液对于CSE诱导的细胞的衰老的抑制作用。4.研究ROS和PI3K/AKT/mTor通路在CSE诱导细胞衰老中的作用。5.探讨CSE和虫草菌液对于细胞衰老的作用机制。研究方法1.人支气管上皮细胞(16HBE)进行体外培养,用不同浓度CSE对细胞进行干预不同时间,以MTT法测定细胞存活率,测定CSE对上皮细胞存活率的影响,确定最合适干预的CSE浓度和时间。2.16HBE细胞经过上述实验确定的浓度和时间的CSE干预后,通过SA-β-gal染色法和P16、P21检测细胞衰老。通过对培养细胞进行衰老相关的β-半乳糖苷酶染色,计算视野中染色细胞的百分数,与对照组进行对比,P<0.05具有显着差异。P16和P21的检测通过免疫荧光化学技术定性,实时定量聚合酶链反应测定mRNA相对表达,以及免疫蛋白印迹法测定蛋白表达定量。同时,以梯度CSE处理细胞,免疫蛋白印迹法测定P16和P21的蛋白表达。3.在实验组进行CSE干预的两小时前加入CS(虫草菌液,Cordyceps sinensis),细胞培养后进行衰老相关指标的检测。测定β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率,免疫荧光、实时定量聚合酶链反应、免疫蛋白印迹测定P16、P21表达。4.为测定ROS 和PI3K/AKT/mTor通路的活化,16HBE细胞经过CSE、CS处理后,通过ROS试剂盒检测ROS荧光,定性分析不同干预条件下ROS变化；通过免疫蛋白印迹测定PI3K、AKT、mTor蛋白表达以及它们的磷酸化蛋白表达；以梯度CSE处理细胞,免疫蛋白印迹法测定AKT、mTor的磷酸化蛋白表达。5.为了研究CSE和虫草菌液对于细胞衰老的作用机制,在CSE组、CS+CSE组中,我们分别加入ROS抑制剂NAC、PI3K抑制剂Ly294002,测定ROS荧光强度、PI3K/AKT/mTor以及它们的磷酸化蛋白表达,以观察加入抑制剂后对细胞通路的影响,测定β-半乳糖苷酶染色和P16、P21的蛋白表达观察对细胞衰老的影响。研究结果1.经过CSE处理后,16HBE细胞存活率被抑制,呈时间和浓度依赖性。根据MTT法绘制细胞生存率曲线,2%CSE作用24小时用于之后的干预研究。2.经过CSE处理后,16HBE细胞的衰老增强。对比对照组,SA-β-gal染色阳性细胞比率增高(p<0.05),P16和P21的免疫化学荧光增强,P16和P21的mRNA相对表达增加(分别为：p<0.05,p<0.05),P16和P21蛋白表达量增加(分别为：p<0.05,p<0.05)。P16和P21的蛋白表达量随CSE的作用浓度和作用时间而增加(分别为：p<0.05,p<0.05)。3.与CSE处理细胞组进行对比,在CSE干预前加入CS组细胞的衰老减弱。与CSE组对比,CSE+CS组的SA-β-gal染色阳性细胞比率降低(p<0.05),P16和P21的免疫化学荧光减弱,mRNA相对表达减少(分别为：p<0.05,p<0.05),蛋白表达量减少(分别为：p<0.05,p<0.05)。4.与对照组相比较,CSE组细胞ROS荧光增强,PI3K、AKT、mTor蛋白表达无差异,AKT、mTor磷酸化蛋白表达增加(分别为：p<0.05,p<0.05)。对比CSE组,预先加入CS组细胞的ROS荧光减弱,PI3K、AKT、mTor蛋白表达无差异,AKT、mTor磷酸化蛋白表达减少(分别为：p<0.05, p<0.05)。AKT、mTor磷酸化蛋白表达呈CSE浓度和时间依赖性(分别为：p<0.05,p<0.05)。5.加入ROS抑制剂NAC后,CSE组、CS+CSE组细胞的ROS荧光均呈明显减弱,AKT、mTor磷酸化蛋白表达均减少(分别为：p<0.05,p<0.05,p<0.05,p<0.05),由此,ROS和PI3K/AKT/mTor信号通路活化降低；加入NAC后,CSE组、CS+CSE组细胞衰老减弱,表现为SA-β-gal染色阳性细胞的比率均有降低(分别为：p<0.05,p<0.05)、P16和P21蛋白表达均呈下降(分别为：p<0.05,p<0.05,p<0.05,p<0.05)。加入PI3K抑制剂Ly294002后,CSE组、CS+CSE组细胞的AKT、mTor磷酸化蛋白表达明显减少(分别为：p<0.05,p<0.05,p<0.05,p<0.05),由此,信号通路活化降低,但ROS荧光变化不明显,PI3K抑制剂对ROS影响不大；加入Ly294002后,CSE组、CS+CSE组细胞衰老减弱,表现为SA-β-gal染色阳性细胞的比率均有降低(分别为：p<0.05,p<0.05)、P16和P21蛋白表达均呈下降(分别为：p<0.05,p<0.05,p<0.05,p<0.05)。研究结论1.CSE抑制人支气管上皮细胞存活率,呈时间和浓度依赖性。2.CSE可以诱导人支气管上皮细胞衰老。3.CS在体外细胞培养中能抑制CSE诱导的细胞衰老。4. ROS和 PI3K/AKT/mTor信号通路在CSE诱导的细胞衰老中起着重要的作用。5.阻断ROS/mTor信号通路可以减轻CSE诱导的细胞衰老。
马向辉[10]2016年在《Musashi2在皮肤及毛囊发育中的功能与分子机制研究》文中进行了进一步梳理毛囊是皮肤中最大的附属器官,其进化的形成为高等动物保持体温恒定适应复杂陆生环境提供了重要保障,而毛囊干细胞(hair follicle stem cells, HFSCs)又为其功能的完整实现提供了必不可少的动力源。毛囊干细胞定位于毛囊上基部的Bulge区,其周期性激活使成年毛囊不断经历由生长期到退化期再到静止期的往复循环过程；其中毛囊干细胞在生长期早期的唤醒和激活是毛发周期转换递进的必要过程,需要多种不同信号通路的交流互作,但这种激活信号问传递和调控过程的具体分子机制目前仍未完全阐明。RNA结合蛋白是能特异识别并结合在RNA序列上并对目的RNA进行拼接、转运及翻译修饰的一类调节蛋白。Musashi2 (Msi2)作为进化上高度保守的RNA结合蛋白,在包括神经、造血、小肠、乳腺等多种组织干细胞的命运决定和状态维持以及癌症的发生中都发挥了重要的作用。之前的研究已显示Msi2在包括整个毛发周期Bulge区和次级毛胚芽(secondary hair germ, SHG)的干细胞区域均有广泛的表达。然而,Msi2在毛囊干细胞和毛发周期中的功能并不清楚。因此,本研究对Msi2在毛囊不同时期的表达模式及对HFSCs和毛发周期转换递进的作用和分子机制进行了详细研究和探讨。本研究首先采用qRT-PCR和免疫组化技术发现,Msi2在不同时期毛囊干细胞存在部位及部分分化细胞中均有广泛表达。为进一步研究Msi2在皮肤及毛囊发育中的功能和作用机制,本研究利用Tet-On和Cre-loxP系统分别构建了可诱导的皮肤表皮特异性过表达鼠(TRE-MSI2::K14rtTA)和Msi2皮肤表皮特异性敲除鼠(Msi2flox/flox::K14Cre)。在Dox处理3天的情况下,MSI2发生了显着的过表达,并阻碍毛囊从静止期向生长期转换；较长时期MSI2过表达处理结果显示MSI2过表达鼠毛囊能够进入生长期,但相比于对照组仍有明显的滞后。拔毛引发毛囊发育同步化的再生实验也进一步显示Msi2过表达可以阻碍再生毛囊向生长期中期转换；而相反,Msi2敲除鼠在拔毛后进入生长中期的转换递进过程则显着快于对照组。对拔毛后毛囊进行BrdU追踪实验发现,过表达鼠的HFSCs在毛囊周期转换过程中的激活显着滞后于对照组,而敲除鼠中毛囊干细胞的激活则更快。进而,采用流式细胞分选和毛囊干细胞Marker标记实验发现,Msi2并不影响HFSCs的数量,而调控了其由静息态向激活态转换的过程。同样,Msi2对伤口愈合和伤口处新生毛发的生长情况也有显着的滞后作用。为进一步研究其分子机制,本研究对短期Dox诱导的背部皮肤进行了RNA-Seq分析,heatmap的层次聚类也显示该数据具有较好的重复性：差异基因KEGG通路注释发现,Sonic hedgehog通路得到了最显着的富集；对该通路相关基因进行验证也显示,其在MSI2过表达鼠中受到显着的抑制,而在敲除鼠中得到了激活,同样在毛囊再生的拔毛鼠中也得到了类似的结果。根据已报道的Msi2蛋白的结合基序,本研究发现在Hh通路的上游输入信号基因Shh的3'-UTR区存在Msi2的潜在结合位点,采用双荧光素酶报告基因检测实验显示Msi2能够结合到该位点,证实Shh是Msi2的潜在靶基因：进一步的CLIP-qPCR和原位杂交实验发现两者具有共同的表达部位——均位于生长期毛囊的毛基质区域,并导致Shh mRNA水平的降低,同样RNA稳定性实验也显示体外过表达MSI2引发了Shh mRNA的降解过程,进而抑制了Hh通路的激活。与此一致,本研究同样发现Msi2对Hh通路下游相关基因具有调控作用；进而对Msi2过表达鼠背部拔毛区域涂抹Hh通路激活剂——SAG发现,Msi2过表达造成的毛发周期转换延迟现象得到了显着恢复,进一步证实Msi2通过Shh/Hh通路调控毛囊干细胞和毛发周期转换递进的功能和分子机制。综上可知,本研究首次发现并在体内证实Msi2通过转录后调控引发Shh mRNA的降解,抑制了Shh/Hh通路进而影响了HFSCs激活状态的转变,不仅对Msi蛋白作用方式形成了重要补充,也为相关皮肤疾病的治疗提供了潜在靶标和参考依据。
参考文献：
[1]. LincRNA-p21通过抑制Notch信号诱导的EMT抑制肝癌细胞侵袭转移[D]. 贾萌. 郑州大学. 2016
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[7]. 慢病毒介导的p21/Waf1 shRNA对膀胱癌特异性溶瘤腺病毒抗膀胱癌的体外实验研究[D]. 石洁. 兰州大学. 2016
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[9]. 虫草菌液抑制CSE诱导的人支气管上皮细胞衰老的机制研究[D]. 刘爱玲. 山东大学. 2016
[10]. Musashi2在皮肤及毛囊发育中的功能与分子机制研究[D]. 马向辉. 中国农业大学. 2016