曾志荣, 胡品津, 林汉良, 陈湖, 陈为[1]2000年在《幽门螺杆菌感染与胃癌形成关系的动物实验研究》文中认为目的:利用 Hp 感染的 Wistar 大鼠模型进行实验性胃癌研究,观察 Hp 感染是否增加腺胃粘膜对致癌剂的敏感性,促进肿瘤形成。方法:2级,雄性 Wistar 大鼠90只,随机分为实验组(45只)和对照组(45只)。实验组动物感染 Hp 后12周,将两组动物又随机分为3 小组,即空白组、MNNG 组和 MNNG+NaCl 组,各15只。空白组动物自由饮用蒸滴水,MNNG 组动物饮用含 MNNG100μg/ml 的蒸溜水), MNNG+NaCl 组动物除饮用含 MNNG100μg/ml 的蒸溜水外,另外灌喂 10%NaCl 溶液1.5ml,2次/周;以上处理连续10个月,处理因素结束后2个月处死动物。比较各组动物腺胃病理组织学差异。结果:所有实验组动物至实验结束 Hp 检查均为阳性。在实验组中的 MNNG +NaCl 组有1只动物出现早期腺胃痛。实验组中的 MNNG 组和 MN- NG+NaCl 组动物腺胃粘膜腺瘤样增生的发生率分别为40%、 57.14%,显着高于棚应的对照组动物的6.67%、15.38%(P＜0.05)。在实验组中的空白组、MNNG 组和 MNNG+NaCl 组动物胃窦萎缩性胃炎发生率分别为66.67%、80%和85.71%,高于相应的对照组动物的 0.20%和23.08%(P＜0.01)。结论:本研究结果提示 Hp 感染可增加腺胃粘膜对致癌剂的敏感性,促进胃癌前病变和胃癌的形成。
刘文能[2]2016年在《幽门螺杆菌对miR-221和miR-222表达的影响及其对胃癌细胞增殖和侵袭力调控的研究》文中研究指明研究背景和目的：胃癌是威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一,胃癌占目前世界恶性肿瘤第四位,肿瘤相关性死亡排名第二位。在中国,胃癌的发病率仍居各大恶性肿瘤发病率的前列,且呈上升趋势。在陈万清教授2015年发表的文章中对中国癌症发病率和死亡率统计,胃癌占男性患者恶性肿瘤发病率第二位,女性患者恶性肿瘤发病率第叁位。男性患者和女性患者胃癌死亡率均位于恶性肿瘤导致死亡第二位。胃癌的发病过程是一个聚集了遗传、外界环境及生活习惯等诸多因素于一体的复杂的病理过程,且其确切的病理机制仍然不是十分清楚。其中,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)感染是比较重要的危险因素之一,其在世界范围内感染广泛,与胃炎、消化性溃疡乃至胃癌发生密切相关,1994年被WHO正式列为Ⅰ类致癌因子。目前,多数研究显示在由慢性胃炎、胃粘膜溃疡、萎缩、肠化生、异型增生直至胃癌的演变过程中,H. pylori可能起先导作用,成为胃癌发生的一个始动因素。因此,深入的探讨幽门螺杆菌在胃癌的发生和发展过程中的作用机制,并将其应用于胃癌疾病的早期预防、早期诊断和治疗对胃癌的防治具有重要的意义。H. pylori感染是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因子之一,且与胃癌的发病密切相关。H. pylori感染引起的免疫反应十分复杂,虽然机体对于H. pylori感染能够引发强烈的细胞和体液免疫,但是并不能有效地清除细菌,而是导致感染状态常常持续存在,甚至伴随一生。H. pylori感染后引起炎症反应虽然是H. pylori致病的重要因素之一,但很多H. pylori感染者却并没有明显的临床症状。因此,H. pylori在与人类长期共存的过程中,相互之间构成了一个复杂的网络,得以精细调控H. pylori感染的免疫反应。目前已发现的免疫调控因素包括：调节性T细胞、抑制型细胞因子、交叉抗原的免疫逃避等,但是关于H. pylori感染的确切免疫调控机制仍不十分清楚。胃黏膜上皮细胞作为细菌感染的第一道屏障,通过表达Toll样受体(TLR)启动胃黏膜固有免疫。研究发现在人类胃黏膜细胞中,Let-7b靶向结合TLR4mRNA直接调节TLR4的表达,继之影响核转录因子-KB活性及下游基因的表达。导致细胞因子及趋化因子的产生,从而导致单核细胞、巨噬细胞和白细胞的聚集,在胃黏膜固有免疫和炎症过程中起着重要作用。有研究表明miR-30b可减弱细胞的自我吞噬作用,导致H. pylori逃过细胞的自我吞噬,从而导致H.pylori的慢性持续感染。许多研究均提示miRNA在H. pylori诱导的炎性反应发生和发展中起关键性作用。H. pylori感染是胃癌发生重要因素,但具体机制尚不清楚,随着miRNA的发现及其作用的逐渐阐明,越来越多的证据表明miRNA与胃癌的发生和发展密切相关。 H. pylori感染引起miRNA的表达水平变化,可以通过影响胃黏膜炎性反应、癌基因或抑癌基因的表达、基因甲基化,进而参与到胃癌的发生和发展过程中。H. pylori却感染后导致miRNA异常表达可能与肿瘤的转移有关。MiR (miRNA)是长度在19-25个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA。这些小分子通过RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)靶向到达nRNA,进而行使阻遏翻译或引导酶切的功能。最近有研究显不,niRNA有多种生物学功能,他们的初级转录产物经过一系列核酸酶的剪切加工后形成成熟miRNA分子,进而参与到调节细胞和早期胚胎的发育、细胞分化、细胞增殖与凋亡、细胞代谢等重要的生理过程中。目前发现miRNA广泛地存在于植物、线虫和哺乳动物等生物中。迄今为止,共发现约8000多个miRNA。有研究报道,miRNA具有肿瘤抑制因子及癌基因的作用。在癌症发生和发展中发挥作用的miRNA被称为oncogenic miRNA,即oncomiR。 OncomiR的失调与基因突变或表观遗传变异有关,这些变异包括缺失突变、扩增突变、点突变及DNA异常甲基化等. miRNA的表达情况与人类多种恶性肿瘤的发生、发展、诊断、治疗和预后密切相关。对胃癌miRNAs表达的研究显示了它们在这一领域的重要性和潜在的用途。一些miRNAs,例如niR-9、miR-21、miR-27a、 miR-143、miR-145、miR-433和miR-451等已经被证实在胃癌中发挥重要的调控作用。近年来,对miRNAs与免疫系统关系的研究是热点,miRNAs被证实参与了淋巴细胞的发育和分化、抗体的产生及固有免疫应答调控过程。此外,miRNAs与肿瘤发生、发展的关系也日益成为现代科研的热点。研究发现miRNAs广泛参与细胞的发育、分化、细胞增殖凋亡、代谢等各种生命活动,以及各种生物学进程的调控。大约50%的miRNAs定位于基因组的肿瘤基因相关区域或脆性位点,作为新的一类癌基因或抑癌基因。研究发现,miRNAs的表达失衡与多种恶性肿瘤的发生密切相关,例如,肺癌、肝癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、淋巴瘤等。目前,也发现多种miRNA可能与胃癌的发生发展相关,已证实miR-21、miR-106b-25、miR-221、miR-218等参与了胃癌的发生与发展,其表达的高低与预后也息息相关。目前,Zhang等发现miR-21在H. pylori感染的胃癌细胞株中表达增高,且miR-21在胃癌发生过程中可能发挥癌基因的功能,从而提示由H. pylori介导的胃癌的发生也存在miRNAs的参与和调控。本部分研究基于既往研究及文献复习,我们分析了H. pylori感染对胃上皮细胞miRNAs表达谱的影响；筛选出了一系列差异表达的miRNAs,并以miRNA221和miRNA222为深入研究对象,初步探讨H. pylori感染诱导miRNA221和miRNA222高表达的分子机制,以及miRNA221和miRNA222调控肿瘤的作用,为阐明H. pylori的免疫调控机制提供新线索和方向。是否有其他更多的miRNA参与到幽门螺杆菌感染后的胃癌病理发生发展过程,也是我们值得进一步深入研究的方向。胃癌作为常见恶性肿瘤之一,miRNA221/222是否与胃癌相关,两者是否参与胃癌癌变过程及其机制的相关研究尚未有开展。本研究目的在于探讨miRNA221/222在胃癌组织及胃癌细胞中的表达改变及其对胃癌发生发展的影响,以期为胃癌的发病机制研究提供新的线索,为在胃癌的诊断、治疗及其早期防治领域的实践和应用提供更多的实验依据。反转录富含半胱氨酸蛋白(reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs, RECK)基因是于1998年发现的一种新抑癌基因。RECK基因是基质金属蛋白酶(matrix metal loproteinase, MMPs)抑制剂。研究表明,其可在转录后水平抑制多种MMP的表达,抑制肿瘤血管的生成,从而抑制肿瘤的侵袭于转移,是许多癌基因共同的负向调控基因。miR-21, miR-25, miR-222和miR-374也可以抑制RECK蛋白的表达促进胃癌的发展。RECK蛋白作为胃癌的重要肿瘤抑制蛋白,其上调因子的研究显得很有必要性。本研究旨在探索幽门螺杆菌感染后导致miR-221和miR-222的失调情况以及其两者是如何作用于胃癌的病理发展进程。方法：1、miR-221和miR-222在H. pylori感染慢性胃炎和H. pylori阴性对照组中的表达分析。在给予充分告知及知情同意后,20例胃黏膜组织学标本的取材均通过胃镜取材获得,采集自四川省成都市第一人民医院内镜室。其中10例幽门螺杆菌阳性的慢性胃炎患者(平均年龄42岁,其中男性6人,女性4人),10例幽门螺杆菌阴性的对照组(平均年龄38岁,其中男性和女性各5人)。并经快速尿素酶检测、H pylori培养及病理组织学表现判定H pylori感染情况。胃癌组织和胃癌邻近正常组织的取材是通过对8例行远端胃癌根治术后的患者取材获得的。采集自四川省成都市第一人民医院手术室；其中UIAC国际肿瘤TNM分期为6例Ⅰb期和2例Ⅱ期。通过实时荧光定量PCR (realtime PCR)技术,分别检测miRNA221和miRNA222在H. pylori感染慢性胃炎和H. pylori阴性正常对照组胃粘膜组织中的表达水平差异。2、miR-221和miR-222在H. pylori阳性的胃癌组织和邻近正常组织中的表达差异分析。组织学标本通过胃癌手术后患者的标本取材,通过realtime PCR技术,分别检测miRNA221和miRNA222在H. pylori感染胃癌组织和邻近正常胃粘膜组织中的表达水平。应用特异性stem. 100p引物完成逆转录,并同时采用灵敏的Taqman real time PCR技术检测以上标本中miRNA221和miRNA222的表达水平。计算不同组织间niRNA221和miRNA222表达水平差异。数据结果采用SPSS17.0进行统计分析,采用二样本t检验判定2组间的显着性差异,以p<0.05作为显着性判定标准。3、体内外分析miR-221和miR-222对胃癌细胞增殖、凋亡和侵袭力的检测。应用gain- and loss-of function实验方法来分别验证miRNA221和miRNA222表达水平变化对细胞功能的影响。胃癌细胞株AGS和SGC-7901首先将miRNA221和miRNA222前体序列转染至细胞内,使细胞miRNA221和miRNA222表达水平升高；相反,通过转染人工合成的特异性miRNA221和miRNA222抑制剂来降低细胞内miRNA221和miRNA222表达水平。通过CCK-8检测miRNA221和miRNA222对胃癌细胞株增殖的影响；使用流式细胞仪检测转染不同miRNA片段后细胞增殖情况与细胞周期分布的变化,采用软琼脂集落形成试验检测转染miRNA221和miRNA222后肿瘤细胞非锚着依赖性生长能力的改变,以检测两者对细胞的侵袭力的影响。数据结果采用SPSS17.0进行统计分析,采用二样本t检验判定2组间的显着性差异,以p<0.05作为显着性判定标准。4、预测、鉴定miR-221和miR-222的靶基因,检测靶基因与miR-221和miR-222在不同胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达水平及相关性。首先用miRNAs靶基因预测数据库TargetScan 6.2软件预测miR-221和miR-222的靶基因,RECK可能是miRNA-221和miRNA-222的一个靶位。Lueiferase reporter assay结果进一步证明RECK是miRNA-221和miRNA-222重要的靶基因。并且在幽门螺杆菌感染后的AGS细胞内表达增加,RECK蛋白表达降低。进一步构建靶基因报告载体,利用双荧光素酶报告系统、GFP荧光抑制分析、Western blot技术鉴定之；利用real time PCR和Western blot,检测靶基因与miRNA-221和miRNA-222在不同胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达水平及相关性。通过预实验我们选择两个对幽门螺杆菌干预因素比较明显的细胞株SGC-7901细胞和AGS细胞来进行后续的miRNA转染实验。SGC-7901细胞和AGS细胞分别转染50nM的miR-221或miR-222片段,100 nM的antagomiR-221或antagomiR-222片段,共转染40 nM的miR-221和40nM的miR-222片段,共同转染75 nM的antagomiR-221和75 nM的antagomiR-222,或共同转染阴性对照片段(RiboBio, China),再通过阳离子脂质体RNAiMAX的作用(Invitrogen, USA)分别检测相应细胞组中的相应miRNA。通过实时荧光定量PCR法分别检测幽门螺杆菌阳性的慢性胃炎组和幽门螺杆菌阴性的正常对照组间miRNA-221和miRNA-222的表达差异以及检测幽门螺杆菌阳性胃癌组织及周围邻近非肿瘤正常组织种miRNA-221和miRNA-222的表达差异。通过培养不同的非胃癌细胞株和胃癌肿瘤细胞株,经过幽门螺杆菌的转染,分别检测转染前后miRNA-221和miRNA-222的表达差异,来进一步验证。双荧光素酶法来验证miRNA-221 /miRNA-222和RECK 之间的假定结合位点。通过敲除和获得的方式来评估验证miR-221/222-RECK通路在胃癌的作用。结果：1、miR-221和miR-222在H. pylori感染慢性胃炎和H. pylori H. pylori阴性对照组中的表达分析。本实验首先通过检测幽门螺杆菌阴性的正常对照组和幽门螺杆菌阳性慢性胃炎组中miR-221和miR-222的表达差异。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测结果显示幽门螺杆菌阳性的慢性胃炎组中miR-221和miR-222的表达比幽门螺杆菌阴性的正常对照组中显着增高。2、miR-221和miR-222在H. pylori阳性的胃癌组织和邻近组正常织中的表达分析。检测miR-221和miR-222在幽门螺杆菌阳性的胃癌组织和幽门螺杆菌阳性胃癌患者胃癌邻近正常组织种的表达差异,结果提示miR-221和miR-222在幽门螺杆菌阳性8名胃癌患者的胃癌组织中的表达比邻近组织中的表达明显增加。定量检测转染幽门螺杆菌前和转染后miR-221和miR-222在GES-1, BGC-823, SGC-7901和AGS中的表达差异。结果显示幽门螺杆菌转染后上述细胞系中miR-221和miR-222的表达式显着增加的。3、分析miR-221和miR-222对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭力的影响。通过分别将细胞转染过表达的miR-221和miR-222微小片段,使用相应的miR-221和miR-222拮抗剂进行敲除,通过CCK-8细胞计数发现敲除miR-221和miR-222后AGS和SGC-7901细胞增殖被显着抑制。相反,miR-221和miR-222过表达的AGS和SGC-7901细胞增殖被显着提高。在细胞的培育过程中,AGS和SGC-7901细胞分别敲除内源性miR-221和miR-222后,其细胞凋亡显着上升,说明miR-221和miR-222能显着抑制AGS和SGC-7901细胞的凋亡。此外,在孵化24小时候,去除上层细胞,对基层细胞进行固定,荧光染色20分钟后,在放大100倍光学显微镜下观察相应AGS细胞和SGC-7901细胞系的侵袭力的变化发现,miR-221和miR-222的过表达可以显着增强AGS和SGC-7901胃癌细胞的侵袭力。以上结果提示miR-221和miR-222都能调节胃癌细胞的增殖,凋亡和侵袭力。4、预测、鉴定miR-221和miR-222的靶基因,检测靶基因与miR-221和miR-222在不同胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达水平及相关性。在HEK-293T细胞株和SGC-7901细胞株的实验中,miR-221和miR-222都能显着抑制转染pGL3-RECK-wt质粒后的荧光活性,但转染的pGL3-RECK-mut质粒后的荧光活性无影响。AGS和SGC-7901细胞系中,转染miR-221和miR-222片段后都可以显着减少RECK蛋白的表达。同时,共同转染miR-221和miR-222后在RECK蛋白的表达中起到迭加作用。相反,抑制内源性的miR-221和miR-222后,AGS和SGC-7901细胞系中RECK蛋白的表达会显着增加。而且,同时敲除内源性的miR-221和miR-222后,RECK蛋白的表达会比单独敲除miR-221或miR-222增加更明显。以上实验结果揭示miR-221和miR-222都可以直接作用于RECK基因的靶点,并调节RECK蛋白的表达。因此,我们通过实验设计进一步检测胃癌细胞的增殖浸润和凋亡过程中miR-221和miR-222与RECK基因之间的作用关系。为了过表达RECK, AGS、SGC-7901细胞首先转染了PCDNA3.1-RECK质粒。miR-221和miR-222都不能抑制这个质粒蛋白的表达。RECK基因的过表达显着逆转了miR-221或miR-222诱导的较快的细胞生长。RECK过表达也显着抑制了miR-221或miR-222诱导的高的细胞侵袭力。以上结果均提示幽门螺杆菌感染能导致miR-221和miR-222的表达增加。幽门螺杆菌感染导致miR-221和miR-222在胃癌细胞及组织中的表达显着增加。miR-221和miR-222均可以结合于相同的RECK基因3'UTR序列端,从而调节其表达。证实了假设的miR-221和miR-222通过作用于RECK基因可以促进胃癌细胞的增值和侵袭。结论：通过本实验研究发现,幽门螺杆菌感染可以导致胃黏膜组织和胃上皮细胞中miR-221和miR-222的表达显着增加,幽门螺杆菌感染阳性的胃癌组织中miR-221和miR-222的表达比幽门螺感染阳性的胃癌邻近非肿瘤正常组织中显着增加。miR-221和miR-222都可以通过有效结合于RECK基因的3'-UTR发生影响,通过在转录后水平调节RECK蛋白的表达来发挥作用。通过选取AGS和SGC-7901两个胃癌细胞株来进行细胞学实验发现,miR-221和miR-222都能够促进胃癌细胞的增殖,增加胃癌细胞的侵袭力,负向调节胃癌细胞的凋亡。通过转染获得miR-221或/和miR-222片段和敲除相应miRNA的方式,本实验研究发现其调节途径是通过miR-221/222-RECK途径来完成的。幽门螺杆菌感染目前被WHO定义为胃癌的Ⅰ类致癌因素。而幽门螺杆菌感染致癌的具体机制目前仍没有完全研究清楚。通过本实验研究的结果提示miR-221/222-RECK途径可能是幽门螺杆菌感染导致胃癌的重要调节通路。
赵占伟[3]2014年在《GDDR在幽门螺杆菌感染相关的胃癌形成中的作用》文中进行了进一步梳理【实验目的】胃癌相关下调基因（gastric dramatic down-related gene, GDDR），是本课题组杜建军教授于2002年首次通过已成功建立的抑制性消减杂交技术，从cDNA文库中克隆得到的胃癌相关新基因，其在正常胃黏膜中高表达，在胃癌中表达显着下调或缺失。虽然GDDR的分子结构、染色体位置和相应蛋白的表达已较为清晰，但该基因的具体功能及其作用机制尚未十分明确。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H.pylori）感染目前已被公认为是胃癌发生发展的重要致病因素之一。有研究显示，幽门螺杆菌可调控GDDR的表达，故本课题旨在探索幽门螺杆菌感染调控GDDR表达和功能在胃癌发生发展中的作用和意义，为胃癌的早期诊断和早期治疗提供新策略。【实验设计】1.通过Western blot和免疫组织化学方法检测人体组织中胃癌及癌前病变阶段的GDDR蛋白表达及细胞定位，分析GDDR蛋白在胃癌发生发展中的表达趋势和在胃癌形成中的作用；2.通过免疫组织化学方法、细胞与细菌共培养方法、免疫荧光共聚焦方法、qRT-PCR和Western blot等检测在幽门螺杆菌感染和未感染两种状态下，GDDR蛋白相应的表达变化以及与幽门螺杆菌感染的相关性；3.通过免疫荧光共聚焦实验和Western blot进一步探究幽门螺杆菌通过调控GDDR的表达和功能促胃癌发生发展的可能机制；4.通过动物实验和相关临床病例资料分析，进一步探究GDDR表达和幽门螺杆菌感染的相关性及其在胃癌发生发展中的意义。【实验结果】1.在胃癌的发生发展过程中，GDDR蛋白表达逐渐降低甚至缺失；2.特异性过表达GDDR，可抑制胃癌细胞的增殖，并促进胃癌细胞凋亡；3.在幽门螺杆菌感染相关的胃癌和癌前病变形成过程中，GDDR蛋白表达有更显着的下调和缺失，且可能是经调控NF-kappaB（NF-κB）信号转导途径发挥作用；4.根除幽门螺杆菌后，GDDR蛋白表达可有回升。【实验结论】1.体外实验证实GDDR在正常胃粘膜中高表达，在胃癌及癌前病变中逐步下调甚至缺失，而过表达GDDR又可抑制胃癌细胞的增殖并可促进胃癌细胞凋亡，提示GDDR不仅是一种新的胃癌抑制基因，而且其分子表达下调或缺失可能是胃癌形成的早期事件。2.幽门螺杆菌感染可下调GDDR的表达和功能，其主要是调控GDDR的抑癌作用和促胃癌细胞凋亡作用，根除幽门螺杆菌后，GDDR的表达和功能有明显的回升。发现幽门螺杆菌通过下调GDDR表达和功能在胃癌形成中发挥作用的途径可能是通过激活被GDDR抑制的NF-κB信号转导途径实现的。3.上调GDDR表达和根除幽门螺杆菌，有望在胃癌的早期防治中发挥重要作用。4.早期检测GDDR的表达变化和幽门螺杆菌感染情况，或可为胃癌和癌前病变的早期诊断提供新策略。
张万岱, 姚永莉, 宋于刚, 张亚历, 张振书[4]2002年在《幽门螺杆菌感染与胃癌形成的动物实验研究》文中提出目的:(1)建立HP长期感染蒙古沙土鼠腺胃模型,验证该模型出现的病理改变及腺胃肿瘤的发生情况;(2)在建立HP长期感染蒙古沙土鼠腺胃模型的基础上,探讨HP感染与胃癌发生的可能机制。
常艳萍[5]2013年在《Hp感染动物模型的建立及重组Bb-vacA-hpaA疫苗的免疫保护性研究》文中指出目的：1.构建幽门螺杆菌感染的SPF级BALB/c小鼠动物模型,为进一步研究幽门螺杆菌的致病机制、防治和疫苗研制提供基础。2.探讨重组Bb-vacA-hpaA疫苗对感染幽门螺杆菌的SPF级BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法：1.用幽门螺杆菌标准菌株ATCC43504灌胃感染SPF级BALB/c小鼠,根据胃粘膜组织学检查和快速尿素酶检测确定感染模型的建立。2.随机将BALB/c小鼠分为四组：疫苗组、Bb组、PBS组和空白对照组。疫苗组用幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA疫苗灌胃免疫小鼠；Bb组用Bb菌液灌胃小鼠；PBS组用PBS液灌胃小鼠；空白对照组不作任何处理。4w后除空白组外,其他各组小鼠用幽门螺杆菌标准菌株ATCC43504灌胃攻击。3.检测幽门螺杆菌攻击后各组以及空白组小鼠胃粘膜内幽门螺杆菌感染情况、胃组织病理切片、血清中幽门螺杆菌相关抗体以及胃粘膜和肠粘液的SIgA抗体水平；攻击前后疫苗组、Bb组和PBS组胃粘膜内IFN-γ和IL-4含量。4.用MTT法检测小鼠脾细胞增殖情况,并用脾脏、胸腺指数评价幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA疫苗对SPF级BALB/c小鼠的免疫功能的增强作用。结果：1.通过胃粘膜的HE染色、镀银染色和幽门螺杆菌快速尿素酶试验结果显示：感染组的胃组织切片HE染色可见胃粘膜坏死、脱落、等典型炎性病变；镀银染色后胃粘膜内可见大量的Hp定植。成功建立幽门螺杆菌感染的SPF级BALB/c鼠动物模型。2.免疫攻击后各组胃组织切片结果显示：疫苗组快速尿素酶检测阴性的小鼠胃组织HE染色后未见典型炎性病变,镀银染色后胃粘膜内未见幽门螺杆菌定植；Bb组和PBS组的小鼠胃组织HE染色后可见胃粘膜坏死、脱落、充血、炎细胞浸润等典型炎性病变,镀银染色后胃粘膜内可见大量的幽门螺杆菌定植。空白组小鼠胃粘膜未见异常。3. ELISA法检测攻击后各组小鼠胃粘膜组织匀浆上清和血清中幽门螺杆菌相关抗体以及肠粘液的SIgA抗体水平显示：疫苗组的小鼠体内抗体水平和胃黏膜内细胞因子含量显着高于其他各组。4.MTT法检测表明重组Bb-vacA-hpaA疫苗对幽门螺杆菌抗原刺激的脾细胞增殖水平显着高于未免疫组。结论：1.成功建立幽门螺杆菌感染的SPF级BALB/c小鼠动物模型。2.重组Bb-vacA-hpaA疫苗对幽门螺杆菌感染有一定的免疫保护作用。
杜东龙[6]2015年在《幽门螺杆菌cagA 3'端多态性分析及幽门螺杆菌对LAIR-1影响的实验研究》文中指出目的：1.分析幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)临床分离株细胞毒素相关基因A (cytotoxin-associated gene A, cagA)基因的3'端多态性,通过定点突变并构建原核表达系统制备野生型与突变型CagA重组蛋白,观察两种蛋白对人胃上皮细胞GES-1凋亡的影响；2.分析H. pylori悉尼株SS1感染后,C57BL/6小鼠外周血单核细胞和淋巴细胞及其表面白细胞相关免疫球蛋白样受体-1(Leukocyte-associated immuno-globulin-like receptor-1, LAIR-1)分子的表达变化。方法：1.将不同疾病来源的胃黏膜标本研磨后,均匀涂布于Karmali培养基上,37℃微需氧条件下培养72h,培养物经菌落特征、革兰染色、快速尿素酶试验、氧化酶试验和过氧化物酶试验鉴定为H. pylori,进行基因组DNA的提取；2.根据NCBI基因数据库中已公布的H. pylori国际标准菌株的cagA基因序列,经同源比对分析,利用Primer Premier 5.0软件设计引物,PCR法扩增各临床分离菌株的cagA基因3'端,产物经切胶纯化后测序,用DNAStar5.0软件中的MegAlign程序对其序列进行比对分析；3.采用Primer Premier5.0软件设计cagA基因的引物,引入突变位点,以H. pylori ATCC26695基因组DNA为模板,通过重迭延伸PCR法进获得突变型cagA基因,另利用上下游引物扩增野生型的cagA基因；将二者分别通过双酶切连接至pET-30a(+)表达载体,构建其原核表达系统,转化至BL21(DE3) pLysS感受态细胞进行重组蛋白的诱导表达；将纯化复性后的野生型及突变型CagA蛋白分别以高浓度、低浓度与人胃上皮细胞GES-1共培养,于3h、12h和24h后行流式细胞术检测GES-1细胞的凋亡。4.经灌胃接种H. pylori悉尼株SS1感染C57BL/6小鼠,构建H. pylori感染小鼠模型,于灌胃6周后对小鼠胃黏膜进行H. pylori的分离培养,培养物经菌落特征、革兰染色、菌落PCR及快速尿素酶试验、氧化酶试验和过氧化物酶试验明确H. pylori是否定植。同时通过眼球摘除法取血,Ficoll密度梯度离心法分离小鼠外周血单个核细胞,流式细胞术分析小鼠PBMC及其表面LAIR-1分子的表达变化；结果：1.将患者标本匀浆接种于Karmali培养基置于微需氧环境中37℃培养72h后,培养基上出现针尖大小的透明菌落。革兰氏染色后经油镜观察,可见弧形的革兰阴性菌,且尿素酶、氧化酶与过氧化物酶试验均为阳性,确定为H. pylori临床分离株,共计66株；2.66株H. pylori临床分离株均为cagA阳性菌株(cagA+),其中93.9%(62/66)为东亚型(EPIYA-ABD),6.1%(4/66)为西方型(EPIYA-ABC);对于EPIYA-B基序而言,3.2%(2/62)的东亚型菌株突变为ESIYA-B,100%的西方型菌株突变为EPIYT-B;在胃癌患者分离株中,88.9%(16/18)为东亚型,11.1%(2/18)为西方型；非胃癌分离株中,95.8%(46/48)为东亚型,4.2%(2/48)为西方型；2株分离自胃癌患者的西方型菌株EPIYA-A后的第一个氨基酸残基均由赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)；3.定点突变后,突变型cagA基因靶位点核苷酸成功由腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)；成功构建pET-30a(+)-cagA-BL21(DE3)原核表达系统,重组蛋白经SDS-PAGE检测,在相对分子质量30 kDa处有一明显条带,与预期的6His-CagA融合蛋白大小一致。4.将重组蛋白与GES-1细胞共培养后发现,高浓度的重组蛋白引起的细胞凋亡率均大于低浓度组；随时间延长,突变型CagA蛋白可使GES-1细胞的凋亡率上调；但相同浓度、相同时间情况下,与野生型CagA相比,突变型CagA致细胞凋亡率降低。5.对小鼠胃黏膜进行H. pylori的分离培养,发现小鼠于灌胃6周后的胃黏膜标本在培养基上长出针尖大小的透明菌落。革兰氏染色后经油镜观察,可见弧形的革兰阴性菌,且PCR、尿素酶、氧化酶与过氧化物酶试验均为阳性,确定为H. pylori,共计21株,小鼠感染率为91.3%(21/23);6.流式细胞术分析发现经H. pylori定植感染后,小鼠外周血单个核细胞中单核细胞所占百分比为22.85±3.56%,较对照组(49.85±0.35%)明显下降(P<0.05)；相反,淋巴细胞所占外周血单个核细胞的百分比为40.93±10.05%,较对照组(30.15±0.35%)显着上升(P<0.05)；小鼠外周血单核细胞表面LAIR-1分子的表达率为70.16±7.75%,较对照组(83.4±0.1%)显着下降(P<0.05)；淋巴细胞表面LAIR-1分子的表达率为56.81±11.37%,同样显着低于对照组(72.3±0.6%)(P<0.05)。结论：1.本研究中H. pylori cagA基因以东亚型为主,两型菌株的cagA基因3'端都存在单核苷酸的改变,胃癌来源的西方型分离株中cagA基因功能结构域存在1处单核苷酸多态性；2.高浓度的重组蛋白引起的细胞凋亡率均大于低浓度组,随时间延长突变型CagA蛋白使细胞凋亡率上调,但与野生型CagA相比,突变型CagA致细胞凋亡率降低。3. H. pylori感染下调了小鼠PBMC中单核细胞所占的百分比,但上调了淋巴细胞的比例；H. pylori感染下调了小鼠PBMC中LAIR-1分子的表达。
杨俊[7]2003年在《清幽胃泰汤治疗脾虚沙土鼠感染幽门螺杆菌相关性胃炎的实验研究》文中研究指明目的：建立脾虚沙土鼠感染Hp动物模型，观察清幽胃泰汤对脾虚沙土鼠感染Hp动物模型的除菌疗效与改善炎症作用，初步探讨Hp感染相关性胃炎的中医学致病机制和清幽胃泰汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的机制。 方法：采用国际标准菌株SS1灌喂利血平致脾虚沙土鼠，建立脾虚沙土鼠感染Hp动物模型，并与脾虚沙土鼠组、Hp感染沙土鼠组及正常沙土鼠组对照；予以清幽胃泰汤常规剂量及双倍剂量治疗脾虚沙土鼠感染Hp动物模型，与丽珠胃叁联及空白组对照，检测胃粘膜Hp定植量、炎症程度及NO含量、NOS活性。 结果：脾虚沙土鼠感染Hp后胃粘膜NO含量和NOS活性较其他各组显着性升高，胃粘膜Hp的定植量也显着性增加、炎症程度随之加重；脾虚沙土鼠胃粘膜NO含量和NOS活性显着性降低，炎症程度无显着性加重；Hp感染组的胃粘膜Hp定植量及炎症程度较正常组和脾虚组比较均有显着性增加，胃粘膜NO含量和NOS活性较正常组虽有增高，但无统计学意义。与空白组比较，清幽胃泰汤的常规剂量及双倍剂量均能有效清除Hp，改善粘膜炎症，胃粘膜NO含量、NOS活性显着性下降，清幽胃泰汤常规剂量与双倍剂量二者比较无显着性差异；与丽珠胃叁联比较，清幽胃泰汤除菌效果弱于丽珠胃叁联，改善粘膜炎症、降低胃粘膜NO含量、NOS活性与丽珠胃叁联组无显着性差异。 结论：脾胃虚弱可能是Hp感染的病理基础，而Hp感染也是导致胃粘膜炎症活动的致病因素；清幽胃泰汤对脾虚沙土鼠感染幽门螺杆菌动物模型能有效清除Hp，可能是通过对胃粘膜中NO含量的调节而改善粘膜炎症。
陈建国[8]2012年在《幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究》文中研究表明幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori, Hp)广泛存在于人类的胃中,是导致慢性胃炎、胃肠溃疡、胃腺癌等胃肠疾病的主要病原菌,已严重影响着人们的身体健康。尽管国内外采用抗生素叁联、四联疗法在治疗H. pylori引起相关的胃炎和胃溃疡等胃肠疾病方面取得了较大成果,但临床发现广谱抗生素的治疗导致幽门螺杆菌耐药菌株不断出现和治愈后复发率居高不下,临床上将很快进入“感染-治愈-复发-再治疗-耐药”的恶性循环,不能彻底解决问题。因此希望通过疫苗免疫奶牛使在牛奶中产生高水平的抗幽门螺杆菌抗体,通过口服该抗体,来预防和治疗H. pylori引起的慢性胃炎、胃肠溃疡等胃肠疾病。因此希望使用安全、高效、使用方便的疫苗来免疫动物产生高浓度抗体或用该疫苗免疫动物使之对幽门螺杆菌产生有效的抵抗力。本研究首先选取生产后10天健康、无乳腺疾病和生殖器官疾病、体温正常的奶牛14头,随机分为两组：PBS对照组和幽门螺杆菌全菌蛋白免疫注射组,每组7头。用浓度为2×1010cfu/mL的幽门螺杆菌(H. polyri)NCTC11637全菌经超声破碎后与等剂量的完全(不完全)弗氏佐剂充分乳化后分别于0、14、28天叁次多点肌肉注射全菌蛋白疫苗,每次4mL,免疫产后泌乳的健康奶牛,对照组每次注射PBS与弗氏佐剂乳化物4mL。每周采血和收集牛奶各一次,离心收集血清,以酶联免疫吸附试验测定血清、乳汁的IgG抗体,同时测量体温,观察发情和采食泌乳等健康情况。研究结果显示经肌注幽门螺杆菌全菌蛋白免疫奶牛后可在血清和乳汁中产生特异性抗体,抗体浓度显着高于对照组(P<0.05),但免疫结束后不久逐渐下降。免疫奶牛的体温、发情和采食泌乳等情况正常。但全菌蛋白疫苗费用高,制作麻烦,注射时阻力大、奶牛反应强烈,且需要多次多点注射。结果表明肌肉注射幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗是一个安全、有效的免疫途径。但全菌蛋白疫苗制作麻烦,费用高,注射时奶牛反应大。因此希望构建更加安全、高效和使用更为方便的疫苗代替幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗。考虑到幽门螺杆菌是肠道菌群,通过口服引起胃肠道粘膜免疫是一种可行途径。但口服的蛋白疫苗的制作复杂,提纯麻烦,且时间较长,同时需加相应的免疫佐剂提高免疫原性,在口服过程中蛋白疫苗还容易被胃酸及胃蛋白酶破坏而丧失免疫功能。因此考虑用大肠杆菌或减毒沙门氏菌来作为载体。本实验室多次采用减毒猪霍乱沙门氏菌C500作为载体,安全且免疫效果好,希望构建幽门螺杆菌的减毒猪霍乱沙门菌C500口服活载体疫苗。本实验选取幽门螺杆菌中已证实具有免疫原性的两个基因：尿素酶B(urease B, UreB)和细胞毒素相关抗原(cytotoxin-associated antigen, CagA)。先采用PCR技术从幽门螺杆菌标准株SS1扩增Hp-UreB和Hp-CagA基因,将其连接至原核表达质粒pYA3493中,使之构建为pYA3493-UreB-CagA重组质粒,经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列,并与GenBank中已发表的相关序列的进行同源性分析。重组质粒pYA3493-UreB-CagA电击转入减毒猪霍乱沙门菌C500,培养后筛选阳性菌落,抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的UreB-CagA蛋白用SDS-PAGE和Western Blotting进行鉴定。然后将无特定病原菌昆明小鼠分成5组,每组10只,分别为肌肉注射幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗和灌胃分别给予含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500(0.2mL,1×1010CFUmL-1)、含空质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500(0.2mL,1×1010CFUmL-1)、减毒沙门氏菌C500(0.2mL,1×1010CFUmL-1)以及PBS (0.2mL)。每周免疫一次,连续五次。第六周后再用活H. pylori SS1(0.2mL,1×1010CFUmL-1)灌胃攻击,每天一次,连续叁天。第九周采血后处死实验小鼠,取一半胃粘膜和十二指肠研磨进行细菌培养检查H. pylori在胃肠定植情况,另一半用于组织切片和免疫组化观察胃肠损伤情况和免疫蛋白分泌的情况,同时对重要脏器肝、脾、肺进行组织切片观察损伤情况。实验前和实验后每隔一周或二周采血一次,连续8次,离心分离血清,采用ELISA检测小鼠血清中的抗体水平。检验pYA3493-UreB-CagA减毒猪霍乱沙门菌C500口服疫苗对小鼠的免疫效果和口服疫苗的安全性评价。结果：核苷酸序列测定及同源性分析证实,克隆的Hp-CagA和Hp-UreB基因与GenBank中相关序列的同源性分别为98%和100%(472／480和1134／1134)。重组质粒PYA3493-UreB-CagA转染减毒猪霍乱沙门菌C500,可表达约59kD的UreB-CagA蛋白。全菌蛋白注射组和含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500组的血清中幽门螺杆菌特异抗体滴度显着高于含质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500组、减毒沙门氏菌C500组以及PBS组(P<0.01)。但均未完全保护月=pylori SS1对胃的攻击,五组中胃和十二指肠均有H. pylori SS1的定植。但全菌蛋白注射组和含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500组小鼠胃肠内的菌落数量显着低于含质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500组、减毒沙门氏菌C500组以及PBS组(P<0.01)。免疫组化表明全菌注射组和口服疫苗中胃和十二指肠有明显的抗体存在,且所有组胃、十二指肠、肝、脾以及肺均无明显损伤,也无小鼠死亡。结果表明建立了同时表达Hp-CagA和Hp-UreB基因的减毒猪霍乱沙门菌疫苗株,该口服减毒沙门氏菌载体疫苗有明显的免疫预防效果,而且比较安全,但不能完全抑制幽门螺杆菌在胃和十二指肠中定植。以上是UreB-CagA双价口服活载体疫苗在小鼠体内的免疫效果,安全有效。体外实验希望通过构建H. pylori的CagA和UreB基因重组真核表达质粒用电击法转染到胃粘膜上皮细胞GES-1后,用幽门螺杆菌SSl攻击转染成功的胃上皮细胞((?)ES-1,观察对细胞凋亡及细胞形态的影响,探讨细胞凋亡机制。采用PCR技术从幽门螺杆菌标准株SS1中获取CagA部分基因和UreB全长基因与真核表达载体pEGFP-N1相连,构建幽门螺杆菌CagA/UreB真核荧光表达载体pEGFP-N1-CagA-UreB,并用脂质体的方法将质粒pEGFP-N1-UreB-CagA和空质粒pEGFP-N1分别转染到胃粘膜上皮细胞GES-1中,用(3418筛选阳性细胞,用幽门螺杆菌SSl分别处理转染pEGFP-N1-CagA-UreB的细胞、转染pEGFP-N1的细胞以及没转染质粒的细胞。用Annexin V-APC和7-AAD染色后,流式细胞术检测胃上皮细胞GES-1凋亡和死亡的情况,同时透射电镜观察胃上皮细胞GES-1的形态变化。结果发现用脂质体转染质粒到细胞GES-1,转染效率可高达60%以上,500μg G418可对转染细胞进行筛选,筛选后的阳性细胞用幽门螺杆菌处理后,凋亡率要小于空质粒转染的细胞和未转染质粒的细胞,但长时间处理后GES-1细胞均死亡,电镜结果显示细胞凋亡和坏死。结果表明质粒pEGFP-N1-UreB-CagA可转染到胃上皮细胞GES-1在培养细胞内的表达可抵抗幽门螺杆菌SSl对细胞GES-1的破坏,减少细胞凋亡。但用幽门螺杆菌长时间、大剂量处理也会导致细胞凋亡和坏死。这说明尿素酶B和CagA可导致细胞凋亡,但同时也有其他途径参与凋亡过程。
韩秀萍[9]2010年在《幽门螺杆菌基因敲除方法的建立及其应用研究》文中提出目的：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是一种革兰氏阴性的微需氧菌,他定植于胃黏膜上皮细胞的表面,以及胃小凹内黏液深层。大量流行病学的研究调查显示：全世界约有一半的人口中存在H. pylori的感染,它与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤以及胃腺癌等疾病的发生有关联。大量研究也证实,多个H.pylori的毒力因子直接或间接地参与了上述的病理反应,大部分主要集中于研究CagA, VacA,UreB等毒力因子的研究方面,并且在H. pylori致病过程中也可能还存在其他重要的毒力因子。本研究旨在通过建立H. pylori体内基因敲除方法来筛查新的H. pylori致胃病相关蛋白,并对其进行基因改造和分析评价,以及对其致病机制进行进一步研究。方法与结果：第一部分,我们选择cagA,hp0596作为候选基因,从H. pylori 26695基因组中分别扩增得到此研究所需基因的上下游同源臂,与两端带有FRT位点的氯霉素抗性基因片段共同构建突变载体；以突变载体为模板扩增打靶片段,将其转化入H.pylori26695,在抗生素选择压力下,打靶片段和H. pylori菌体基因组发生同源重组,通过氯霉素抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌转化子,并通过一系列的实验建立了在幽门螺杆菌中进行基因打靶的技术方法。确定了实验研究过程中的几个关键点,如打靶质粒的浓度、高效的电转化条件、所用抗生素的浓度和突变株的筛选培养方式,建立了相对高效的基因打靶的方法。在此基础上我们成功地对cagA, hp0596基因进行了敲除,并在基因组水平、RNA水平和蛋白质水平进行了验证。第二部分,为避免H. pylori重组菌株对抗生素选择压力的依赖,我们利用反选择标记sacB基因在幽门螺杆菌中建立了无痕敲除系统,即通过体内基因敲除的方式构建了打靶载体,并对其生长表型作了综合评价分析。具体而言,我们选定ureB基因作为我们进行基因敲除的目标,利用同源重组原理,成功敲除了幽门螺杆菌中ureB基因,并且结合反选择系统sacB基因的作用,得到不含抗性标记的突变株H.pylori26695(AureB)。研究表明与野生菌株相比突变菌株尿素酶的功能缺失,这样通过正负两步置换选择法在幽门螺杆菌中建立了体内基因无痕敲除的方法。第叁部分,构建穿梭载体,实现Salmonella的肠黏附素蛋白在HPSS1株外膜蛋白上的表达。利用λRed系统将穿梭质粒pHH43进行改造,将菌蜕基因genE及其上游的温度敏感型启动子和下游的cat抗性基因,通过同源重组的方法置换为Salmonella的肠黏附素操纵元1pfABCDE,并将筛选基因替换为卡那霉素抗性基因。将改造好的质粒转化入HPSSl株中,实现黏附素1pfA蛋白在外膜的表达,并开展后续的鉴定工作。结论：在幽门螺杆菌中建立了高效的体内基因重组方法,证明此方法对研究分析幽门螺杆菌的功能是最有力的工具。并且利用λRed系统成功构建改造了E. coli-H.phlori穿梭表达载体,实现了lpfA蛋白在外膜的表达。
江花[10]2003年在《溃宁口服液抑杀幽门螺杆菌的实验研究》文中研究指明实验目的：通过该实验研究溃宁口服液对胃溃疡H.pylori有无直接和间接的抑杀作用，以及该药物与H.pylori、机体叁者间的相互影响，从而论证该药物是否有确切的治疗效果，以确定有无作为新药开发的可能。 方法：实验包括叁部分：第一部分用纸片法和试管法作溃宁口服液对H.pylori的敏感实验；第二部分通过Hp的接种，建立沙土鼠感染模型，再现同一病变，用组织化学、光镜和油镜检测病理组织学变化，并观察除菌治疗前后细胞浸润和细胞增殖的变化，研究Hp的致病过程，并通过沙土鼠肝脏MDA的测定以了解各治疗方法对机体自由基的影响；第叁部分是用炭粒廓清实验进行BALb／C小鼠、昆明小鼠服用溃宁口服液后单核细胞吞噬功能测定以及冰水游泳实验来测定该口服液对动物应激能力的影响。 结果：体外药物敏感试验证明“溃宁”口服液有明确的抑杀H.pylori能力，H.pylori感染沙土鼠各种治疗法均有清除H.pylori的效果，其中以溃宁低剂量组为优，从病理组织切片早期2wk以幽门为中心可见大量炎性细胞浸润，随着感染时间的增加，炎症越来越重，感染4wk后幽门部小弯附近可见溃疡出现。感染早期以中性粒细胞浸润为主的急性炎症改变，随着感染的持续转变为以淋巴细胞为主的慢性炎症改变及淋巴滤泡的广泛形成，除菌治疗后炎症细胞及肝脏中MDA明显减低；服用溃宁口服液可增强BALb／C小鼠、昆明小鼠的单核巨噬细胞的吞噬功能，且可延长其冰水游泳时间，提示溃宁口服液和西药叁联疗法是完全有效的H.pylori消化性溃疡治疗剂，而在增加机体细胞免疫和应激能力，清除自由基方面，“溃宁”口服液似更有优势。结论：作为一种治疗相关性胃溃疡的新药，“溃宁”口服液有很好的开发前景。
参考文献：
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