胡琦[1]2002年在《转化生长因子-β_1诱导角膜移植免疫耐受和抑制的研究》文中研究说明角膜病是致盲的主要眼病之一。角膜移植是治疗角膜盲的重要复明手术，也是治疗某些顽固性角膜病病变的重要措施。虽然角膜移植手术具有较高的成功率，在无血管植床进行角膜移植，其排斥反应发生率仅为5～10％，但在血管化植床进行的角膜移植或二次角膜移植，其发生率却高达50％以上。因此，免疫排斥反应仍是角膜移植手术失败的主要原因。加强角膜移植免疫排斥反应预防与治疗的研究，对于提高手术的成功率具有重要的意义。 应用免疫抑制剂是目前预防和治疗角膜移植术后免疫排斥反应的主要手段。免疫抑制剂的应用，虽然大大提高了角膜移植的成功率，提高了角膜植片的存活率，但是仍有部分病例排斥反应不能逆转，特别是在高危角膜移植中，免疫抑制剂效果较差。目前广泛使用的免疫抑制剂都是以非特异方式抑制整个免疫系统。而其本身的毒副作用也限制了其长期有效的应用。因此，诱导受体对供体角膜特异性的免疫耐受，将是防止角膜移植排斥的较为理想的方法。 在同种异体移植中，树突状细胞(dendritic cell，DC)通过提呈异体MHC抗原并表达共刺激分子，如CD_(80)、CD_(86)，激活受者初始型T细胞，诱导免疫应答。目前认为，DC既可引起移植排斥，也可诱导移植耐受，这取决于DC的来源及其分化发育状态。成熟DC可以激活静息T细胞而介导移植排斥；不成熟DC由于共刺激分子表达缺陷，而诱导T细胞的无反应性，导致免疫耐受。近来研究证实，将不成熟DC进行受体鼠术前输注，可以明显延长同种异体心脏移植物的存活时间。 转化生长因子-β_1(transforming growth factor-β_1，TGF-β_1)是强力免疫抑制 tiasaml8H1KXi1g．．－－－－－－－－－－－－－－－－－theffi－ 性细胞因子，能影响造血祖细胞（包括DC）的增殖和分化，阻止DC的成熟，诱－＿＿＿。 导同种免疫耐受。因此，TGF民能够作为致耐因子诱导DC的免疫耐受原性。近、－ 来研究发现，TGF民能够对抗免疫排斥反应，在小鼠及大鼠同种异体心脏移植及－。 胰岛细胞移植模型中应用 TGF－民能够明显延长移植物存活时间。表明 TGF民、一 还具有作为免疫抑制剂延长器官移植存活的潜在性。＿ 因此，本研究将在应用TGF－民建立大鼠同种异体角膜移植免疫耐受模型的基，， 础上，进一步探讨TGF－民诱导同种异体角膜植片存活延长的可能机制。为开展同－ 种异体角膜移植免疫耐受的研究提供实验依据。同时，对同种异体角膜移植术后＿。 免疫排斥反应、蚕蚀性角膜溃疡和单疮病毒性角膜基质炎晚期病变局部应用TGF ～ p；治疗进行了初步临床观察。上述研究内容，所阅文献尚未见报道～－ 第一部分TGF pl对大鼠骨髓树突状细胞＿－， 表型及免疫刺激活性的影响＿＿，邑卫 1．目的－－－；研究TGF－p；对大鼠骨髓DC表型及免疫刺激活性的影响。证实TGF小 能够．i 显着抑制骨髓 DC的分化和成熟，抑制辅助刺激分子 CD肪的表达；在体外同种异。。g 体混合淋巴细胞反应中能够诱导出同种异体大鼠T细胞免疫低应答。，3t 2．方法－i 2．l健康近交系SD大鼠作为供体，W幻。大鼠作为受体～g 2二应用细胞因子 rGMCSFO．3n咖l）竹IL4＊刀 ＂g／inl）培养供体大鼠骨髓成熟－－8 DC。应用细胞因子 rGMcSF＊．3n咖1）＋TGF－p，0．sng／ml）培养供体大鼠骨髓未成g 熟DC。g 2．3大鼠骨髓 DC的鉴定：包括光镜及扫描电镜观察、细胞表面标志 Sd 蛋白…－g 免疫组化染色。g’2．4大鼠骨髓DC的细胞表型分析：采用流式细胞仪分析成熟和未成熟DC表面。＠MHC刁类分子和 CD。。分子的表达变化。；gZ．5免疫生物活性检测：采用MTT法测定成熟与未成熟DC刺激同种异体T淋巴82 j量 ～1＄AllEZx1LmAita22＝is1QLtajj；＆2B．－－－－－－．－－－－－－－－．－－－－－－－－－．－－－aretritrithetritheforthethethetri细胞增殖的能力。3．结果3＊ 应用GM－CSF＋IL－4培养的大鼠供体骨髓DC，细胞表型特征是高表达MHC．11类分子及CDs。分子。3．2 应用GM－CSF＋TGF－p；培养的大鼠供体骨髓DC，细胞表面中度表达MHC－11类分子，低表达T细胞共刺激分子CDs。。3．3 同种异体混合淋巴细胞反应显示TGF－p＊C能够显着抑制同种异体T淋巴细胞的增殖。4．结论4．ITGF－pl能够显着抑制大鼠骨髓DC的分化与功能成熟；抑制大鼠骨髓DC的MHC刁类分子与共刺激分子CD86的表达；4．2 TGF－fi；诱导的共刺激分子缺乏的未成熟DC，在体外同种异体混合淋巴细胞反应中能够诱导同种异体T细胞免疫低应答。表明该种DC处于功能未成熟状态，不能引起宿主T细胞的免疫反应，而可能成为诱导移植免疫耐受的重要靶细胞。为开展以未成熟DC为基础的各种免疫治疗研究奠定了良好的基础
闫峰[2]2007年在《TGF-beta DC诱导调节性T细胞在角膜移植排斥反应中作用的实验研究》文中研究指明目的角膜移植是治疗不可逆性致盲性角膜病变的最有效的治疗手段,也是成功率最高的固体器官移植手术。尽管眼具有“免疫赦免”功能,但移植排斥反应仍是导致角膜移植手术失败的首要原因。由于角膜移植片在结构上直接与前房相连,移植片的存活时间被认为与植片中异体抗原诱发的前房相关性免疫偏离(anterior chamber–associated immune deviation ,ACAID)能力紧密相关。房水中含有多种免疫抑制因子,如TGF-β可促使树突状细胞(dendritic cells,DC)维持在不成熟状态,当这种不成熟型DC在眼内摄取异体抗原后迁移至脾脏内,在NKT细胞和B细胞存在的条件下,将促使某些抗原特异性T细胞转化成为调节性T细胞(regulatory T cells,Treg),抑制迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity, DTH)。近年来,人们对T细胞的免疫调节作用有了新的认识和兴趣,意识到抑制性调节性T细胞的存在,并认为这群调节性T细胞在诱发移植耐受和治疗自身免疫性疾病中起关键作用。目前Treg被定义为两类,一类为胸腺来源的天然Treg(natural regulatory T cells/nTreg or innate Treg);另一类为外周诱导产生的获得性Treg(inducible regulatory T cells/iTreg or adaptive Treg)。最近越来越多的过继转移实验研究认为,CD4+CD25+Treg可以推迟甚至治疗同种异体移植物排斥反应,在诱发移植免疫耐受中作用显着;因此,认为天然CD4+CD25+Treg被认为可以作为过继转移细胞,在治疗器官移植排斥反应和自身免疫性疾病方面具有巨大的临床应用潜能。但是目前主要有叁方面的原因限制了CD4+CD25+Treg的临床应用。首先,天然CD4+CD25+Treg的数量非常少,仅占外周CD4+T细胞的4%～10%;其次,关于CD4+CD25+Treg抗原特异性的研究仍很缺乏,具有抗原特异性的CD4+CD25+Treg可能达到更有效地治疗目的,并能减少免疫治疗中的副作用;最后,关于CD4+CD25+Treg诱导免疫耐受方面的机制还不十分清楚。而眼的结构特征,为局部地或系统地研究Treg的免疫调节作用提供了一个新的平台。本研究的目的是通过建立小鼠角膜移植模型,研究同种异体角膜移植排斥反应中的Treg变化特点,探讨TGF-βDC诱导抗原特异性Treg的可行性,比较不同来源Treg对角膜移植排斥反应免疫抑制作用的异同,为临床有效调控、治疗角膜移植排斥反应及其他自身免疫性疾病提供重要的理论依据。方法1.建立小鼠原位角膜移植模型,临床观察比较自体和同种异体移植片的存活时间和排斥曲线;RT-PCR检测同种异体移植术后不同时间点植片内细胞因子mRNA的表达水平;自体或同种异体角膜移植后3d,流式细胞术分析(flow cytometric analysis,FACS)分析颌下淋巴结(submandibular lymph node,SMLN)、颈浅淋巴结(superficial cervical lymph node、SCLN)及脾淋巴细胞(splenic lymphocytes,SPL)中Treg的数量和表型。2.未成熟的树突状细胞(immature dendritic cells,iDCs)来源于小鼠骨髓(bone marrow,BM),在低浓度粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)培养条件下诱导生成,并联合0.2ng/ml TGF-β2下使DC维持在不成熟状态。iDC通过与供体来源的可溶性抗原(soluble antigen ,sAg)共孵育摄取供体抗原。将这种已摄取供体抗原的自体TGF-β2 DC或PBS经尾静脉注射给小鼠,3d后FACS分析TGF-β2 DC对SPL中Treg数量和表型的影响。3. FACS分别分析正常小鼠脾脏中CD4+/CD4+CD25+/CD4+CD25-叁个细胞亚群的表型;采用二步磁性细胞分选法(magnetic cell sorting,MACS)纯化小鼠脾脏CD+CD25+Treg,并对分离后的细胞表型进行鉴定。4. Balb/c小鼠分别给予PBS、TGF-βDC、天然Treg和获得性Treg,尾静脉注射,3d后进行同种异体原位角膜移植,临床观察植片存活时间和排斥曲线;FACS分析移植术后3d小鼠SPL中Treg数目和表型的变化。结果1.①自体角膜移植不发生排斥反应;所有同种异体角膜移植片在术后8d~24d均被排斥,平均存活时间为17.8±4.66d。②细胞因子表达水平在术后3d～1wk达到高峰,在此期间以TNF-α增高最为显著。③与自体角膜移植相比较,同种异体角膜移植术后3d ,小鼠SCLN和SPL中CD4+CD25+Treg细胞数量显着增高(P<0.01),占CD4+T细胞的比例分别达到9.29%和8.82%;SMLN、SCLN及SPL内CD4+CD25+Foxp3+细胞比例明显上升(P<0.01),其中CTLA-4+的表达有上升,但无显着统计学差异(P>0.05),而CD28+的表达有明显下降(P<0.05)。2. TGF-βDC提高了CD4+CD25+Treg细胞数量和功能:TGF-βDC诱导后,SPL中的CD4+CD25+细胞比例由5.52%上升至16.19% ( P<0.01 ),CD4+CD25+Foxp3+细胞比例也明显明显上升(P<0.01);CD4+CD25+细胞中CTLA-4表达由69.49%上升至84.29%(P<0.01),而CD28的表达由89.71%下降至67.13%(P<0.01)。3.①在这些CD25表达水平不同而划分的叁群正常小鼠天然CD4+T细胞,呈现出其它细胞表型表达的不同。Foxp3、CTLA-4、GITR、CD69在CD4+CD25+细胞亚群呈显着性高表达(P<0.01),CD4+CD25+T细胞主要存在于CD45RB低表达细胞亚群,CD28的表达在CD4+CD25+细胞亚群明显下降(P<0.05)。②使用二步MACS法从正常小鼠脾脏中分离CD4+CD25+T淋巴细胞的得率为1%～1.2%,获得纯度为87.29%～92.04%。FACS分析结果显示,Foxp3优先地表达于CD4+CD25+T细胞亚群(66.6±1.033%),而在CD4+或CD4+CD25-T细胞亚群呈低水平表达( 23.97±1.997%,16.78±3.24%);CTLA-4在CD4+CD25+T细胞亚群表达(77.37±1.67%)明显高于在CD4+(21.97±2.39%)或CD4+CD25- (18.04±3.16%)T细胞亚群的表达;纯化的CD4+CD25+T细胞亚群表现为CD127的低表达。4.①获得性Treg注射组显着抑制了同种异体角膜移植排斥反应:PBS注射组,所有移植片在术后10d～22d均发生排斥反应;TGF-βDC注射组,术后34d时1例发生明显混浊,术后38d时所有植片均发生排斥反应;天然Treg注射组,术后38d内植片保持透明,术后46d时所有植片均出现明显混浊;获得性Treg注射组,直至术后60d所有移植片未发现明显的排斥反应。4组角膜移植片的存活时间分别为16.50±4.3d、37.8±2.04、41.5±2.59和>60d,采用NPar检验说明4组间均有差别(P<0.05)。②同种异体角膜移植术后3d,小鼠SPL中CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+、CD4+CD25+CTLA-4+细胞比例在PBS注射组、TGF-βDC注射组、天然Treg注射组、获得性Treg注射组间有显着性差异(P<0.01)。对T细胞抑制功能的调节以获得性Treg注射组为着(P<0.01)。结论1.同种异体抗原是引起角膜移植排斥反应的重要的启动原因;小鼠同种异体角膜移植后颈浅淋巴结和脾脏中Treg细胞比例增高,可能参与了ACAID的形成机制。TNF-α是角膜移植术后局部参与调控的主要因子,它与Treg参与调控ACAID形成之间的关系有待进一步研究。2. TGF-βDC在体内可以有效地扩增Foxp3+CD4+CD25+Treg的数目和功能;结合第四部分的研究结果进一步说明Treg也参与了DC对角膜移植排斥反应的免疫调节作用。国内外文献未见报道。3.以CD25表达水平不同而划分的叁群正常小鼠体内天然CD4+T细胞,呈现出一些细胞表型表达的不同,如Foxp3,CTLA-4, GITR,CD45RB,CD69,CD28。MACS阴性加阳性二步分选法避免激惹CD4分子,可以获得高纯度的且具有天然CD4+CD25+ Treg细胞表型及功能特征的细胞。国内无类似报道。4.经诱导产生、以间接方式获取异体抗原特异性的Treg具有更强的抑制功能,更有效地抑制了角膜移植排斥反应,而且这种方法在未来临床免疫治疗上具有实用性。这是国内、外首次在移植排斥反应中比较了经DC体内诱导产生的Treg与天然Treg免疫调节作用的异同。
卢建民[3]2011年在《小鼠角膜基质细胞的间充质干细胞样表型和多向分化潜能以及抑制树突状细胞成熟的功能》文中研究说明角膜基质细胞(corneal stroma cells, CSCs)是散在分布于角膜基质内神经嵴来源的细胞,对维持角膜透明性发挥着重要作用。在体CSCs数量稀少,所以在体外对细胞进行培养扩增是必经的研究路径。研究表明,培养于含胎牛血清(FBS)的完全培养基内的CSCs会丧失其原有的生物学特性。然而,当培养于无血清的基础培养基时,细胞虽能保持其特性不变,却无法进行有效增殖。因此,如何在保持细胞生物学特性不变的情况下高效扩增CSCs,是目前研究难点之一。研究表明,出生后增殖性CSCs的细胞数量会迅速减少。当睑裂打开后,所有CSCs的细胞周期进入G0期。最近研究证实,CSCs表达众多干细胞标记物,并且具有多向分化潜能,与间充质干细胞的生物学特性十分相似。然而,目前尚缺乏小鼠CSCs是否具有间充质干细胞特性的研究。树突状细胞(dendritic cells, DCs)是目前已知体内功能最强的抗原呈递细胞。成熟DCs可引发机体免疫反应,而未成熟DCs则会诱导机体免疫耐受。而且,角膜内的DCs广泛的参与了多种角膜相关疾病以及角膜移植免疫排斥反应,且以角膜内DCs为靶细胞的治疗方法已取得可喜的疗效。因此,对角膜内的DCs,尤其对DCs成熟状态的研究具有重要意义。最近研究表明,位于角膜中央区的DCs完全处于未成熟状态,而位于角膜周边区的DCs则大多处于成熟状态。局部微环境对DCs的成熟状态发挥着重要的调节功能。所以,我们推测CSCs可能具有影响角膜内DCs成熟状态的功能,然而至今尚未见相关报道。因此,本研究旨在探索如何在体外有效扩增小鼠CSCs以及对CSCs的间充质干细胞特性和抑制DCs成熟的功能进行探讨。如下:第一部分小鼠角膜基质细胞的提取、鉴定以及培养扩增目的:研究使用KSFM培养基能否获取具有增殖能力且保持生物学特性不变的小鼠CSCs。方法:将中央区角膜置于EDTA液(20mmol/L)内孵育45min后,用手术显微镊小心剥离角膜上皮层以及内皮层,并将获取的角膜基质置于含300U/mL I型胶原酶的溶液中消化4h。离心后采用DMEM基础培养基、DMEM完全培养基(含10% FBS)以及KSFM培养基重悬细胞,接种于培养瓶内常规培养,并采用含1U/mL分散酶的EDTA液消化传代细胞。同时,观察细胞并绘制细胞生长曲线;采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞角膜蛋白多糖(keratocan)、乙醛脱氢酶(ALDH)、细胞角蛋白12(CK12)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)等基因的表达情况;采用细胞免疫荧光染色以及蛋白质印迹方法检测细胞keratocan蛋白的表达情况。结果:通过胶原酶消化的方法可以从每只小鼠的角膜基质获取约1×104单个细胞。RT-PCR结果显示:原代细胞表达CSCs标记物keratocan和ALDH,不表达角膜上皮细胞标记物CK12以及角膜内皮细胞标记物NSE;免疫荧光染色和蛋白质印迹结果显示:原代细胞表达keratocan蛋白。因此,本实验获取的原代细胞为CSCs。培养于DMEM基础培养基内的原代CSCs无法增殖。培养于DMEM完全培养基内的CSCs可增殖,但第3代细胞不表达keratocan和ALDH基因以及keratocan蛋白。培养于KSFM培养基内的CSCs也可增殖,第3代细胞仍表达keratocan和ALDH基因以及keratocan蛋白,且与原代细胞相比,表达强度无统计学差异(P>0.05)。结论:KSFM培养基不仅能维持小鼠CSCs的生物学特性不变,还能有效促进细胞增殖。第二部分小鼠角膜基质细胞的间充质干细胞样表型以及多向分化潜能目的:研究KSFM培养基培养扩增后的小鼠CSCs是否具有间充质干细胞样表型以及多向分化潜能。方法:在去除角膜上皮层以及内皮层后,通过胶原酶消化的方法获取小鼠中央区角膜来源的CSCs,并采用KSFM培养基对其培养扩增。收集第2代CSCs,将细胞与造血干细胞标记物抗体(CD34-FITC、CD45-PE)以及间质细胞标记物抗体(CD105-PE、CD90-FITC、CD71-FITC、CD29-APC)共孵育30min后,应用流式细胞技术进行检测。当培养于KSFM培养基内的CSCs达细胞融合后,更换成骨细胞诱导培养基(含10%FBS、100nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-磷酸甘油、50mg/L维生素C的DMEM培养基)、脂肪细胞诱导培养基(含10% FBS、0.5μmol/L地塞米松、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10mg/L胰岛素的DMEM培养基)以及对照培养基(含10% FBS的DMEM培养基),进行常规培养,每3d更换一次培养基。21d后,对培养于成骨细胞诱导培养基以及对照培养基内的细胞进行2%茜素红S染色,并通过RT-PCR检测细胞碱性磷酸酶和骨钙素等基因的表达情况;对培养于脂肪细胞诱导培养基以及对照培养基内的细胞进行0.3%油红O染色,并通过RT-PCR检测细胞脂蛋白脂酶和过氧化物酶增殖物激活受体γ等基因的表达情况。结果:应用流式细胞技术对第2代CSCs的表型特征进行分析,结果显示:细胞低表达CD34(3.68%±1.44%)以及CD45(9.56%±1.83%),高表达CD29(96.85%±1.91%)、CD90(93.62%±1.65%)、CD105(50.91%±2.56%)以及CD71(45.27%±3.56%)。在成骨诱导条件下,3d时,细胞形态仍然保持梭形,与对照组细胞无明显差别。7d时,细胞形态逐渐转变为多角形,胞浆内出现黑色颗粒。14d时,开始形成矿化结节,并逐渐增大,21d时,经茜素红S染色,结节呈现鲜红色。对照组细胞未显现出以上成骨细胞分化的形态学征象,且经茜素红S染色未见阳性结果。通过RT-PCR检测成骨细胞标记物基因的表达情况,结果显示:成骨诱导条件下细胞高表达碱性磷酸酶和骨钙素,而对照组细胞低表达碱性磷酸酶且不表达骨钙素。在脂肪诱导条件下,7d时,细胞形态逐渐由梭形转变为类圆形,胞浆内液滴也逐渐增多。14d时,细胞胞浆内满布液滴,经油红O染色,液滴被特异性染成橘红色。RT-PCR结果显示:脂肪诱导条件下细胞表达脂蛋白脂酶和过氧化物酶增殖物激活受体γ。而对照组细胞未显现出向脂肪细胞分化的任何征象。结论:经KSFM培养基培养扩增的小鼠中央区角膜来源的CSCs具有与间充质干细胞相似的表型特征,以及向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力。第叁部分小鼠角膜基质细胞培养上清液对树突状细胞成熟的抑制作用目的:研究小鼠CSCs培养上清液是否具有抑制脂多糖诱导的DCs成熟的作用。方法:通过尼龙毛柱法获取BALB/c小鼠脾脏来源的T细胞,并通过流式细胞技术检测细胞表面标记物CD3以测定T细胞纯度。原代小鼠CSCs(105/mL)培养于RPMI 1640基础培养基内,3d后半量换液,6d后收集培养上清液以备用。在裂解红细胞后,将由C57BL/6小鼠股骨获取的骨髓单核细胞培养于含10% FBS以及10ng/mL重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的RPMI 1640培养基内,2d后全量换液,4d后半量换液,6d后收集悬浮和半贴壁细胞,即为未成熟DCs。通过流式细胞技术检测细胞表面标记物CD11c以测定DCs纯度。向DCs培养液内加入脂多糖(1μg/mL),48h后未成熟DCs可被诱导成熟。为研究CSCs培养上清液对DCs成熟的作用,在DCs成熟过程中,不同浓度的培养上清液(25%、50%)被添加至DCs培养液中。而后,通过流式细胞技术检测DCs成熟状态标记物CD80、CD86和主要组织相容性抗原Ⅱ类分子(MHC-Ⅱ),以对DCs的表型成熟状态进行鉴定;通过混合淋巴细胞反应检测DCs刺激T细胞增殖能力以及通过FITC标记葡聚糖内吞实验检测抗原吞噬功能,以对DCs的功能成熟状态进行鉴定。结果:小鼠脾脏细胞经红细胞裂解以及尼龙毛柱筛选提取后,可得到大量单个悬浮的小细胞。经流式细胞技术检测,细胞高表达T细胞标记物CD3(93.97%±3.06%)。小鼠骨髓单核细胞诱导培养6d后,细胞集落明显,呈悬浮或半贴壁生长。细胞表面可见长短不一的毛刺状突起,且高表达CD11c(78.61%±4.27%),低表达CD80、CD86和MHC-Ⅱ。细胞经脂多糖刺激48h后,CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达明显上调。在DCs成熟过程中,将不同浓度的CSCs培养上清液(25%、50%)添加至DCs培养液后,与对照组相比,DCs CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达均降低(P<0.01),CD11c的表达无明显差异(P>0.05);刺激T细胞增殖能力降低(P<0.05);抗原吞噬功能增强(P<0.01)。此外,CSCs培养上清液抑制DCs成熟的作用还呈现出剂量依赖性(25% vs. 50%, P<0.05)。结论:小鼠CSCs培养上清液可以抑制脂多糖诱导的DCs表型以及功能成熟,且呈剂量依赖性。因此,我们推测CSCs可以通过分泌可溶性免疫调节因子抑制DCs成熟。第四部分小鼠角膜基质细胞通过分泌转化生长因子β2以及前列腺素E2抑制树突状细胞成熟目的:探索小鼠CSCs是否通过分泌转化生长因子β2(TGF-β2)、前列腺素E2(PGE2)、白介素10(IL-10)以及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)抑制DCs成熟。方法:采用RT-PCR检测原代小鼠CSCs TGF-β2、IL-10、M-CSF以及前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)等基因的表达情况。据此,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测定CSCs培养上清液以及新鲜RPMI 1640培养基内PGE2和TGF-β2的含量。而后,通过应用TGF-β2中和抗体(15μg/mL)以及PGE2受体阻滞剂AH6809(100μmol/L),对CSCs是否通过分泌TGF-β2以及PGE2抑制DCs成熟作进一步鉴定。在DCs成熟过程中,分别作以下不同处理:1,LPS;2,LPS+50% CSCs培养上清液;3,LPS+50% CSCs培养上清液+AH6809;4,LPS+50% CSCs培养上清液+中和抗体;5,LPS+50% CSCs培养上清液+AH6809+中和抗体。然后,应用流式细胞技术检测DCs CD11c、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达情况,通过混合淋巴细胞反应检测刺激T细胞增殖能力,以及通过FITC标记葡聚糖内吞实验检测抗原吞噬功能。结果:RT-PCR结果表明:原代小鼠CSCs高表达TGF-β2和PTGS2,低表达M-CSF,不表达IL-10;ELISA数据显示:与新鲜RPMI 1640培养基相比,CSCs培养上清液内含有较高浓度的TGF-β2(1.46±0.38 ng/mL)和PGE2(21.27±0.94 ng/mL)。向CSCs培养上清液中加入TGF-β2中和抗体,可以不同程度的逆转CSCs培养上清液对DCs表型以及功能成熟的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。使用AH6809预处理未成熟DCs同样可以不同程度的逆转CSCs培养上清液对DCs功能成熟的抑制作用(P<0.05),以及对CD86和MHC-Ⅱ表达的抑制作用(P<0.05或P<0.01),但不能逆转对CD80表达的抑制作用(P>0.05)。同时应用TGF-β2中和抗体以及AH6809,可以提高DCs MHC-Ⅱ的表达和刺激T细胞增殖能力,且存在交互作用(P<0.05);同时可以提高DCs CD80和CD86的表达以及降低DCs抗原吞噬功能,但不存在交互作用(P>0.05)。此外,同时应用TGF-β2中和抗体以及AH6809未完全逆转CSCs培养上清液对DCs成熟的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。结论:在体外,小鼠CSCs可以通过分泌TGF-β2以及PGE2抑制DCs成熟,且此两种细胞因子可发挥迭加效应。
杨洋[4]2007年在《转化生长因子β1对大鼠穿透性角膜移植后白介素的影响》文中研究表明目的研究大鼠角膜穿透性移植术后角膜植片上TGF-β1及IL-1β表达的变化规律,探讨TGF-β1及IL-1β在角膜移植免疫排斥反应中的作用。方法建立SD大鼠(受体)和Wistar大鼠(供体)同种异体穿透性角膜移植模型,分为试验组(TGF-β1眼液点眼),对照组(点氯霉素眼液)和自体组(SD大鼠自体穿透性角膜移植模型,点氯霉素眼液),术后每天显微镜观察术眼,判断移植免疫排斥反应的发生;术后一周、二周、叁周、四周、二月,分五个时间段随机处死5只动物,取术眼角膜标本,免疫组化法检测角膜植片TGF-β1及IL-1β的变化情况。结果1.实验组角膜植片存活时间比对照组明显延长( P<0.01)。2.术后各组角膜植片各层均出现TGF-β1及IL-1β的表达;实验组不同时间段TGF-β1的表达水平均明显高于对照及自体移植组(P<0.01);实验组在各个时间段中IL-1β的表达水平均明显低于对照及自体移植组(P<0.05)。结论随着植片中TGF-β1表达的增高,IL-1β的表达受到抑制,角膜移植免疫排斥反应的发生率降低,植片的存活时间得到提高。第二部分IL-6, IL-8在大鼠角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究目的研究大鼠穿透性角膜移植后,外周血中IL-6,IL-8表达的变化规律,及TGF-β1对IL-6, IL-8表达的影响,从而探讨两者的相关性及在角膜移植免疫排斥反应中的作用。方法建立SD大鼠(受体)和Wistar大鼠(供体)同种异体穿透性角膜移植模型,及SD大鼠自体穿透性角膜移植模型。术后每天显微镜观察术眼,判断移植免疫排斥反应的发生;分五个时间段处死老鼠后,取外周血,离心取血清, ELISA法检测实验各组各时间段IL-6, IL-8含量的变化。结果实验组术后不同时间段的外周血IL-6, IL-8含量较对照组及自体组均明显降低(P<0.01)。结论IL-6, IL-8是启动角膜移植排斥反应的关键因子之一,而TGF-β1可明显降低外周血中IL-6,IL-8的含量,抑制角膜植片中IL-6,IL-8的表达,降低角膜移植免疫排斥反应的发生率,提高植片存活时间。目的研究IL-2在角膜移植免疫排斥反应过程中表达的动态变化规律及TGF-β1对IL-2表达的影响,探讨IL-2在角膜移植免疫排斥反应中发生的作用,及TGF-β1的免疫抑制作用。方法建立SD大鼠(受体)和Wistar大鼠(供体)同种异体穿透性角膜移植模型,及SD大鼠自体穿透性角膜移植模型。术后每天显微镜观察术眼,判断移植免疫排斥反应的发生;术后各组在不同时间段随机处死3只动物,取其角膜标本,采用RT-PCR法检测角膜移植术后不同时期角膜植片中IL-2的表达。结果不同时间段,实验组中IL-2的表达均明显低于对照及自体组(p<0.05)结论IL-2在角膜移植排斥反应中发挥重要的作用,而它们在TGF-β1的作用下,出现明显的降低,从而抑制了免疫排斥反应的发生,提高植片存活时间。
侯勇[5]2015年在《TGF-β1修饰MSC诱导移植胰腺免疫耐受的实验研究》文中研究说明目的通过注射外源性转化生长因子β1(TGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(MSC)予兔胰腺移植(PTA)模型受体,探讨TGF-β1修饰MSC能否诱导移植胰腺免疫耐受。材料和方法1.采用健康幼龄日本大耳白兔24只,随机抽出12只作单独胰腺移植(PTA)的供体,余12只制作糖尿病模型,模型成功后成为PTA的受体。将受体分成(A、B、C、D)组,给予不同处理,A组：受体胰腺移植前5天给予MSC静脉输注,B组：受体胰腺移植前5天给予TGF-β1转染MSC静脉输注,C组：受体胰腺移植前5天只给TGF-β1,D组：空白组,受体胰移植前不行干预。2.对供体进行分离、灌注、切取、修剪供体胰腺；分离受体一侧肾后,阻断肾动静脉,用袖套法完成供体门静脉与受体肾静脉的吻合,用缝合法完成腹腔干动脉与肾动脉吻合,输尿管和胰管置管行膀胱内引流。3.对术后受体进行处理,取各组移植兔术后不同时间的静脉血及尿液来测定内外分泌功能,并对术后死亡兔子进行病理检查分析。4.对术后受体进行处理,取各组移植兔术后第1、3天共2个时间段静脉血,应用流式细胞仪检测CD4+T细胞和CD8+T细胞百分率,并计算其比值及CD4+CD25+Treg细胞的比例。结果1. 12只供体顺利完成胰腺切取术,12只受体成功制作糖尿病模型并顺利完成胰腺移植术；供体胰腺移植后迅速恢复血液循环,无出血及漏血；术后1例死于静脉血栓形成,实验组的9只受体术后平均生存期(8.0±0.7)d,对照组的3只受体术后平均生存期(7.0±0.2)d,成功建立兔胰腺移植模型。2.术后实验组胰腺内外分泌功能在存活期间比对照组好,差异有统计学意义(P<0.05),病理检查结果显示明显比对照组排斥反应低。3.术后MSC组(n=3)比未干预组(n=3) CD4+T细胞数和CD4+CD25+Treg细胞数比例高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.术后TGF-β1转染MSC组(n=3)比未干预组(n=3) CD4+T细胞数和CD4+CD25+Treg细胞数比例低,差异有统计学意义(P<0.05)。5.术后TGF-β1组(n=3)比未干预组(n=3) CD4+T细胞数和CD4+CD25+Treg细胞数比例高,差异有统计学意义(P<0.05)。6.术后TGF-β1转染MSC组(n=3)比MSC组(n=3)、TGF-β1组(n=3) CD4+T细胞数和CD4+CD25+Treg细胞数比例高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论TGF-β1转染MSC能够调节动物胰腺移植免疫反应,可减轻排斥反应,较单独使用MSC或TGF-β1免疫效果明显。
马慧香[6]2005年在《TGF-β_1基因修饰后板层人工生物角膜的免疫学研究》文中指出角膜病是主要的致盲性眼病之一,我国约有350万角膜病患者,居世界首位,同种异体角膜移植是角膜盲复明的主要手段。在无血管床进行角膜移植具有较高的成功率,排斥反应发生率仅为5～10%,但在高危患者(如:角膜化学伤和Stevens-Johnson综合征所致的角膜严重血管化,其他器官移植术后再行角膜移植,偏中心移植,大植片移植和二次移植等)其发生率可高达50%以上,此外供体材料来源匮乏也严重制约了该手术的开展和普及。因此,降低移植术后的排斥反应和寻找新的角膜供体材料成为眼科界研究的两大热点问题。 应用免疫抑制剂是目前预防和治疗角膜移植术后免疫排斥反应的主要手段,常用药物有皮质类固醇、环孢霉素A(Cyclosporin A,CsA)、FK506等,这些药物的联合使用能够有效地抑制排斥反应,但长期使用对机体有很大的毒副作用。故而,开发探索新型强效免疫抑制剂是提高异体或异种角膜移植手术成功率的有效途径。转化生长因子β_1(Transforming growth factor-β_1,TGF-β_1)作为一种比CsA活性更高的免疫抑制剂(Ruegemer等报道),越来越引起人们的关注。TGFβ_1是多肽类细胞因子,广泛参与免疫系统各细胞、因子间的相互调节,可抑制胸腺细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞等的增殖分化,干扰多种免疫球蛋白的产生和转换,并通过直接、间接影响IL-1、IL-2、IFN-γ及其受体而起以“负调节”为主的免疫平衡作用。近来,TG-β_1,作为一种强效免疫抑制因子己被用于器官移植对抗免疫排斥反应、诱导移植物局部的免疫耐受,在小鼠和大鼠同种异体心脏移植及胰岛细胞移植模型中应用TGF-β_1均能明显延长移植物存活时间,取
李霞, 高晓唯, 任兵[7]2007年在《TGF-β与角膜移植诱导的免疫耐受》文中指出角膜移植术后免疫排斥反应是角膜移植失败的主要原因。如何诱导免疫耐受是角膜移植成功的关键。许多研究表明,TGF(转化生长因子)-β不仅与角膜移植免疫耐受有密切关系,而且在其它器官移植免疫耐受中也发挥重要作用。本文就TGF-β的生物学特性及其角膜移植中TGF-β的作用作一综述。
李婧[8]2013年在《转化生长因子β1对犬穿透性角膜移植后免疫排斥的影响》文中进行了进一步梳理目的：通过探究TGF-β1在犬穿透性角膜移植术(PKP)后在角膜中的表达变化规律并运用TGF-β1蛋白滴眼液点眼,来探索TGF-β1对角膜免疫排斥反应的影响。方法：(1)选取22只本地杂交犬随机分为2组,分别为生理盐水点眼组和供体组,每组9只,余下3只备用。PKP术后试验犬每日生理盐水点眼4次,每次点2滴。每日裂隙灯观察,根据Larkin评分标准记录免疫排斥反应发生时间。(2)选取35只本地杂交犬随机分为2组,分别为生理盐水点眼组,供体组,每组15只,余下5只备用。在生理盐水点眼组试验犬PKP术后1d,3d,7d和14d使用RT-PCR方法测量角膜中TGF-β1的表达量变化。(3)选取59只本地杂交犬随机分为3组,分别为TGF-131点眼组,生理盐水点眼组,供体组,每组18只,余下5只备用。TGF-β1点眼组于PKP术后每日点4次TGF-β1蛋白浓度为50p1/ml的滴眼液,每日3次,生理盐水组以相同点眼方式点眼生理盐水,根据Larkin评分标准记录免疫排斥反应发生时间,并于术后3d,7d和14d,取角膜组织制作HE染色切片。试验结果：(1)生理盐水试验组在角膜移植术后的第5d发生2例排斥反应,术后第6d发生3例排斥反应,术后第7d发生3例排斥反应,术后8d发生1例排斥反应,角膜植片免疫排斥反应的平均时间为6.7±1.3天。(2) RT-PCR得到的数据处理采用相对定量的△△ACt法,根据各个基因的标准曲线,通过测试样的CT值得到相对应的数据,以此比较。TGF-β1表达量在术后1d为2.4倍,,术后3d为2.9倍,此时的表达量为整个检测时间点中的最高峰值。TGF-β1表达量在术后3d以后呈现递减的趋势,术后7d为0.75倍,直到术后14d为最低值0.5倍。(3)在TGF-β1液滴定术眼试验中,用生理盐水滴眼的对照组,在角膜移植术后的5d发生两例排斥反应,术后6d发生4例排斥反应,术后7d发生5例排斥反应,术后8d发生3例排斥反应,最后两例于术后第9d发生。使用TGF-β1蛋白滴眼液的实验组于角膜移植术后11d发生第一例排斥反应,术后12d发生一例排斥反应,术后13d发生3例排斥反应,术后14d发生5例排斥反应,术后15d发生3例排斥反应,术后17d发生一例排斥反应,最后一例排斥反应发生于术后19d。TGF-β1蛋白滴眼液点眼的试验组的角膜植片存活的平均时间为13±2.1d,使用生理盐水点眼的对照组的角膜移植片存活平均时间为7±1.3d,试验组角膜植片的存活时间很显着的长于对照组,差异显着(P<0.01)。(4)使用裂隙灯对穿透性角膜移植术后的植片进行临床观察并拍照记录,PKP术后3d观察角膜植片,生理盐水对照组的植片出现轻度的角膜水肿,裂隙灯光能透射前房,TGF-β1蛋白滴眼液点眼试验组的植片均呈现比较好的透明度,植片周围的植床呈现轻度的角膜水肿,裂隙灯光能透射前房。两组均未发生免疫排斥反应。PKP术后7d观察角膜植片,生理盐水对照组的植片有11例已经完全失去透明度,角膜严重增厚,植片周围有新生血管爬行。TGF-β1蛋白滴眼液试验组的角膜植片呈现中度水肿,裂隙灯光部分能透射前房,缝合处有少量新生血管爬行,试验组尚未发现免疫排斥反应的发生。PKP术后14d,生理盐水对照组所有植片重度水肿,植片完全失去透明度。TGF-β1蛋白滴眼液试验组的植片有10例发生免疫排斥反应,裂隙灯光无法穿透前房,瞳孔尚可见,角膜重度水肿。生理盐水对照组术后3d的组织切片观察可见,内皮层有部分缺失,基质胶原细胞排列有序,基质层轻度水肿,上皮层略有损伤。术后7d的组织切片观察可见,内皮层脱落,基质层中度水肿,上皮层部分缺失或脱离基质层。术后14d的组织切片观察可见,内皮层完全脱落,后弹力层部分缺失,上皮层部分缺失,基质层严重水肿；TGF-β1试验组术后3d的组织切片观察可见,角膜上皮细胞完成,排列有序,基质层无明显水肿,内皮细胞完整。术后7d,内皮细胞仍然附着于后弹力层但内皮细胞数量减少,上皮层完成,上皮细胞排列有序。术后14d,内皮细胞脱落,基质层中度水肿,上皮细胞完整。结论：(1)TGF-β1作为滴眼液能有效抑制免疫排斥反应。(2)TGF-β1的低表达与免疫排斥反应的发生有关
田丽华[9]2012年在《外源性IL-10转染大鼠DC细胞诱导角膜移植免疫耐受的研究》文中认为目的1、研究IL-10基因修饰后的大鼠树突状细胞（DC）的表型及其生物学特性。2、建立大鼠穿透性角膜移植模型，探讨外源性IL-10转染的大鼠树突状细胞在诱导同种异体角膜移植免疫耐受中的作用。方法1、以含IL-10基因的重组腺病毒载体体外转染大鼠骨髓来源的DC，实验分3组，培养6天的DC加入IL-10-GFP-Adenovirus转染48h后，继续培养至第12天，记做IL-10-GFP-DC组；培养6天的DC加入GFP-Adenovirus转染48h后，继续培养至第12天，记做GFP-DC组；不加任何处理，继续培养至第12天，记做12-DC组。Western blot测定转染后各组DC中IL-10蛋白的表达，流式细胞仪检测各组DC表面抗原CD83、CD86分子的表达情况，混合淋巴细胞反应法测定各组DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。2、动物实验分5组，阴性对照组：受体SD大鼠6只，未做任何处理。余4组以SD大鼠为受体、Wistar大鼠为供体建立同种异体角膜移植模型，每组20只，分别为：阳性对照组：术前3天受体大鼠尾静脉注射等量PBS；GFP-DC组：术前3天受体大鼠尾静脉注射2×106个转染48hGFP-Adenovirus的DC细胞；8-DC组：术前3天受体大鼠尾静脉注射2×106个培养8天的DC细胞；IL-10-GFP-DC组：术前3天受体大鼠尾静脉注射2×106个转染IL-10-GFP-Adenovir-us48h的DC细胞。每日观察角膜植片的状态，记录植片的生存时间，组织病理切片HE染色观察角膜植片的病理变化，RT-PCR方法检测各组术眼角膜细胞因子IL-10、TGF-β及IL-2的变化，ELISA方法检测各组术眼房水中细胞因子IL-4、IFN-γ的变化。结果1、IL-10基因修饰组DC可检测到IL-10高表达，表面抗原CD83、CD86低表达，其刺激T淋巴细胞增殖水平较其他各组低，差异具有统计学意义。GFP-DC组与12-DC组细胞表型及功能无差异。2、IL-10-GFP-DC组角膜植片的存活时间显着延长，HE染色示植片的水肿、炎性细胞浸润的程度轻，RT-PCR及ELISA方法检测IL-10-GFP-DC组细胞因子IL-10、TGF-β、 IL-4表达较其他各组高，而IL-2、IFN-γ的表达较其他各组低，差异具有统计学意义。结论1、转染IL-10基因可抑制树突状细胞的成熟，为研究未成熟DC诱导同种异体移植免疫耐受奠定了基础。2、IL-10基因修饰的未成熟树突状细胞能抑制角膜移植排斥反应，诱导免疫耐受的形成，延长角膜植片的存活时间。其中Th1/Th2偏离及TGF-β的高表达是诱导角膜移植免疫耐受的机制之一。
李宝柱[10]2017年在《IL-35基因修饰间充质干细胞抑制小鼠心脏移植排斥反应的研究》文中认为研究目的本实验研究白细胞介素35(Interleukin 35,IL-35)基因修饰的间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)对同种异体小鼠心脏移植排斥反应的影响及其作用机制,探索出有效减轻移植术后排斥反应、诱导免疫耐受的新途径。研究方法1、利用Ⅰ型胶原酶消化法获取小鼠脂肪来源的间充质干细胞(adipose tissue-derived MSCs,ad-MSCs),应用流式细胞术(FCM)进行表型鉴定。2、体外以过表达IL-35慢病毒颗粒感染小鼠脂肪间充质干细胞,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清中IL-35表达情况,成功获得IL-35基因修饰的MSCs(IL-35-MSCs)。3、建立小鼠异位腹腔心脏移植模型,设置IL-35-MSCs实验组、MSCs处理组、生理盐水对照组、同系对照组。观察各组移植心脏存活时间,评估术后5天移植物急性排斥反应病理分级;蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)法检测移植心脏IL-17表达水平;ELISA法检测术后5天各组外周血IL-35浓度;采用流式细胞术检测术后5天各组小鼠体内T细胞亚群变化。研究结果1、小鼠脂肪来源的间充质干细胞成功获取,过表达IL-35慢病毒载体成功感染间充质干细胞,感染后细胞上清IL-35浓度达到265.8±16.650 pg/ml。2、成功构建小鼠异位腹腔心脏移植模型,与异系生理盐水对照组(6.17±0.753d)相比较:MSCs处理组(10.67±1.211d)及IL-35-MSCs实验组(14.5±1.049d)移植心脏平均存活时间明显延长(P<0.01);术后5天移植物急性排斥反应病理分级较对照组明显降低(P<0.01)。3、ELISA法结果显示IL-35-MSCs实验组小鼠体内IL-35稳定表达,浓度达60.71±5.38 pg/ml。4、与对照组相比,MSCs处理组及IL-35-MSCs实验组术后5天外周血和脾脏Th1/Th2、Th17比例均明显降低(P<0.01),脾脏CD4+CD25+T细胞比例明显增高(P<0.01)。5、Western Blot检测结果显示MSCs处理组及IL-35-MSCs实验组移植物IL-17蛋白表达水平较生理盐水对照组明显降低。研究结论1、过表达IL-35的慢病毒能够成功、高效率感染小鼠来源的ad-MSCs;在体内外实验中,IL-35-MSCs均能够持续、有效表达IL-35。2、小鼠异位腹腔心脏移植模型是研究器官移植排斥反应的理想动物模型。IL-35-MSCs对同种异系小鼠心脏移植有抗排斥作用,其机制可能为IL-35及MSCs产生免疫调控协同作用,刺激CD4+CD25+Treg的生成,诱导小鼠体内Th1/Th2平衡偏移、降低Th17细胞比例,延长心脏存活时间。IL-35-MSCs细胞免疫疗法可能成为有效诱导移植免疫耐受的新途径。
参考文献：
[1]. 转化生长因子-β_1诱导角膜移植免疫耐受和抑制的研究[D]. 胡琦. 暨南大学. 2002
[2]. TGF-beta DC诱导调节性T细胞在角膜移植排斥反应中作用的实验研究[D]. 闫峰. 第四军医大学. 2007
[3]. 小鼠角膜基质细胞的间充质干细胞样表型和多向分化潜能以及抑制树突状细胞成熟的功能[D]. 卢建民. 河北医科大学. 2011
[4]. 转化生长因子β1对大鼠穿透性角膜移植后白介素的影响[D]. 杨洋. 重庆医科大学. 2007
[5]. TGF-β1修饰MSC诱导移植胰腺免疫耐受的实验研究[D]. 侯勇. 昆明医科大学. 2015
[6]. TGF-β_1基因修饰后板层人工生物角膜的免疫学研究[D]. 马慧香. 暨南大学. 2005
[7]. TGF-β与角膜移植诱导的免疫耐受[J]. 李霞, 高晓唯, 任兵. 国际眼科杂志. 2007
[8]. 转化生长因子β1对犬穿透性角膜移植后免疫排斥的影响[D]. 李婧. 西南大学. 2013
[9]. 外源性IL-10转染大鼠DC细胞诱导角膜移植免疫耐受的研究[D]. 田丽华. 辽宁医学院. 2012
[10]. IL-35基因修饰间充质干细胞抑制小鼠心脏移植排斥反应的研究[D]. 李宝柱. 天津医科大学. 2017
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