张聚良[1]2003年在《血管内皮生长因子变异体基因的构建、表达及表达产物体内诱导自身抗体产生的研究》文中研究表明血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 最早是由体外培养的肿瘤细胞无血清培养基中分离出来的，最初发现它能提高血管的通透性，命名为血管通透性因子(vascular 穷日早巨大学棋士学位征文permeability factor，pF）。进一步发现，VPP能选择性地促进血管内皮细胞（。ndothelialcell，EC）分裂，遂命名为血管内皮生长因子。VEGF是一个大的家族，包括 VEGFtt，VEGF－B，VEGF－C，VEGF－D－D和胎盘生长因子（placenta rowth factor，PIGF）等，通常所说的VEGF即指VEGF－A。VEGF的基因位于染色体6PZI．3，全长28kb，编码VEGF的基因长 14kb，由 8个外显子和 7个内含子组成，VEGF的CDNA分析提示VEGF蛋白编码存在多样性，8个外显子进行不同的拼剪产生不同的VEGF表现形式。目前，至少存在5种不同的VEGF分子：VEGF；。；，VEGF；4。，VEGF；。，VEGF；ss和VEGFZ。VEGF；。。由外显子l～5、7和8编码，可分泌至细胞外间质，但也有相当一部分蛋白质结合于细胞表面或细胞外基质，在体内丰度最高，目前应用也最广泛。VEGF由两个亚基形成的同源糖蛋白H聚体，分子量约为45kD．在每个单体中，N端起始部为由16－24位氨基酸形成的一个口螺旋，中间由4股 p片层结构组成，包括 pl（27－34）、i 3（51－58）、p 5（73－83）和 p 6（89－99），其中一端形成脱氨酸结，以一个亚基的第 51位半脱氨酸和另一个亚基的第60位半脱氨酸组成2条二硫键，连接而形成二聚体。在还原条件下，二聚体分开形成单体，并丧失所有的生物活性。VEGF有两个主要的高亲和力受体：Fit－1和KDR，尽管＊l的亲和力高于＊R，但几乎所有的促巩活性都是由mR实现的。VEGF是目前公认的高选择性的EC有丝分裂原，研究表明，VEGF的表达与组织中的微血管密度密切相关，在体外VEGF可促进EC增殖、移行，体内可诱导血管生成。业已证实，在几乎所有肿瘤组织中，都有VEGF的高表达。VEGF的表达与肿瘤的恶性程度、进展、转移及预后呈显着相关性。因此，以血管生成的各个环节为靶点，通过血管生成抑制 7 Bio’emnowm， Ct FMMU 京日早巨大学低士学位征文剂来控制肿瘤生长和转移，成为肿瘤防治的一个重要途径。由于血管生成抑制剂直接作用于增殖的EC，因此抗瘤谱广，也不会造成骨髓抑制、胃肠道反应或脱发等传统化疗药物造成的毒副反应。而且，EC作为新生血管的前体，其遗传性状稳定，很少发生变异，不易产生耐药性。大量实验已经证实，在裸鼠肿瘤模型中，应用VEGF抗体阻断其促血管生成作用后，可以显着抑制原发肿瘤的生长和转移。但由于外源性抗体成本较高，不适宜大规模生产，而且抗体本身的免疫原性也会导致自体排斥反应，影响远期疗效，限制了其进一步应用。 基于这些研究，我们设计了人VEGF；6；的一种变异体，在VEGF；。的核基末端引入了辅助性T淋巴细胞的抗原表位序列，同时，为了使此变异体失去促血管生成的活性，我们参考VEGF；。与受体结合的位点，去掉了 VEGF；。s氨基端的 16位氨基酸。我们将此变异体基因定向克隆入表达载体 PRSET B中，转化大肠杆菌 BLZI（DE3）菌株，得到了高效表达。在此基础上，对BALB／C小鼠进行了主动免疫，并接种腹水瘤细胞 SI 80，建立肿瘤模型，抑瘤实验表明：VEGF；。；变异体可以诱导产生高浓度自身抗体，抑瘤率达到64．7％，与对照组相比，有明显差异（P＜0．of）。 我们的研究表明，构建的VEGF；。；变异体，失去了促血管生成的活性，但体内可以诱导产生自身抗体，抑制肿瘤的生长，为肿瘤的抗血管生成治疗提供了新的手段。
阳志军[2]2008年在《卵巢上皮癌相关抗原的筛选、鉴定、血清学检测及抗原基因生物学功能的初步研究》文中指出卵巢癌是严重危胁女性生命健康的恶性肿瘤,具有起病隐藏、复发死亡率高的特点。因早期缺乏典型临床症状,75%患者确诊时已是晚期,这些患者的5年生存率也从临床Ⅰ期患者的95%下降到约20～25%,因此早期诊断对于提高生存率、改善患者预后具有重要的意义。然而,目前仍缺乏有效的早期诊断方法,没有能有效用于卵巢癌早期诊断的标志物。SEREX技术的建立不仅为肿瘤抗原的筛选提供了一种新的方法,而且通过对肿瘤抗原自身抗体的检测为肿瘤的诊断提供了新的血清标志物。目前对肿瘤抗原自身抗体的研究主要集中在IgG型抗体,对于IgM型抗体的报导很少。本研究在已有的研究基础上,用SMARTA法对从卵巢浆液性囊腺癌腹水肿瘤cDNA表达文库中筛选出10个抗原克隆进行血清学检测,对其中6个(TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142、FXR1、OV-189)在卵巢癌血清中阳性率明显高于正常对照血清的抗原克隆进行测序分析;用RT-PCR法检测它们在卵巢癌组织中的表达情况;构建、表达、纯化了原核重组融合蛋白;建立了间接ELISA法,检测了血清中这些抗原IgG、IgM型自身抗体的相对含量,分析了这些卵巢肿瘤相关抗原自身抗体(谱)在卵巢癌诊断及预后中的作用;并对其中一个相关抗原基因FXR1在卵巢癌细胞中的生物学功能进行了初步研究。第一部分卵巢上皮癌相关抗原异体血清筛选及生物学信息分析目的:检测候选卵巢上皮癌相关抗原克隆与卵巢癌、正常对照血清中相应IgG、IgM型自身抗体反应情况,并对阳性反应率差异显着的抗原克隆进行测序及生物信息学分析。方法:用SMARTA法对10个候选卵巢上皮癌相关抗原克隆与62例卵巢癌、62例正常对照血清中IgG、IgM型自身抗体反应情况进行定性检测,从中选出在癌血清中抗体阳性反应率与正常对照血清相比差异显着的抗原克隆,进行核苷酸测序,在相关网站上进行生物信息学分析。结果:其中6个抗原克隆与卵巢癌血清中自身抗体阳性反应率显着高于正常对照血清,在癌血清中的阳性率为12.9%～27.4%,在正常血清中的阳性率为1.6%～11.3%,其中IgM型自身抗体的阳性率为19.4%～27.4%。对这6个抗原克隆进行核苷酸测序,经比对分析发现这6个抗原克隆其中4个是已知基因(TM4SF1、C1D、TIZ、FXR1),一个是与卵巢癌相关基因高度相似的基因(OV-142),一个是Genbank中无相似序列的新基因(OV-189)。TM4SF1蛋白是一种有四个疏水跨膜区的细胞表面蛋白,该蛋白在对调节细胞生长、活化、迁移的信号转换中起媒介作用,在肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢上皮性癌等上皮细胞恶性肿瘤中高表达,是一种细胞表面抗原,可作为抗体免疫治疗的靶向。C1D基因编码的是一个保守的DNA绑定蛋白,C1D蛋白是一个隐藏的凋亡激活剂,是多发性肌炎硬皮病重迭综合征的自身抗原。FXR1蛋白是一种RNA绑定蛋白,可在在核与胞浆间穿梭,与多聚核糖体有关,具有细胞生长依赖的翻译活性功能,有可能是硬皮病的一种自身抗原,并且在肺鳞状细胞癌中检测到FXR1基因的过表达。TIZ是一个锌指蛋白,通过调节肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的信号活性,在破骨细胞分化过程中起一定作用。尚未见有C1D、TIZ、FXR1与卵巢癌相关的报导。其中OV-142有可能是BARD1基因的剪切变异体,可能有MHC-Ⅰ类抗原表位肽,可能成为卵巢癌免疫治疗的新靶点。初步认为OV-189是LINE中有转录活性的一种—L1家族中的一个新成员,可能有MHC-Ⅰ类抗原表位肽,有可能成为卵巢癌免疫治疗的靶点。结论:我们的研究显示卵巢上皮癌相关抗原不仅能够介导IgG体液免疫反应而且能够诱导机体产生特异性的IgM自身抗体,这些抗原克隆在异体癌血清中较高的抗体阳性反应率,提示这些抗原的自身抗体有可能成为卵巢癌诊断的血清标志物。这些抗原基因有进一步研究的价值。第二部分RT-PCR检测卵巢上皮癌相关抗原基因在卵巢癌组织中的相对表达水平目的:检测卵巢上皮癌相关抗原基因在卵巢癌、良性卵巢肿瘤、正常卵巢组织中的相对表达水平。方法:用RT-PCR方法检测上述6个卵巢上皮癌相关抗原基因在36例卵巢癌、15例良性卵巢肿瘤及13例正常卵巢组织中的相对表达水平。结果:这6个抗原基因在癌、良性肿瘤、正常卵巢组织中几乎都有表达,只是在癌组织中的表达水平明显高于良性肿瘤及正常卵巢组织。显示出叁种表达趋势:一类是癌组织中的表达水平显着高于正常卵巢组织,而良性肿瘤组织中的表达水平高于正常组织,癌组织中的表达水平稍高于良性肿瘤组织(TIZ、C1D、TM4SF1、OV-142);一类是癌组织中的表达水平显着高于良性肿瘤及正常卵巢组织,而良性与正常组织中表达相当(OV-189);一类是癌组织中的表达水平明显高于良性,癌与良性肿瘤组织中的表达水平均显着高于正常组织,且晚期癌组织中表达水平显着高于早期,分化差的组织表达水平显着高于分化好的(FXR1)。结论:我们在mRNA水平证实这6个卵巢上皮癌SEREX抗原基因均与癌组织有很好的相关性。第叁部分卵巢上皮癌相关抗原蛋白的表达、纯化目的:在原核表达系统中构建、表达、纯化这6个抗原蛋白。方法:用RT-PCR克隆这些抗原基因的CDS,在pET-30b(+)系统中构建原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达重组融合蛋白,采用Ni-NTA His-Bind Resins和SDS-PAGE制备胶电洗脱进行纯化,复性、浓缩得到有活性的目的蛋白。结论:成功构建、表达、纯化了这6个抗原蛋白,得到浓度在0.3～0.8mg/ml之间,纯度都在90%以上、有活性的重组融合抗原蛋白。第四部分卵巢癌上皮癌相关抗原自身抗体谱的研究目的:用自己制备的抗原蛋白建立间接ELISA法,检测这些卵巢上皮癌相关抗原在血清中相应自身抗体的相对含量,并分析它们的临床价值。方法:建立间接ELISA法,检测126例治疗前、24例治疗后卵巢癌、42例良性卵巢肿瘤、20例乳腺癌、20例食管癌、20例肺癌癌患者、142例正常女性对照血清中卵巢上皮癌相关抗原IgG、IgM型自身抗体的相对含量。绘制ROC曲线,确定cut off值,单独或用Logistic回归分析法联合分析这些自身抗体/抗体谱的临床价值。同时测量CA125的含量,比较自身抗体谱与CA125在卵巢癌诊断上的效能。结果:分析单个自身抗体时,卵巢癌血清中这些抗原IgG型自身抗体反应的阳性率为34.1%～47.6%,非癌患者的阳性率为13.0%～17.9%;癌血清中IgM型自身抗体反应的阳性率为39.7%～53.2%,非癌患者的阳性率为12.0%～33.2%,分析单个卵巢癌相关抗原自身抗体在卵巢癌诊断时意义均不大,但TIZ、FXR1、OV-189抗原IgM型自身抗体在早期病人中的阳性率均高于晚期病人,两者相比较差异有统计学意义。当联合多个自身抗体(抗体谱):TM4SF1 IgG、C1D IgG、TIZ IgG、TIZ IgM、FXR1 IgG、FXR1 IgM分析时敏感为75.4%,特异性为78.2%,准确性为76.5%,与单独分析CA125相比较敏感性明显提高(61.1%),特异性降低(89.1%),准确性相当(77.7%),但该自身抗体谱在早期(76.6%versus 51.1%)尤其是Ⅰ期(83.3%versus 44.4%)卵巢癌诊断的敏感性显着高于CA125,差异有统计学意义。将多个卵巢癌相关抗原自身抗体(TM4SF1 IgG、TM4SF1 IgM、C1D IgG、TIZ IgM、FXR1 IgG)与CA125联合分析时,诊断卵巢癌的敏感性为86%,特异性为91%,准确率为88.7%,与CA125相比,在敏感性、特异性、准确性均提高,阳性预测值、阳性似然比、阴性预测值明显提高,阴性似然明显降低;并且与CA125联合后在上皮性癌(包括浆液、粘液性癌)的诊断敏感性显着高于CA125,统计学上差异有显着性;同时对于早期、晚期卵巢癌的诊断敏感性亦显着高于CA125,统计学上差异有显着性。比较了配对的24例卵巢癌患者治疗前后卵巢癌自身抗体谱变化情况,结果显示治疗后自身抗体谱的阳性率显着低于治疗前。乳腺癌、食管癌、肺癌血清的检测,结果发现卵巢癌自身抗体谱的阳性率分别为30%、20%、25%。结论:卵巢癌患者血清中存在IgG型、IgM型肿瘤自身抗体,并且可用于卵巢癌早期诊断。联合多个卵巢癌肿瘤自身抗体可达到与CA125相当的诊断效果,且该自身抗体谱在早期特别是Ⅰ期卵巢癌的诊断上优于CA125。将多个自身抗体与CA125联合可显着提高卵巢癌的诊断效能。卵巢上皮癌相关抗原自身抗体谱对疗效也有一定的监测作用。第五部分真核转染上调FXR1基因表达对卵巢癌细胞生物学行为影响的初步研究目的:了解上调FXR1基因表达对卵巢癌细胞系H08910生物学行为的影响。方法:RT-PCR扩增FXR1 CDS,构建FXR1真核表达载体,脂质体介导下转染H08910细胞,经G418筛选获得稳定转染株,检测转染后细胞相应生物学行为。结果:成功构建了FXR1基因的真核表达载体,并稳定转染了H08910细胞。生长曲线显示上调FXR1基因表达可促进细胞的生长;克隆形成实验显示上调FXR1基因表达可促进细胞增殖,基质粘附实验显示上调FXR1基因表达可加强细胞对基质的粘附能力,流式细胞周期检测亦发现与对照(80%)相比,转染FXR1基因后G1期细胞(67.1%)比例明显减少,这说明转染FXR1后细胞的增殖更旺盛。同时发现FXR1对细胞侵袭、迁移的能力无明显影响。凋亡检测虽提示转染FXR1基因后早期凋亡细胞的比例较对照增多,但总的凋亡细胞比例太少仅0.31%,意义可能不大。结论:真核载体稳定转染技术是一种可靠、行之有效的研究基因功能的方法。上调FXR1基因表达可能有促进卵巢癌细胞的生长、增殖、加强细胞对基质粘附能力的作用。第六部分RNA干扰FXR1基因对卵巢癌细胞系生物学行业影响的初步研究目的:了解抑制FXR1基因表达对卵巢癌细胞系A2780生物学行为的影响。方法:设计、合成、筛选有效的FXR1基因siRNA,将有效siRNA商业化构建siRNA表达载体,脂质体介导下转染A2780细胞,经G418筛选获得稳定转染株,检测转染后细胞相应生物学行为。结果:设计并成功筛选出了抑制效率达80%的FXR1基因siRNA,将商业构建的siRNA表达载体成功稳定转染了A2780细胞,抑制效率约60%。细胞生长曲线显示出下调FXR1表达可轻度抑制细胞的生长;克隆形成实验结果显示,下调FXR1基因的表达对A2780细胞的增殖能力有的抑制作用;流式细胞周期分析发现下调FXR1基因的表达G1期细胞比例为49.2%多于转染阴性对照组(40%),S期与G2期比对照比例稍少,提示抑制FXR1基因的表达可延缓细胞增殖;同时发现下调FXR1基因的表达对A2780细胞体外侵袭、迁移能力、基质粘附能力及凋亡无明显影响。结论:RNAi技术是一种强有力的研究基因功能的方法。抑制FXR1基因的表达可轻度抑制A2780细胞的生长、明显抑制细胞增殖。
赵冰冰[3]2009年在《TIZ与卵巢癌关系的基因水平研究》文中进行了进一步梳理卵巢癌是严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤,死亡率在女性生殖道恶性肿瘤中居首位,并有上升趋势。因卵巢生理解剖位置处于盆腔深部,早期卵巢癌患者缺乏典型的临床症状,大部分卵巢癌患者发现时病变已发展到晚期。因此在分子生物学水平研究卵巢癌变机理及恶性生物学行为,寻找早期诊断方法,探索有效的治疗手段,对于改善患者的预后,提高的生存率,降低死亡率有重要意义。本实验室前期应用SEREX技术从血清中筛选出卵巢癌相关抗原TIZ,TIZ蛋白在卵巢癌患者血清表达升高,TIZ蛋白联合其它血清标志物有助于提高诊断的敏感性和特异性。为了从基因水平进一步了解TIZ与卵巢癌的关系,本实验通过RT-PCR方法检测不同卵巢组织里TIZ基因的表达情况、构建TIZ基因真核表达载体及RNA干扰等实验,研究TIZ与卵巢癌的关系及TIZ对卵巢癌细胞系生物学功能的影响。卵巢恶性肿瘤组织中TIZ mRNA的表达及其临床价值目的:探讨TIZ基因在卵巢恶性肿瘤组织中的表达及其临床意义。方法:采用RT-PCR技术检测48例卵巢恶性肿瘤、22例卵巢良性肿瘤及24例正常卵巢组织TIZ mRNA的表达情况,分析TIZ基因与卵巢癌的关系。结果:(1)TIZ mRNA在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织、卵巢恶性肿瘤组织中均有表达。TIZ mRNA在卵巢恶性肿瘤组织中的表达较正常卵巢组织低(p＜0.05),TIZ mRNA在卵巢恶性肿瘤组织中的表达较卵巢良性肿瘤组织低(p＜0.05);(2)TIZ基因表达与卵巢癌患者组织学类型,病理分级等临床病理特征及预后无关(p＞0.05)。结论:TIZ mRNA在卵巢恶性肿瘤组织中表达降低。TIZ基因与抑癌基因作用相同,有抑制卵巢癌的发生的作用。TIZ基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建目的:通过基因工程技术,扩增出TIZ基因全长,构建其真核表达载体。为进一步研究TIZ与卵巢癌的关系打下基础。方法:选取浆液性卵巢癌组织作为模板,提取人卵巢癌组织总mRNA,利用PCR技术进行TIZ基因全长的扩增。将其与真核表达载体pcDNA3.1连接,将连接载体进行酶切和测序鉴定。结果:成功扩增出TIZ基因全长,并经测序验证其同源性达99%,测序结果显示第1551位的T突变成C,但其编码氨基酸并不改变,属无意义突变,可以用于后续实验研究。结论:成功从恶性卵巢癌组织中扩增出TIZ基因全长并构建了其真核表达载体pcDNA3.1-TIZ。真核转染TIZ基因对卵巢癌细胞系生物学行为影响的研究目的:了解TIZ基因对卵巢癌细胞生物学功能的影响,分析TIZ在卵巢癌发生发展过程中所起的作用;探索其作为早期诊断、治疗靶向的价值。方法:成功构建TIZ基因真核表达载体后,将其转染入无TIZ基因表达的卵巢癌细胞株HO8910,G418筛选后经RT-PCR鉴定,确认获得稳定转染的HO8910/pcDNA3.1-TIZ细胞株。然后进行细胞生长特性、细胞周期变化、克隆形成能力、细胞迁移能力、黏附能力、细胞侵袭能力的实验。结果:通过转染筛选,获得能够稳定表达TIZ蛋白的卵巢癌细胞株。生长曲线显示转染了TIZ基因的卵巢癌细胞株生长速度减慢。流式细胞仪对细胞检测结果显示HO8910/pcDNA3.1-TIZ组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为32.6%,G1期为67.4%,对照组则相应为60.7%和39.3%,其处于增殖周期的细胞减少。两组的克隆形成率、迁移能力、黏附能力侵、袭能力差异无统计学意义(p＜0.05)。结论:细胞功能实验结果表明,TIZ能够抑制卵巢癌HO8910细胞的生长能力,对其迁移、侵袭、粘附能力均无影响。RNA干扰TIZ基因对卵巢癌细胞系生物学功能影响的研究目的:通过构建人TIZ基因的shRNA表达载体,转染卵巢癌细胞。继而筛选出稳定干扰的细胞株,进行一系列功能实验。方法:针对TIZ mRNA的不同区域设计叁组不同的siRNA片段,脂质体法转染TIZ高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3,实时荧光定量PCR检验干扰效率,选择干扰效率最高的siRNA片段构建干扰载体。脂质体法转染TIZ基因高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3并进行G418抗性筛选,获得稳转细胞株,RT-PCR检验TIZ基因受抑制情况,然后进行细胞功能实验。结果:用荧光定量PCR对不同siRNA干扰片段的干扰效果进行检测结果显示,TIZ-573组相对拷贝数为0.844±0.756,与其他两组相比差异有统计学意义(p＜0.05)。TIZ-573组抑制率最高,其抑制率为61%。构建干扰载体pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573,转染卵巢癌细胞系SKOV3,获得稳定干扰表达株SKOV3/pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573,RT-PCR检验其TIZ mRNA表达明显减少。生长曲线显示pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573组比对照组的细胞生长快。流式细胞仪对细胞检测结果显示pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为65.1%,G1期为34.9%,对照组则相应为36.6%和63.4%,其处于增殖周期的细胞增加。两组的克隆形成率、迁移能力、黏附能力、侵袭能力差异无统计学意义(p＜0.05)。结论:细胞功能实验结果表明,干扰TIZ表达能够增强卵巢癌细胞SKOV3的生长能力,对其迁移、侵袭、粘附能力均无影响。
李江伟[4]2005年在《食管癌癌前血清分子标志物的研究及应用》文中进行了进一步梳理食管癌在我国居恶性肿瘤发病率和死因的第四位，其五年生存率仅为10％左右。食管癌在我国呈现地域性高发的分布特点，筛查和发现癌前病变病例对于降低食管癌发病率和死亡率具有重要意义。为了筛选分离能用于食管癌癌前病例大规模高危人群筛查血清分子标志物，我们采用改进的SEREX技术，筛选、分离和鉴定了食管癌癌前的相关抗原，并应用蛋白质芯片技术及这些抗原建立了能用于食管癌癌前病变大规模高危人群筛查的血清检测方法。 第一部分 食管癌癌前病变相关抗原的筛选、分离及鉴定 采用食管癌癌前组织构建混合组织cDNA表达文库，原始文库库容达到1×10~6 pfu。使用多例癌前病变异体及食管癌异体混合血清筛选诱导IgM及IgG型自身抗体的食管癌癌前病变相关抗原，结果共获得了75个阳性抗原克隆，代表了30个不同的抗原基因，其中包括26个已知基因和4个功能未知基因。根据其生物学功能可以分为以下5类：1．细胞信号转导分子，2．转录及翻译调节相关基因，3．细胞增殖相关基因，4．蛋白质翻译加工和转运相关基因，5．功能未知的基因。采用SADA法对这30个抗原在食管癌前病变、食管癌及正常人血清中的自身抗体进行检测发现，共有29个抗原在异体食管癌和癌前病变血清中诱导产生了相应的IgM或IgG自身抗体，其中有25个抗原在癌前病变血清中检测到了相应的IgM型自身抗体，阳性率在3％-97％之
焦洋[5]2008年在《趋化素样因子1（CKLF1）在人动脉粥样硬化斑块组织中表达的研究》文中提出[目的]⑴研究人正常动脉和动脉粥样硬化斑块(Atherosclerotic Plaques)组织中趋化素样因子1(Chemokine-like factor 1, CKLF1)mRNA的表达。⑵研究人正常动脉和动脉粥样硬化斑块组织中趋化素样因子1(CKLF1)蛋白水平的表达。[3]明确动脉斑块组织中CKLF1阳性表达细胞类型。[4]比较CKLF1在正常动脉和动脉粥样硬化斑块中表达水平的差异。[方法]应用实时定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR, RT-QPCR)和免疫组织化学染色(immunohistochemistry, IHC)技术,分别回顾性研究24例/17例动脉粥样硬化患者斑块组织和25例/10例正常人体动脉组织中CKLF1 mRNA和蛋白水平表达,观察CKLF1阳性表达细胞,分别比较其在正常动脉和动脉硬化斑块中表达量的差异。[结果]⑴CKLF1mRNA在正常动脉组织中存在基础表达(RQMedian=2.44),在动脉粥样硬化斑块中表达量明显上调(RQMedian=132.17, p<0.05)。⑵CKLF1在正常动脉中阳性表达细胞为平滑肌细胞和内皮细胞,在动脉粥样硬化斑块中阳性表达细胞为平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞。⑶CKLF1在动脉粥样硬化斑块内皮细胞、平滑肌细胞中的表达量明显高于正常动脉内皮细胞和平滑肌细胞(p<0.01)。⑷动脉粥样硬化斑块组织中CKLF1与MCP-1的表达存在正相关性,相关系数r = 0.933(p<0.01)。[结论]⑴人动脉粥样硬化斑块组织中的平滑肌细胞、内皮细胞和单核巨噬细胞是CKLF1表达的主要来源。⑵CKLF1在正常人动脉平滑肌细胞及内皮细胞中存在基础表达,且内皮细胞中CKLF1基础表达量较高。⑶在人动脉粥样硬化斑块平滑肌细胞中CKLF1在mRNA水平和蛋白水平的表达较正常动脉均显着上调,说明CKLF1可能在动脉粥样硬化发病过程中起重要作用。
刘春蓉[6]2011年在《人TSHβ新剪接变体生物学特性探讨》文中认为目的促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone, TSH)是调控甲状腺功能的关键蛋白,TSH由α亚基和p亚基通过非共价键连接组成,p亚基具有激素特异性。2009年Vincent等报道了第一个功能性TSHβ剪接变体,TSHβ新剪接变体在免疫—神经内分泌网络中可能具有不同于天然型TSHβ的调控作用。由于该TSHβ剪接变体是新近才被发现的,所以目前对其基本生物学特性、表达调控机制及与甲状腺相关疾病相关性等均不清楚。本研究拟从上述几个方面对这个TSHβ新剪接变体进行逐步深入的探讨。方法1. TSHβ剪接变体在正常人外周血中的研究：对血清样品进行盐析、透析和浓缩预处理后采用免疫沉淀法鉴定人血清中是否存在TSHβ剪接变体蛋白；运用RT-PCR和Western Blot方法分别从转录和翻译两个水平检测人外周血白细胞(peripheral blood leukocyte, PBL)中TSHβ剪接变体表达情况；制作人PBL涂片,运用免疫荧光染色检测人PBL中TSHβ剪接变体的表达。2.人TSHα与TSHβ剪接变体体外结合验证实验：构建pSELECT-GFPzeo-TSHβ剪接变体和pcDN A3.1D/V5-His-TOPO-TSHα两个重组表达载体,分别转染入CHO细胞系,建立能稳定表达TSHβ剪接变体和TSHα的CHO细胞系,将上述两种CHO细胞系混合培养后,取培养上清,利用免疫共沉淀技术验证人TSHα是否能与TSHβ剪接变体形成二聚体。3.不同病理生理条件对TSHβ剪接变体表达影响：定量PCR检测GD和HT患者PBL中TSHβ剪接变体的表达差异；分离培养人PBL,分别给予致炎因子LPS (10mg/L)、抗炎因子地塞米松(10-6,10-7and10-8M)、TRH (100nM)和T3(100nM)直接刺激,定量PCR技术检测人PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达差异。4.人TSHβ新剪接变体蛋白的原核表达及纯化：采用PET高效大肠杆菌表达系统对人TSHβ剪接变体进行表达并利用免疫亲和层析技术纯化获得重组人TSHβ剪接变体蛋白。结果1.鉴定出人血清中存在TSHβ剪接变体蛋白,正常人PBL仅表达TSHβ剪接变体而不表达天然型TSHβ,免疫荧光染色显示人PBL中有TSHβ剪接变体阳性表达细胞。2.成功构建pSELECT-GFPzeo-TSHβ剪接变体和pcDNA3.1D/V5-His-TOPO-TSHα两个重组表达载体；建立能稳定表达TSHβ剪接变体和TSHα的CHO细胞系；免疫共沉淀技术证实人TSHα能与TSHβ剪接变体形成二聚体。3. TSHβ剪接变体在GD和HT患者PBL中的表达差异：与正常人相比,HT初发患者(未经任何药物治疗)PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达量上调123.33%(n=10,P<0.0001)、发病初期曾使用强的松治疗3个月但病程≥18个月的HT患者PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达量上调76.67%(n=5,P=0.023)而发病初期曾使用强的松治疗3个月,病程≤9个月的HT患者PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达量下调40%(n=8, P<0.0001)。GD初发患者PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达下调(P<0.0001)。人PBL中TSHp剪接变体mRNA表达水平与血清FT3水平负相关(r=-0.635, P<0.001)、KFT4水平负相关(r=-0.760, P<0.0001)、TSH水平正相关(r=0.975,P<0.0001)。4.单次给予致炎因子LPS刺激后,人PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达变化趋势是先增高后下降最后恢复至正常。与正常对照组相比,LPS处理6h组TSHβ剪接变体mRNA表达量增高(P=0.003), LPS处理12h组TSHβ剪接变体mRNA表达量下降(P=0.008),LPS处理24h、48h组TSHβ剪接变体mRNA表达量与正常对照24h、48h组差异无统计学意义。抗炎因子地塞米松抑制TSHβ剪接变体mRNA表达并呈时间浓度依赖性。5.TRH作用人PBL6h时,TSHβ剪接变体mRNA表达量增高(P<0.0001),随后逐渐恢复正常表达水平。T3作用人PBL12h时,TSHβ剪接变体mRNA表达量下降至最低(P=0.043),12h后逐渐恢复正常表达水平。6.成功构建PET-28a-TSHp剪接变体重组表达载体,经IPTG诱导表达,免疫亲和纯化,最后获得了7.4mgTSH(3剪接变体蛋白,纯度大于90%。结论(1) TSHβ剪接变体既可以存在于外周血循环中,以远距分泌(telecrine)方式发挥生物学作用,也可以表达于免疫细胞,以旁分泌(paracrine)的方式发挥调节作用。(2)人TSHα能与TSHβ剪接变体形成二聚体,该研究结果对于证明它的稳定性和是否具有高度生物活性至关重要。(3) TSHβ剪接变体可能参与了HT患者的甲状腺病理损伤。机体在不同状态下,TSHβ剪接变体可能受HPT轴和/或免疫系统调控。(4)纯化获得的TSHβ剪接变体蛋白将为TSHβ剪接变体功能及调控机制的深入研究提供重要的物质基础。
于赫[7]2006年在《树舌多糖GF对小鼠HepA瘤细胞可溶性蛋白质组及核蛋白MDM-2表达的影响》文中认为目的:在对树舌多糖GF的抗肿瘤作用及其机制的研究取得阶段性成果的基础上,对树舌多糖GF作用于小鼠HepA瘤细胞的可溶性蛋白质组及核蛋白MDM-2表达的影响进行研究,旨在蛋白质组水平上为树舌多糖GF寻找新的作用靶点,为其作为抗肿瘤药物的临床应用提供更为充分的理论依据。 方法:昆明种小鼠36只,随机分为3组:正常对照组、肿瘤组和树舌多糖组。肿瘤组和树舌多糖组小鼠接种HepA瘤细胞。接种后各组肌肉注射给药,分别给与生理盐水和树舌多糖GF。连续10天,于末次给药24h,处死小鼠,剥离肿瘤组织。采用免疫组化法检测肝脏和瘤组织的癌基因MDM-2的表达,采用1D-SDS-PAGE和2-DE的方法检测可溶性蛋白的表达,dot blot法和Western blot法检测抑癌基因PTEN的表达。 结果:①在可溶性蛋白的1D-SDS-PAGE中,正常组得到16条条带,肿瘤组得到24条条带,树舌多糖组得到18条条带。与正常组相比,肿瘤组有叁条条带表达下调,11条条带表达上调。树舌多糖GF可以使肿瘤细胞叁条表达下调的蛋白带和8条表达上调的蛋白带恢复正常。②在可溶性蛋白的2-DE中,肿瘤组得到101个蛋白质斑点,树舌多糖组得到85个斑点。仅在肿瘤组出现的蛋白质点有54个,仅在树舌多糖组出现的蛋白质点有38个,肿瘤组和树舌多糖组共有的蛋白质点中表达量相差两倍以上的点有14个。③肿瘤组抑癌基因PTEN的表达量明显低于树舌多糖组。④树舌多糖组MDM-2癌基因的表达量明显低于肿瘤组(P<0.01)。 结论:①小鼠HepA瘤细胞可溶性蛋白组分的表达状态与正常肝脏细胞存在差异。②树舌多糖GF可以影响小鼠HepA瘤细胞多种可溶性蛋白的表达。③树舌多糖GF可以显着增强小鼠HepA瘤细胞可溶性蛋白之一抑癌基因PTEN的表达,从而抑制肿瘤的生长。④树舌多糖GF可以降低小鼠HepA瘤细胞核蛋白MDM-2癌基因的表达。
滑雅娜, 鲁芙爱, 王永福[8]2019年在《HIF-1相关信号通路及其在自身免疫性疾病中作用》文中指出自身免疫性疾病(AID)是一类由自身抗原引起自身组织损伤的疾病。目前治疗AID仍以对症治疗和控制病情进展的药物为主,缺乏有效治疗措施,从而造成其致死率较高、治愈率较低的现状。因此对AID发病机制的详细阐明,在AID患者的临床及预后中都至关重要。许多研究表明缺氧诱导因子-1(HIF-1)参与AID的发病过程,本文将近年来关于HIF-1相关的信号通路及其在AID中作用的研究进展作一综述,以期为AID的临床治疗提供依据。
参考文献：
[1]. 血管内皮生长因子变异体基因的构建、表达及表达产物体内诱导自身抗体产生的研究[D]. 张聚良. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[2]. 卵巢上皮癌相关抗原的筛选、鉴定、血清学检测及抗原基因生物学功能的初步研究[D]. 阳志军. 广西医科大学. 2008
[3]. TIZ与卵巢癌关系的基因水平研究[D]. 赵冰冰. 广西医科大学. 2009
[4]. 食管癌癌前血清分子标志物的研究及应用[D]. 李江伟. 中国协和医科大学. 2005
[5]. 趋化素样因子1（CKLF1）在人动脉粥样硬化斑块组织中表达的研究[D]. 焦洋. 北京大学. 2008
[6]. 人TSHβ新剪接变体生物学特性探讨[D]. 刘春蓉. 天津医科大学. 2011
[7]. 树舌多糖GF对小鼠HepA瘤细胞可溶性蛋白质组及核蛋白MDM-2表达的影响[D]. 于赫. 黑龙江中医药大学. 2006
[8]. HIF-1相关信号通路及其在自身免疫性疾病中作用[J]. 滑雅娜, 鲁芙爱, 王永福. 中国免疫学杂志. 2019
标签：基础医学论文; 肿瘤论文; 血管内皮生长因子论文; 肿瘤相关抗原论文; 抗原表位论文; 细胞生长因子论文; 血清蛋白论文; 基因合成论文; 细胞转染论文; 癌症论文;